Name: Metodologie per lo studio B. subtilis I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Scopri metodologie riproducibili per studiare gli inibitori del biofilm in Bacillus subtilis. Queste tecniche forniscono approfondimenti quantitativi e qualitativi sui meccanismi d'azione degli inibitori specifici.

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L'imaging al microscopio elettronico è stato condotto presso l'Unità di Microscopia Elettronica del Weizmann Institute of Science, supportata in parte dall'Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. Questa ricerca è stata supportata anche dalla sovvenzione ISF I-CORE 152/1, dai coniugi Dan Kane, dalla signora Lois Rosen, da una borsa di ricerca Yeda-Sela, dalla Larson Charitable Foundation, dal Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, dall'Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, dalla sovvenzione del Ministero della Salute per metodi di ricerca alternativi, e dalla Cooperazione Francia-Israele - Programma di Ricerca Maimonide-Israele. IKG ha ricevuto la cattedra per lo sviluppo della carriera Rowland e Sylvia.

1. valutare l&#39;effetto di piccole molecole inibitori sulla Pellicle e la formazione di biofilm Colony <ol><li> Preparare una soluzione di 2x definito medio MSgg biofilm che inducono 25 senza il cloruro di calcio e ferro (III) cloruro esaidrato. Dopo la sterilizzazione del filtro, aggiungere il cloruro di calcio. Il mezzo è pronto all&#39;uso direttamente oppure può essere conservato a 4 ° C al buio. </li><li> Preparare la diluizione 1x MSgg il giorno dell&#39;esperimento. <ol><li> Diluire il mezzo 2x MSgg a 1x con acqua distillata sterile (pellicole) o agar sterile 3% calda (80 ° C) (biofilm) e aggiungere ferro (III) cloruro esaidrato ad una concentrazione finale di 50 pM (pellicole) o 250 pM ( biofilm). Aggiungere antibiotici o piccole molecole inibitrici alla concentrazione desiderata e mescolare bene. Ad esempio, per ottenere una concentrazione finale di 0,5 mM D-leucina in 30 ml di stabilire pellicole o biofilm, aggiungere 196,6 ml di un 76,3 mM (10 mg / ml) di soluzione D-leucina. NOTE:. La composizione finale 1x MSgg sono descritte nella Tabella 1 Rispetto alla ricetta originale 25, il mezzo conteneva 50 ug / ml treonina e la concentrazione di ferro per crescere colonie biofilm su terreno solido MSgg stato aumentato 2.5x per ottimizzare la morfologia delle colonie rugosa . </li></ol></li><li> Dopo la solidificazione del agar, asciugare le piastre MSgg solidi in una cappa biologica per 30-45 minuti prima della inoculazione. </li><li> Per selezionare inibitori specifici che interferiscono con i meccanismi di formazione pellicola (figura 1), esclude che le concentrazioni utilizzate influenzano planctonici e crescita statica. <ol><li> Determinare crescita planktonic (aumento della densità ottica nel tempo in coltura liquida) in una curva di crescita semplice misurando la densità ottica a 600 nm ogni ora fino alla fase di crescita stazionaria. </li><li> Per confermare che la torbidità cultura misurata rappresenta conta di cellule vive, determinare il numero di unità formanti colonia (CFU)di cellule in fase di crescita planctonici da una coltura agitando dopo diversi punti temporali. </li><li> Per valutare l&#39;effetto di piccole molecole inibitrici sulla crescita pellicola statica, cellule raccolto alla fine di una incubazione di 3 giorni a 23 ° C da 24 pozzetti coltura cellulare e, inoculato nelle stesse condizioni come descritto nelle sezioni 1,7-1,9 e determinare la CFU. Per questo controllo, utilizzare un ceppo pellicola con deficit che manca i operoni che codificano per i componenti della matrice extracellulare (vale a dire, B. subtilis Δ epsH, Δ TASA). NOTA: Questo ceppo è in grado di crescere in condizioni statiche, ma a differenza di un ceppo selvatico pellicle-formatura, è carente nella capacità di galleggiare all&#39;interfaccia liquido-aria, la cui crescita è favorita a causa di un aumento dei livelli di ossigeno 26. Così, questo da matrice extracellulare e la tensione pellicola-carente è un ceppo di riferimento consigliato per valutare la crescita in condizioni statiche. NOTA: Per la specifica exampio del non canonica D-amino acido D-leucina descritte di seguito, un effetto sulla planctonici e la crescita statica a concentrazioni che interferivano con la formazione di pellicola è stato escluso 12,17. I metodi per determinare planctonici e crescita statica sono descritte in dettaglio 17. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" /> Figura 1. panoramica concettuale per l&#39;identificazione di un robusto apparato sperimentale per valutare l&#39;inibizione specifica della formazione di biofilm. I criteri di selezione per le piccole molecole inibitrici che indicano l&#39;interferenza specifico con la formazione di biofilm, senza effetto pronunciato sulla crescita planctonici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="5"><li> Streak fuori B. subtilis da un C magazzino -80 ° (LB culture di 10 9 cellule / ml congelati in glicerolo al 20%) per isolare singole colonie su una piastra di agar-% 1,5 LB con una punta sterile o un bastoncino applicatore. </li><li> Crescere notte a 30 ° C. </li><li> PUNTO CRITICO: Per una robusta inibizione pellicola dagli acidi non canonica D-amino come D-leucina, crescere una singola colonia prelevata dal% piastra di agar-1.5 LB in 3 ml brodo LB a 37 ° C per 4 ore in un agitazione incubatore (velocità di agitazione 200 rpm). Sostituire il brodo LB con il mezzo MSgg biofilm che inducono prima inoculazione mediante centrifugazione cultura 1,5 ml di avviamento per 4 min a 6.000 xg, rimuovere con attenzione il surnatante e ri-sospensione il pellet in 1,5 ml di mezzo MSgg. Il resto della coltura può essere scartato. Importante: Per garantire la robustezza del sistema, la densità ottica a 600 nm (OD 600) della coltura starter lavato dovrebbe essere compreso tra 0,6 e 1. </li><li> Durante la crescita della coltura starter, preparare un 12-pozzetti di coltura cellulare plate multidish contenentg 3 ml di terreno MSgg senza o con un intervallo di concentrazione della piccola molecola inibitore (ad esempio, 0,3, 0,5, 1 mM D-leucina 17). Per escludere effetti di bordo, distribuire la collocazione delle diverse concentrazioni di tutta la piastra multidish. In alternativa, utilizzare 24 pozzetti coltura cellulare piastre multidish contenente 1,5 ml di terreno MSgg. </li><li> Inoculare pozzetti della coltura cellulare piastra multidish 12 pozzetti con 3 ml di coltura starter lavato (1: 1.000 diluizione). NOTA: Un rapporto di diluizione inferiore, cioè, 1: 500 può essere utilizzato. Questo riduce il tempo di sviluppo delle pellicole. </li><li> Grow le pellicole a 23 ° C in condizioni statiche per tre giorni. Non spostare le pellicole durante questo tempo, in quanto può influenzare la morfologia superficiale finale della pellicola. </li><li> Acquisire le immagini con un&#39;esposizione binoculare e omogeneo di fulmini. In alternativa, fare una foto delle pellicole con una fotocamera ad alta risoluzione. Per evitare artefatti causati da inconsisangoli di luce tenda e ombre, scattare foto top-down con la telecamera fissa su un treppiede e utilizzare una fonte di luce morbida e grande a 45 ° da entrambi i lati. NOTA: Un metodo alternativo per studiare B. subtilis pluricellularità è il saggio colonia di biofilm su, terreno solido biofilm che inducono MSgg. Come pellicole, questo test permette lo studio dei processi spazio-temporali. Una volta che la gamma attiva delle piccole molecole inibitrici è determinata, il loro effetto sulla formazione di biofilm colonia può essere studiato. </li><li> Per crescere colonie biofilm, simmetricamente individuare 1,5 ml di non lavato precoltura (Passo 1.7) sul MSgg 1,5% agar essiccato con l&#39;aiuto di un modello - 4 gocce per Petri di 8,5 cm di diametro. Lasciate che le gocce adsorbono alla piastra prima di muoversi. NOTA: Il modello consente di ottenere una distribuzione uniforme delle colonie biofilm all&#39;interno della zona dove si coltivano le cellule. Per preparare il modello, disegnare l&#39;area totale della crescita su scale originali, dividerlo alla parità di settaors e marcare il centro. Per un giro Petri di 8,5 cm di diametro, questo assegna 14 centimetri 2 di una colonia biofilm. </li><li> Incubare le piastre a 30 ° C per tre giorni. Durante questo tempo, colonie biofilm sviluppano e formano un tridimensionale, struttura rugosa. </li><li> Scattare foto come al punto 1.11. </li></ol> 2. Etanolo Resistenza Assay <ol><li> Crescere biofilm come descritto ai punti 1,1-1,7 e 1.12-1.14. </li><li> Dopo 68 h di crescita a 30 ° C, tagliare le colonie biofilm in due parti uguali con l&#39;aiuto di una lama di rasoio e il modello. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" /> Figura 2. Esempio disegno sperimentale per valutare la resistenza delle cellule biofilm colonie di agenti sterilizzanti. (A) Template utilizzato per la distribuzione uniforme delle colonie biofilm attraverso una piastra di Petri e per il taglio. (B)immagini top-down non trattati wild-type biofilm coltivate per 68 h su terreno solido, definito biofilm che inducono MSgg a 30 ° C. L&#39;ingrandimento mostra come una colonia biofilm può essere tagliato in due metà uguali. (C) Le due metà uguali biofilm sono trattati allo stesso modo (il controllo, PBS) o sia con PBS o agente sterilizzante e trattati come descritto. Bar Scala:. 1 cm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="3"><li> Sollevare attentamente ciascuna metà della colonia biofilm dalla piastra di agar con una piccola spatola e spostarlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 500 ml di tampone fosfato salino (PBS). Se necessario, raschiare le cellule rimanenti dalla piastra e trasferirli provetta pure. NOTA: La seconda metà della colonia biofilm viene trattato differentemente, a seconda che esso è il controllo o per testare la resistenza alla steriAgenti Lizing. </li><li> Per il controllo, incubare la seconda metà della colonia biofilm in 500 microlitri di PBS come al punto 2.3. Per valutare la resistenza agli agenti sterilizzanti, trasferire la seconda metà della colonia biofilm a 500 microlitri 50% (v / v) etanolo. NOTA: sterilizzazione alternativo agenti come ipoclorito di sodio possono essere usati. Per tutti gli agenti sterilizzanti utilizzati, determinare il tempo di concentrazione e incubazione attiva in un esperimento preliminare. </li><li> Incubare le colonie biofilm per 10 min sul banco a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare le colonie biofilm per 5 min a 18.000 xg e rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta. Aggiungere 300 ml di PBS. </li><li> Sonicare cellule leggermente (ampiezza 10%, impulso 5 sec) con lo micropunte di un sonicatore. NOTA: L&#39;energia sonicazione deve essere sufficiente ad aggregati biofilm separati. Tuttavia, troppo dura sonicazione può lisi delle cellule. Confermare in anticipo al microscopio ottico che l&#39;energia sonicazioneutilizzati non lisare le cellule e che tutti gli aggregati sono dissolti. </li><li> Aggiungere 700 microlitri di PBS fino ad un volume finale di 1 ml. Eseguire una diluizione seriale (a 10 -7) in PBS e diffondere 100 ml di 3 diluizioni su una piastra di agar-% 1,5 LB utilizzando microsfere di vetro sterili. NOTA: Le diluizioni ottimali per essere placcato dovrebbe essere determinata in un esperimento preliminare, in quanto dipende dalla quantità di cellule nella colonia biofilm di interesse e il tasso di sopravvivenza delle cellule in risposta all&#39;agente sterilizzante. </li><li> Incubare le piastre notte a 30 ° C, contare il CFU e determinare CFU / ml. Dalla finale CFU / ml di ciascuna delle colonie mezzo biofilm, calcolare la percentuale di sopravvissuti. NOTA: Quando eseguito e analizzato come descritto, le due metà della colonia di controllo biofilm e trattata contro etanolo trattata la metà della colonia biofilm greggia dovrebbe produrre differenze inferiori al 10% della conta delle cellule vitali, verificando la simmetria o la resistenza della colonia , faucibusctively. In alternativa, i risultati possono essere rappresentati in totale CFU. I conteggi di cellule di controllo e non trattato colonia biofilm dovrebbero rimanere nello stesso ordine di grandezza. Al contrario, i conteggi cellulari del mezzo etanolo trattata di una piccola molecola biofilm colonia trattati dovrebbero scendere da un minimo di due ordini di grandezza la rivendicazione per una maggiore sensibilità all&#39;agente sterilizzante. </li></ol> 3. biofilm Colony Preparazione del campione per la microscopia elettronica a scansione <ol><li> Crescere colonie biofilm come descritto nei passaggi 1,1-1,7 e 1.12-1.14. </li><li> Preparare una serie fresca di 2% (v / v) glutaraldeide, 3% (v / v) di paraformaldeide in 100 mM cacodilato di sodio, 5 mM di tampone di cloruro di calcio, pH 7.3. Preparare 5 ml di fissativo per ogni capsula di Petri di 8,5 cm di diametro. ATTENZIONE: glutaraldeide e paraformaldeide sono pericolosi. li maneggiare con dispositivi di sicurezza all&#39;interno di una cappa chimica. Eliminare le soluzioni ed i materiali contaminati al hazrifiuti ardous. </li><li> Aggiungere con cautela il fissativo alle colonie biofilm, senza l&#39;erogazione direttamente sulla parte superiore dei biofilm. NOTA: A causa del carattere idrofobico della colonia biofilm, le colonie staccano lentamente dalla agar ed iniziano a galleggiare. </li><li> sigillare accuratamente le piastre con una striscia di Parafilm. Incubare su un agitatore rotante per 2 ore a temperatura ambiente e successivamente trasferire le piastre a 4 ° C per una notte. </li><li> Il giorno successivo, rimuovere con cautela il liquido con una pipetta Pasteur di vetro collegato ad una pompa a vuoto. </li><li> Aggiungere con cautela 10 ml 100 mM cacodilato di sodio, 5 mM di tampone cloruro di calcio per lavare il biofilm e incubare per 5 min. Rimuovere delicatamente il liquido con la pipetta Pasteur di vetro da un angolo del piatto per evitare di danneggiare il biofilm e aggiungere la soluzione di lavaggio fresca delicatamente pipettando. Ripetere questa operazione una sola volta. </li><li> Per la disidratazione delle colonie biofilm, procedere con le seguenti operazioni: 2 x 5 min in DDH 2 O; 2x 20 min a 30% di etanolo; 2x 20 min in etanolo al 50%; 2x 20 min in etanolo al 70%; 2x 20 min in etanolo al 96%; 2x 30 min a 100% di etanolo. <ol><li> Aggiungere 15 ml di liquido per ogni piatto Petri di 8,5 cm di diametro in ogni passo e rimuovere il liquido accuratamente dopo ogni incubazione. </li></ol></li><li> Utilizzare uno dei due metodi differenti per asciugare i campioni da etanolo. <ol><li> Per l&#39;aria di essiccazione da etanolo: <ol><li> Tagliare un filtro di carta di cellulosa (diametro di 9 cm) in quarti. Brevemente immergere un quarto in 100% di etanolo, e poi trasferire con cura uno galleggiante biofilm colonia su di esso. Mettere la carta da filtro bagnata in una capsula di Petri foderato con carta da filtro. Coprire la piastra di Petri e lasciare che le colonie biofilm asciugare per una notte in una cappa chimica. </li></ol></li><li> Per punto critico (CP) -Essiccazione utilizzando anidride carbonica (CO 2) come fluido di transizione: <ol><li> Riempire il 75% della camera di critica macchina a punti di asciugatura con etanolo al 100%. Trasferire i campioni in un supporto, ogni campione nel proprio cHamber. Se necessario, tagliare il biofilm con le forbici in piccoli pezzi. Lasciare i campioni immersi in etanolo durante tutte le manipolazioni. Quindi, trasferire il supporto nella camera e chiudere la camera ermeticamente. </li><li> Raffreddare la camera al 7 ° C e iniziare a mescolare. Riempire la camera completamente con CO 2 liquida. Nel corso di un periodo di incubazione 7 min, lasciare che la miscela di etanolo con la CO 2. Poi, scarico 25% della soluzione. NOTA: Non svuotare la camera di sotto del livello del campione. </li><li> Ripetere il punto 3.8.2.2 quattro volte. </li><li> Ripetere il punto 3.8.2.2 cinque volte con un tempo di incubazione di soli 5 min. Infine, l&#39;etanolo dovrebbe essere completamente sostituita da CO 2. </li><li> Durante l&#39;ultimo giro, vuoto solo il 5% della camera. Spegnere l&#39;agitazione e il raffreddamento. Avviare riscaldamento della camera a 42 ° C. Ad una temperatura di 31,1 ° C e una pressione di 73,9 bar, il liquido CO 2 raggiunge il suo punto critico, lo stato in cui il ph gassosaase ha la stessa densità della fase liquida del solvente 27. Quando la temperatura raggiunge 42 ° C, incubare per 10 min. A 42 ° C, la CO 2 nella camera esiste come gas supercritico. NOTA: controllare costantemente la pressione della camera. La pressione non deve superare i 120 bar a 42 ° C. </li><li> Iniziare a rilasciare lentamente il gas con riscaldamento continuo. Ciò mantiene i campioni nella fase CO 2 -Gas e impedisce la deformazione della morfologia campione attraverso la tensione superficiale del liquido. Impostare il misuratore di portata a 5 l / h per la messa a punto la valvola di dosaggio che controlla il misuratore di portata. Attendere fino al rilascio del tutto la pressione nella camera. Ora aprire la camera e rimuovere i campioni con cautela dal supporto. </li></ol></li></ol></li><li> Coat un microscopio elettronico a stub con nastro di carbonio. Con l&#39;aiuto di pinzette, trasferire accuratamente le colonie biofilm sul stub. Collegare ogni colonia allo stub con l&#39;aggiunta di un sottile ponte da autonastro bon, che è cruciale per l&#39;eliminazione carica sotto il fascio di elettroni. In questa fase, gestire le colonie biofilm con cura in quanto sono molto fragili. Conservare i campioni in un essiccatore per almeno 24 ore o fino esame. </li><li> Il giorno dell&#39;esame con il microscopio elettronico a scansione, le colonie biofilm per 2 minuti per polverizzazione catodica-coat in un angolo di 60 ° in un oro-palladio polverizzazione-dispositivo a induzione. Ripetere questa operazione due volte e ruotare i campioni di 120 ° in mezzo. Alla fine, i campioni sputter-coat volta per 3 min dall&#39;alto. Il sottile strato di 20 nm di oro-palladio migliora la conducibilità e migliora il contrasto del campione per l&#39;imaging SEM. </li><li> Conservare i campioni in un essiccatore per evitare la reidratazione del campione 28 fino l&#39;imaging con un microscopio elettronico a scansione 29,30. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Bacillus subtilis forme robuste e altamente strutturati biofilm sia a liquido (pellicole) e su terreno solido (colonie). Quindi, serve come organismo modello ideale per caratterizzare la modalità d&#39;azione degli inibitori specifici biofilm. Il supporto solido, cellule formano strutture multicellulari con caratteristiche distintive che non sono evidenti in pellicole, come rughe irradiano dal centro verso il bordo. Così, pellicole e le colonie sono sistemi complementari per lo studio B. subtilis pluri...

comunità batteriche multi-cellulari giocano un ruolo significativo in ambienti naturali e antropici, e può essere utile o altamente deleterio. Queste colonie multicellulari sono noti come biofilm, in cui le singole celle sono incorporate in una matrice sostanze polimeriche extracellulari autoprodotti (EPS). L&#39;EPS aderiscono fortemente le cellule alla superficie colonizzano. Essi servono come scudo contro le forze meccaniche e chimiche e creano stretto contatto tra cellule vicine, facilitando comunicazione cellulare 1. Un biofilm può essere visto come una comunità differenziate, in cui le cellule uso altamente regolati, orchestrato processi per coordinare le loro attività all&#39;interno della comunità, così come tra le specie 2-5. Il passaggio da un planctoniche, modalità di vita libera di crescita a uno stato biofilm è spesso associata a processi di sviluppo. Un buon esempio è il Bacillus subtilis batterio del suolo Gram-positivi, e quindi un undómëceppo sticated serve come un modello robusto organismo per studiare le fasi di sviluppo che portano alla formazione di biofilm. In questo batterio, cellule mobili si organizzano in strutture multicellulari cospicui che svolgono mansioni specializzate 4. Un gruppo di cellule, la matrice-produttori secernono esopolisaccaridi 6, la proteina amiloide ATAS 7,8, e la proteina di superficie hydrophobicity BSLA 9,10; ognuno dei quali partecipare all&#39;Assemblea degli EPS 11-13. Data l&#39;abbondanza di biofilm in nicchie naturali e antropici e il danno fatale putativo possono causare, vi è un urgente bisogno di trovare modi per prevenire la loro formazione. Gli inibitori di piccole molecole in grado di aiutare nella scoperta di nuovi percorsi normativi, enzimi e proteine ​​strutturali coinvolte nella formazione di biofilm, e, quindi, di promuovere approfondimenti nei complessi processi di assemblaggio comunità multicellulare. Come B. subtilis è un modello ben studiato per la biofilmazione 14,15, può essere utilizzato per valutare gli effetti di vari inibitori biofilm. Questo studio affronta quattro metodi fondamentali che sono fondamentali per la valutazione della risposta dei biofilm a piccole molecole inibitrici. Innanzitutto, per garantire che questi inibitori hanno un obiettivo specifico biofilm, la separazione degli effetti sulla crescita planctonici dall&#39;effetto sulla formazione del biofilm è critica. La maggior parte degli agenti antibatterici colpire le cellule nella loro fase di crescita planctonici, ma le molecole che hanno come target lo stile di vita biofilm sono rari. Inoltre, come le molecole che non influenzano la crescita planctonici non sono tossici, possono ridurre la pressione selettiva che favorisce i mutanti resistenti agli antibiotici 16. Per esempio, quando biofilm sono trattati con D-amminoacidi o alcune altre molecole parete cellulare interferente, o sono disturbati o smontati, ma questi inibitori riguardano solo lievemente planktonic 12,17 crescita. Al contrario, molti antibiotici alterano drammaticamente la crescita planctonici, con little o nessun effetto sulla formazione di biofilm 17. In secondo luogo, che stabilisce un quadro sperimentale consistente e robusto per studiare l&#39;effetto delle piccole molecole è fondamentale. Abbiamo osservato che l&#39;intervallo di concentrazione attiva delle piccole molecole inibitrici era sensibile alle condizioni pre-coltura e alla configurazione sperimentale utilizzato per studiare l&#39;effetto di queste piccole molecole inibitrici. Diversi rapporti, in particolare quelli che studiano B. subtilis, rivelato variazioni nell&#39;intervallo di concentrazione in cui D-amminoacidi inibiscono la formazione di pellicole - i galleggianti biofilm batterici 12,17-19. I risultati qui presentati indicano che i seguenti fattori rappresentano differenze nella gamma di concentrazione attiva: le condizioni di pre-coltura (logaritmica 12,17 contro fase tardo-stazionaria 20 di crescita), il terreno di coltura utilizzato nella condizione di pre-cultura (ricco, indefinita [Luria Broth, LB] contro definito [glutammato monosodico-glycerol, MSgg]), il rapporto di inoculazione e soprattutto la rimozione del mezzo di precoltura prima dell&#39;inoculo. La temperatura di crescita pellicola statica mostrato un ruolo meno importante nella gamma attività della piccola molecola inibitore D-leucina, acido rappresentante D-amino utilizzato in questo studio. Infine, una volta che i biofilm sono trattati con inibitori biofilm specifici, metodi robusti e informativi sono necessari per caratterizzare gli effetti di questi inibitori sui biofilm fitness. Qui, due metodi per caratterizzare in modo indipendente l&#39;effetto di piccole molecole inibitrici sono descritte in dettaglio: (1) L&#39;effetto sulla singole celle all&#39;interno di una colonia di biofilm e la loro resistenza agli agenti antimicrobici. Le cellule in biofilm sono in genere più resistenti agli antibiotici rispetto ai batteri a vita libera 21-23. Mentre questo fenomeno è multifattoriale, la capacità dell&#39;EPS per ridurre la penetrazione antibiotico è spesso considerata come una spiegazione attraente 24 </sup&gt;. Questo metodo valuta la sopravvivenza delle cellule biofilm prestabiliti dopo l&#39;esposizione a sostanze antibatteriche. (2) L&#39;effetto sull&#39;architettura biofilm colonia, dalla grande alla piccola scala. colonie Biofilm sono caratterizzati dalla loro struttura tridimensionale e la presenza di EPS. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, cambiamenti nella morfologia cellulare, struttura colonia biofilm e l&#39;architettura e l&#39;abbondanza dei EPS possono essere visualizzati dal grande (mm) alla piccola scala (micron).

<table><tbody><tr><td>Luria Brodo, Lennox</td><td>Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>fosfato di potassio monobasico&nbsp;</td><td>Sigma, 136,09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>fosfato di potassio bibasico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, 174,18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>acido propansolfonico 3-(N-morpholino)</td>Fisher <td>Scientific, 209,27 g/mol</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di magnesio esaidrato&nbsp;</td><td>Merck, 203,30 g/mol&nbsp;</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio anidro</td><td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di manganese(II) tetraidrato</td><td>Sigma, 197.91 g/mol</td><td>31422-250G-R</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di ferro (III) esaidrato&nbsp;</td><td>Sigma, 270,30 g/mo)</td><td>F2877-500G</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di zinco anidro</td><td>Acros Organics, 136,29 g/mol</td><td>424592500</td><td></td></tr><tr><td>tiamina cloridrato</td><td>Sigma, 337,27 g/mol</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-triptofano</td><td>Fisher Scientific, 204,1 g/mol</td><td>BP395-100</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>Sigma, 165,19 g/mol</td><td>P5482-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma, 119,12 g/mol</td><td>T8625-100G</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo anidro</td><td>Bio-Lab Itd 712022300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acido L-glutammico sali monosodici idrato&nbsp;</td><td>Sigma, 169,11 g/mol</td><td>G1626-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-leucina</td><td>Sigma, 169,11 g/mol</td><td>8555448-10G</td><td></td></tr><tr><td>etanolo anidro</td><td>Gadot</td><td>830000054</td><td></td></tr><tr><td>lama di rasoio</td><td>Eddison</td><td>NA</td><td></td></tr> carte <tr><td>da filtro circolari in cellulosa</td><td>Whatman, 90 mm</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldeide</td><td>EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in acqua</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide&nbsp;</td><td>EMS, 16% in acqua</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>cacodilato di sodio</td><td>Merck, 214,05 g/mol&nbsp;</td><td>8.2067</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio 2-idrato</td><td>Merck, 147.02 g/mol&nbsp;</td><td></td><td></td>1172113</tr><tr><td>stub-alluminio montatura</td><td>EMS, testa scanalata</td><td>75230</td><td></td></tr><tr><td>nastro adesivo al carbonio</td><td>EMS</td><td>77825-12</td><td></td></tr><tr><td>Shaker 37 &deg; C</td><td>New Brunswick Scientific Innowa42</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>da tavolo Eppendorf centrifuga 5424</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sonificatore digitale, modello 250, utilizzato con incubatore a doppia punta Microtip</td><td>Branson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>30 &deg; C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore 23 gradi C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Filter System, 500 ml, polistirene</td><td>Cornig Incorporated</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td><td>Boekel</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>S150 Sputter Coater&nbsp;</td><td>Edwards</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Essiccatore a punti critici</td><td>BAL-TEC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione ambientale</td><td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologie per lo studio<em&gt; b. subtilis</em&gt; i biofilm come modello per caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Questo lavoro valuta diverse metodologie per studiare l'impatto degli inibitori del biofilm di piccole molecole, come i D-amminoacidi, sullo sviluppo e la resilienza dei biofilm di Bacillus subtilis. In primo luogo, vengono presentati metodi che selezionano inibitori di piccole molecole con bersagli specifici del biofilm al fine di separare l'effetto degli inibitori di piccole molecole sulla crescita planctonica dal loro effetto sulla formazione del biofilm. Successivamente, ci concentriamo su come le condizioni di inoculazione influenzano la sensibilità delle colture multicellulari e fluttuanti di B. subtilis agli inibitori di piccole molecole. I risultati suggeriscono che le discrepanze negli effetti riportati di tali inibitori come i D-amminoacidi sono dovute a condizioni pre-coltura incoerenti. Inoltre, viene descritto un protocollo di recente sviluppo per valutare il contributo dei trattamenti con piccole molecole verso la resistenza del biofilm alle sostanze antibatteriche. Infine, vengono presentate le tecniche di microscopia elettronica a scansione (SEM) per analizzare la disposizione spaziale tridimensionale delle cellule e della matrice extracellulare circostante in un biofilm di B. subtilis. Il SEM facilita la comprensione dell'architettura tridimensionale del biofilm e della struttura della matrice. Una combinazione dei metodi qui descritti può essere di grande aiuto per lo studio dello sviluppo del biofilm in presenza e assenza di inibitori del biofilm e far luce sul meccanismo d'azione di questi inibitori.

Il saggio pellicle è un metodo per studiare i processi altamente regolamentati e dinamici di B. subtilis pluricellularità. Oltre a questo, il saggio pellicle è adatto per testare una serie di condizioni sia di pre-avviamento o concentrazioni molecola di piccole dimensioni in un piatto multidish singola cella-cultura in un esperimento. Tuttavia, B. subtilis formazione pellicle è sensibile alle condizioni pre-coltura (ad esempio, crescita media del pre-coltura e la sua fase di crescita), il rapp...

Questo studio presenta lo sviluppo di metodologie riproducibili per studiare gli inibitori del biofilm e i loro effetti sulla multicellularità del Bacillus subtilis.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

I biofilm batterici sono importanti per la salute umana, in quanto proteggono i batteri residenti da agenti ambientali dannosi e da agenti antimicrobici. L'obiettivo di questa procedura era sviluppare un sistema modello per valutare gli effetti di inibitori a basso peso molecolare sulla formazione dei biofilm. Questi metodi possono contribuire a stabilire un insieme di strumenti essenziali per il settore dei biofilm, al fine di selezionare inibitori a basso peso molecolare che agiscano specificamente sulla formazione del biofilm.Il principale vantaggio di queste metodologie è che partono da un quadro sperimentale solido e coerente, fornendo informazioni quantitative e qualitative sul meccanismo d'azione degli inibitori specifici per i biofilm. Sebbene questi metodi possano offrire spunti utili per lo studio dei biofilm di Bacillus subtilis, possono essere applicati anche ad altri batteri formatori di biofilm, come Pseudomonas aeruginosa o il patogeno vegetale Xanthomonas citri. La microscopia elettronica a scansione può essere fondamentale per analizzare l'effetto di piccole molecole sulla formazione del biofilm, poiché consente l'osservazione della matrice extracellulare e offre una risoluzione a livello di singola cellula.Per iniziare, selezionare innanzitutto una colonia singola appropriata e trasferirla in tre millilitri di brodo LB. Collocare questa coltura di partenza in un incubatore agitato per quattro ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, prelevare 1,5 millilitri della coltura di partenza e centrifugare per quattro minuti.Rimuovere con attenzione il soprannatante, quindi risospendere il pellet in 1,5 millilitri di mezzo MSgg. Per coltivare i pellicoli, preparare una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti aggiungendo tre millilitri di MSgg in ciascun pozzetto. In alcuni di questi pozzetti, aggiungere MSgg contenente un inibitore a piccola molecola in un intervallo di concentrazioni, distribuendo le diverse concentrazioni in posizioni diverse all'interno della piastra, per evitare effetti di bordo.Misurare la densità ottica a 600 nanometri della coltura iniziale ri-sospesa. La coltura dovrebbe essere compresa tra 0,6 e 1. Questo è fondamentale per la robustezza del sistema.Inoculare ogni pozzetto della piastra di coltura con 3 microlitri della coltura starter ri-sospesa. Successivamente, incubare la piastra a 23 gradi Celsius per tre giorni in condizioni statiche. Dopo questo periodo, rimuovere la piastra dall'incubatore ed osservare le pellicole.Per coltivare i biofilm, utilizzare un template e posizionare simmetricamente quattro gocce separate da 1,5 microlitri di coltura iniziale non lavata su una piastra di Agar MSgg al 1,5% essiccata da 8,5 centimetri. Lasciare assorbire le gocce nel mezzo prima di spostare la piastra. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per tre giorni.Utilizzando un binocolo con illuminazione omogenea, verificare che le colonie di biofilm si siano sviluppate e abbiano formato una struttura tridimensionale rugosa. Prendere innanzitutto una lametta pulita e tagliare le colonie di biofilm in due parti uguali con l'aiuto del modello. Sollevare con attenzione una metà della colonia con una spatola pulita e trasferirla in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri, contenente 500 microlitri di PBS.Prendere la seconda metà della colonia e trasferirla in una provetta per microcentrifuga contenente 500 microlitri di etanolo al 50%. Queste verranno utilizzate per valutare la resistenza agli agenti sterilizzanti. Successivamente, prendere in modo analogo la prima metà della colonia trattata con D-lisina e collocarla nel PBS.Quindi, prendere la seconda metà di questa colonia e trasferirla nell'etanolo. Incubare tutti i tubi contenenti le metà del biofilm per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, centrifugare per cinque minuti a 18.000 ×g.Utilizzando una pipetta, rimuovere con attenzione il soprannatante. Aggiungere 300 microlitri di PBS, quindi sottoporre le cellule a sonificazione con un sonicator a microsonda impostato su un livello basso. Aggiungere ulteriori 700 microlitri di PBS per ottenere un volume finale di un millilitro.Successivamente, eseguire una diluizione seriale di 10 alla meno sette in PBS. Prelevare 100 microlitri di una delle diluizioni ed inoculare una piastra LB in agar al 1,5%. Ripetere questo passaggio per altre due diluizioni per ogni campione.Stendere l'inoculo utilizzando perline di vetro e quindi incubare le piastre durante la notte a 30 gradi Celsius. Esaminare le piastre e contare le unità formanti colonie, o CFU. Dopo aver calcolato il valore di CFU per millilitro, calcolare la percentuale di sopravvissuti nei trattamenti con PBS rispetto a quelli con etanolo.Per iniziare la fissazione del campione, preparare innanzitutto una quantità sufficiente di soluzione fissativa fresca per il numero desiderato di colonie di biofilm. Aggiungere con attenzione cinque millilitri di fissativo in ciascuna piastra di Petri, evitando di pipettare direttamente sulle colonie. Le colonie inizieranno a staccarsi dall'agar e a galleggiare.Sigillare attentamente le piastre con parafilm e incubare su un agitatore rotatorio per due ore a temperatura ambiente. Trasferire le piastre in conservazione a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Rimuovere delicatamente il liquido fissativo con una pipetta di Pasteur collegata a un vuoto.Aggiungere 10 millilitri di cacodilato di sodio 100 nanomolare, tampone di cloruro di calcio 5 millimolare per lavare il biofilm, e incubare per cinque minuti. Staccare con attenzione il centro della colonia del biofilm dalla piastra di Agar con una pipetta di Pasteur. Per essiccare all'aria le colonie, tagliare la carta filtro di cellulosa in quattro parti, quindi immergere una sezione in etanolo al 100%.Trasferire con attenzione una colonia di biofilm galleggiante sul foglio di carta. Posizionare la carta in una piastra di Petri foderata con carta filtrante asciutta. Quindi, coprire la piastra e lasciarla nell'armadio chimico a essiccare per tutta la notte.Per preservare la morfologia della colonia del biofilm, è importante sottoporre completamente il biofilm galleggiante con la carta di cellulosa. Una volta posizionato sulla carta, il biofilm non può essere riaggiustato. Rivestire un portacampioni per microscopia elettronica con nastro di carbonio, quindi utilizzare pinzette per trasferire con cura le colonie di biofilm sul portacampioni.Dopo aver collegato ciascuna colonia al supporto, aggiungendo un sottile ponte di nastro conduttivo in carbonio, conservare i supporti in un essiccatore per 24 ore o fino al momento dell'utilizzo. Questo passaggio richiede una mano ferma e precisa, poiché a questo stadio i biofilm sono molto fragili e si rompono facilmente. La difficoltà consiste nel fissare una porzione consistente del biofilm senza creare crepe.Nel giorno dell'esame, posizionare le colonie in un rivestitore a sputtering oro-palladio. Rivestire i campioni per due minuti a un angolo di 60 gradi. Ripetere questo passaggio due volte, ruotando i campioni di 120 gradi tra un passaggio e l'altro.Infine, ricoprire i campioni una volta per tre minuti dalla parte superiore. I campioni sono ora pronti per l'analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM). Queste immagini mostrano la formazione del pellicolo di B.subtilis coltivato in mezzo MSgg induttore di biofilm.Con l'aggiunta dell'inibitore a molecola piccola D-lisina, lo sviluppo del pellicolo è ridotto. E all'aumentare della concentrazione dell'inibitore, la formazione del pellicolo mostra una corrispondente diminuzione. Questo grafico mostra l'effetto dell'esposizione all'etanolo sulla sopravvivenza delle cellule all'interno di colonie biofilmiche, trattate con un inibitore di D-lisina o lasciate non trattate.Le colonie trattate con D-lisina ed esposte a etanolo al 50% per 10 minuti hanno mostrato una riduzione drammatica della sopravvivenza rispetto alla frazione non trattata. Le immagini binoculari dall'alto rivelano che le colonie cresciute in presenza di D-lisina erano complessivamente più piccole e formavano grinze meno pronunciate rispetto a quelle lasciate non trattate. Le immagini ottenute al microscopio elettronico a scansione di colonie di biofilm essiccate mediante punto critico mostrano ulteriori alterazioni nello sviluppo del biofilm.La matrice di sostanze polimeriche extracellulari, o EPS, appariva più simile a una ragnatela nei campioni non trattati, mentre nei campioni trattati mostrava una minore organizzazione. Infine, l'esame a risoluzione di singole cellule batteriche mostra che le cellule trattate appaiono allungate, meno ricoperte da EPS e meno strettamente connesse ai loro vicini rispetto alle cellule non trattate. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che stabilire un quadro coerente per lo studio degli inibitori dei biofilm è essenziale per ottenere risultati riproducibili.Una volta padroneggiato, un test di screening di piccole molecole per l'inibizione dei biofilm può essere completato in meno di una settimana, se eseguito correttamente. Seguendo questa procedura, altri metodi, come lo studio dell'espressione genica in singole cellule del biofilm, possono essere effettuati al fine di ottenere ulteriori informazioni sul bersaglio dell'inibitore a piccola molecola. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come analizzare l'effetto complessivo di specifici inibitori del biofilm sullo sviluppo del biofilm e sulla resistenza agli antibiotici.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Tay, S. B., et al. Interruzione antivirulenta dei biofilm patogeni tramite lattonasi ingegnerizzate che stingono il quorum.  J. Vis. Esp. (2016)Il video mostra un metodo per quantificare la biomassa di biofilm in un batterio patogeno, confrontando controlli non trattati con campioni trattati con un enzima quorum-quenching. L'enzima interrompe la segnalazione batterica durante l'incubazione precoce, riducendo l'adesione cellulare. Dopo il lavaggio e un'ulteriore incubazione, i pozzi di...

Quantificazione della soppressione del biofilm indotta da enzimi nei batteri patogeni

Fonte: Tay, S. B., et.al. Interruzione antivirulenta dei biofilm patogeni tramite lattonasi ingegnerizzate che stingono il quorum.  J. Vis. Esp. (2016)Questo video dimostra il processo di inibizione della formazione di biofilm introducendo un enzima che interrompe la segnalazione cellulare batterica. L'enzima impedisce ai batteri di produrre sostanze polimeriche extracellulari, riducendo così lo sviluppo di biofilm su un micropiatto con fondo di vetro. Infine, la struttura del biofilm viene...

Valutazione microscopica dell'inibizione enzimatica della formazione di biofilm mediata dagli enzimi

Fonte: Bucher, T., et al. Metodologie per lo studio dei biofilm di B. subtilis come modello per caratterizzare inibitori di biofilm di piccole molecole. J. Vis. Esp. (2016)Questo video mostra un saggio di formazione di pellicole utilizzando Bacillus subtilis per valutare inibitori di piccole molecole che interrompono la sintesi della matrice e lo sviluppo di biofilm, fornendo un modello per selezionare composti che inibiscono selettivamente la crescita associata alla superficie senza...

Valutazione degli effetti inibitori sulla formazione delle pellicole in Bacillus subtilis

Fonte: Bucher, T., et al. Metodologie per lo studio dei biofilm di B. subtilis come modello per caratterizzare inibitori di biofilm di piccole molecole. J. Vis. Esp. (2016).Questo video dimostra come l'integrità della matrice dei biofilm influenzi la resistenza batterica all'etanolo confrontando le unità formative di colonie in biofilm non trattati e interrotti da inibitori. La riduzione delle CFU nei campioni trattati con inibitori dimostra che la matrice extracellulare è essenziale per...

Test sulla resistenza all'etanolo per valutare l'integrità della matrice del biofilm

Fonte: Bucher, T., et al., Metodologie per lo studio dei biofilm di B. subtilis come modello per caratterizzare inibitori di biofilm a piccole molecole. J. Vis. Esp.(2016)Questo video dimostra la preparazione di colonie mature di biofilm batterici per l'imaging ad alta risoluzione. Comprende le fasi di fissazione, disidratazione, montaggio e rivestimento metallico per preservare e visualizzare la morfologia del biofilm.

Preparazione delle colonie di biofilm batterici per l'analisi morfologica

Il video mostra un saggio di dispersione di biofilm utilizzando una piastra multi-pozzetto. Il trattamento con tampone e glucosio smonta il biofilm, rilasciando batteri, mentre i sali biliari inducono stress, trattenendo i batteri nella sostanza polimerica extracellulare protettiva. Una maggiore dispersione con tampone e glucosio conferma il successo del disassemblaggio del biofilm, stimato dalla misurazione delle unità formanti colonie.

Rilevamento del disassemblaggio del biofilm attraverso un saggio di dispersione

La maggior parte delle infezioni batteriche produce un biofilm. In virtù del loro ambiente, i batteri associati al biofilm sono spesso fenotipicamente resistenti ai farmaci. Le nuove molecole antibatteriche che uccidono i batteri nei biofilm sono quindi una priorità assoluta. Stabiliamo un test per lo screening rapido di composti antimicrobici efficaci nell'eradicazione dei biofilm.

Targeting biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso resazurina base Assay farmaco-sensibilità

Le infezioni da biofilm mostrano un'alta tolleranza alla chemioterapia. Nessun singolo test è in grado di catturare la complessità dei biofilm. Invece, sono necessari saggi complementari. Presentiamo una piattaforma di screening (sviluppata per S. aureus) che combina saggi di vitalità, biomassa e matrice di biofilm. Consente la scoperta di farmaci anti-biofilm, compresa la valutazione degli effetti chemioterapici a lungo termine.

Una piattaforma di test anti-biofilm Adatto per l&#39;esplorazione del Biblioteche composto naturale

I prodotti naturali rappresentano punti di partenza promettenti per lo sviluppo di nuovi farmaci e agenti terapeutici. Tuttavia, a causa dell'elevata diversità chimica, trovare nuovi composti terapeutici dalle piante è un compito impegnativo e dispendioso in termini di tempo. Descriviamo un approccio semplificato per identificare molecole antimicrobiche e antibiofilm da estratti e frazioni vegetali.

Approccio sistematico per identificare nuove molecole antimicrobiche e antibiofilm dagli estratti e dalle frazioni delle piante per prevenire la carie dentale

Questo protocollo presenta la metodologia per eseguire misurazioni della crescita del biofilm e della biomassa utilizzando dispositivi PCR-plate a pozzo profondo autoassemblati per lo screening statico del biofilm a coperchio ancorato a 96 pozzetti ad alta produttività.

Generazione di biomassa di biofilm batterico maggiore utilizzando dispositivi a micropiastra profonda a piastra PCR

Questo protocollo descrive un approccio che combina metodi statici e dinamici per valutare l'efficacia dei perossiacidi organici per l'eradicazione dei biofilm nell'industria lattiero-casearia. Questo approccio può anche essere utilizzato per testare l'efficacia di nuove formulazioni biologiche o chimiche per il controllo dei biofilm.

Valutazione dell'efficacia dei perossiacidi organici per l'eradicazione dei biofilm lattiero-caseari utilizzando un approccio che combina metodi statici e dinamici

Scopri metodologie riproducibili per studiare gli inibitori del biofilm in Bacillus subtilis. Queste tecniche forniscono approfondimenti quantitativi e qualitativi sui meccanismi d'azione degli inibitori specifici.

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