Metodologie per lo studio B. subtilis I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

I biofilm batterici sono importanti per la salute umana, in quanto proteggono i loro residenti batterici dagli insulti ambientali e dagli agenti antimicrobici. L'obiettivo di questa procedura è stato quello di sviluppare un sistema modello per valutare gli effetti degli inibitori di piccole molecole sulla formazione del biofilm. Questi metodi possono aiutare a stabilire un set di strumenti essenziali per il campo del biofilm per selezionare inibitori di piccole molecole che mirano specificamente alla formazione di biofilm.

Il vantaggio principale di queste metodologie è che partono da un quadro sperimentale coerente e robusto e forniscono informazioni quantitative e qualitative sul meccanismo d'azione degli inibitori specifici del biofilm. Sebbene questi metodi possano fornire informazioni sui biofilm di Bacillus subtilis, possono anche essere applicati ad altri batteri che formano biofilm, come Pseudomonas aeruginosa o il patogeno delle piante Xanthomonas citri. La microscopia elettronica a scansione può essere essenziale per analizzare l'effetto di piccole molecole sulla formazione del biofilm, perché consente l'osservazione della matrice extracellulare e fornisce una risoluzione a singola cellula.

Per iniziare, seleziona prima una singola colonia appropriata e trasferiscila in tre millilitri di brodo LB. Metti questa coltura starter in un'incubatrice vibrante per quattro ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, prelevare 1,5 millilitri di coltura starter e centrifugare per quattro minuti.

Rimuovere con cautela il surnatante, quindi risospendere il pellet in 1,5 millilitri di terreno MSgg. Per far crescere le pellicole, preparare una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti aggiungendo tre millilitri di MSgg a ciascun pozzetto. Ad alcuni di questi pozzetti, aggiungere MSgg con un inibitore di piccole molecole in un intervallo di concentrazione, distribuendo la posizione di diverse concentrazioni attorno alla capsula, per evitare effetti di bordo.

Misurare la densità ottica a 600 nanometri della coltura starter ri-sospesa. La cultura deve essere compresa tra 0,6 e uno. Questo è fondamentale per la robustezza del sistema.

Innoculare ogni pozzetto della piastra di coltura con 3 microlitri della coltura starter risospesa. Quindi, incubare la piastra a 23 gradi Celsius per tre giorni in condizioni statiche. Successivamente, rimuovere la piastra dall'incubatrice e osservare le pellicole.

Per far crescere i biofilm, utilizzare un modello e individuare simmetricamente quattro gocce separate da 1,5 microlitri di coltura starter non lavata su una piastra MSgg di agar 1,5% essiccata di 8,5 centimetri. Lasciare che le gocce si assorbano nel mezzo prima di spostare la piastra. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per tre giorni.

Utilizzando un binocolo con esposizione omogenea della luce, verificare che le colonie di biofilm si siano sviluppate e abbiano formato una struttura rugosa tridimensionale. Per prima cosa, prendi una lama di rasoio pulita e taglia le colonie di biofilm in due parti uguali con l'aiuto del modello. Sollevare con cautela una metà della colonia con una spatola pulita e trasferirla in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri, contenente 500 microlitri di PBS.

Prendi la seconda metà della colonia e trasferiscila in una provetta da microcentrifuga contenente 500 microlitri di etanolo al 50%. Questi saranno utilizzati per valutare la resistenza agli agenti sterilizzanti. Successivamente, allo stesso modo, prendi la prima metà della colonia trattata con D-lisina e mettila in PBS.

Quindi, prendi la seconda metà di questa colonia e trasferiscila in etanolo. Incubare tutte le provette contenenti le metà del biofilm per 10 minuti a temperatura ambiente. E poi, centrifugarli per cinque minuti a 18.000 volte g.

Utilizzando una pipetta, rimuovere con cautela il surnatante. Aggiungere 300 microlitri di PBS, quindi sonicare le cellule a bassa temperatura, con un sonicatore a micropunta. Aggiungere altri 700 microlitri di PBS per un volume finale di un millilitro.

Successivamente, eseguire una diluizione seriale di 10 rispetto ai sette negativi in PBS. Prelevare 100 microlitri di una delle diluizioni e inoculare una piastra Agar LB all'1,5%. Ripetere questo passaggio per altre due diluizioni per campione.

Stendere l'innoculo usando perle di vetro, quindi incubare le piastre per una notte a 30 gradi Celsius. Esamina le piastre e conta le unità formanti colonie, o CFU. Dopo aver calcolato il valore di CFU per millilitro, calcolare la percentuale di sopravvissuti nei trattamenti PBS rispetto a quelli con etanolo.

Per iniziare la fissazione del campione, preparare prima una quantità sufficiente di soluzione fissativa fresca per il numero desiderato di colonie di biofilm. Aggiungere con cautela cinque millilitri di fissativo a ciascuna capsula di Petri ed evitare di pipettare direttamente sulle colonie. Le colonie inizieranno a staccarsi dall'Agar e a galleggiare.

Sigillare accuratamente le piastre con parafilm e incubare su un agitatore rotante per due ore a temperatura ambiente. Trasferire le piastre a quattro gradi Celsius durante la notte. Rimuovere delicatamente il liquido fissativo con una pipetta Pasteur, collegata a un aspirapolvere.

Aggiungere 10 millilitri di cacodilato di sodio 100 nanomolari, cinque millimolari di tampone di cloruro di calcio per lavare il biofilm e incubare per cinque minuti. Staccare con cura il centro della colonia di biofilm dalla piastra di agar con una pipetta Pasteur. Per asciugare le colonie all'aria, tagliare la carta da filtro di cellulosa in quarti, quindi immergere una sezione in etanolo al 100%.

Trasferisci con cura una colonia di biofilm galleggiante sulla carta. Metti la carta in una capsula di Petri foderata con carta da filtro asciutta. Quindi, copri il piatto e lascialo asciugare in una cappa chimica per una notte.

Al fine di preservare la morfologia della colonia di biofilm, è importante stendere completamente il biofilm galleggiante con la carta di cellulosa. Una volta sulla carta, il biofilm non può essere regolato nuovamente. Rivestire un mozzicone di microscopia elettronica con nastro di carbonio, quindi utilizzare una pinzetta per trasferire con cura le colonie di biofilm sul troncone.

Dopo aver collegato ogni colonia al troncone, aggiungendo un sottile ponte di nastro di carbonio, conservare i tronconi in un essiccatore per 24 ore o fino al momento del bisogno. Questo passaggio richiede una mano ferma e precisa, perché in questa fase i biofilm sono molto fragili e si fratturano facilmente. La sfida consiste nel montare una parte sostanziale del biofilm senza crepe.

Il giorno dell'esame, posizionare le colonie in un rivestimento sputter oro-palladio. Rivestire i campioni per due minuti con un angolo di 60 gradi. Ripetere questo passaggio due volte, ruotando i campioni di 120 gradi tra loro.

Infine, rivestire i campioni una volta per tre minuti dall'alto. I campioni sono ora pronti per l'imaging sul SEM. Queste immagini mostrano la formazione pellicale di B.subtilis coltivato in terreno MSgg che induce biofilm.

Con l'aggiunta dell'inibitore della piccola molecola D-lisina, lo sviluppo della pellicola è ridotto. E all'aumentare della concentrazione dell'inibitore, la formazione di pellicole mostra una diminuzione correlata. Questo grafico mostra l'effetto dell'esposizione all'etanolo sulla sopravvivenza delle cellule all'interno di colonie di biofilm, trattate con un inibitore della D-lisina o non trattate.

Le colonie trattate con D-lisina ed esposte al 50% di etanolo per 10 minuti, hanno mostrato una drastica riduzione della sopravvivenza rispetto alla frazione non trattata. Le immagini binoculari dall'alto verso il basso mostrano che le colonie cresciute in presenza di D-lisina erano complessivamente più piccole e formavano rughe meno pronunciate rispetto a quelle non trattate. Le immagini al microscopio elettronico a scansione di colonie di biofilm essiccati in punti critici rivelano ulteriormente lo sviluppo alterato del biofilm.

La matrice di sostanze polimeriche extracellulari, o EPS, appariva più simile a una ragnatela nei campioni non trattati, con i campioni trattati che mostravano una minore organizzazione. Infine, l'esame della risoluzione delle singole cellule batteriche mostra che le cellule trattate hanno un aspetto allungato, meno ricoperte di EPS e non così strettamente connesse alle loro vicine come le cellule non trattate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la definizione di un quadro coerente per lo studio degli inibitori del biofilm è essenziale per ottenere risultati riproducibili.

Una volta padroneggiato, uno screening di piccole molecole per l'inibizione del biofilm può essere eseguito in meno di una settimana se eseguito correttamente. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come lo studio dell'espressione genica in singole cellule a biofilm, al fine di ottenere ulteriori informazioni sul bersaglio dell'inibitore di piccole molecole. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare l'effetto complessivo di specifici inibitori del biofilm sullo sviluppo del biofilm e sulla resistenza agli antibiotici.