Name: La definizione del substrato Specificità per lipasi e fosfolipasi candidati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Scopri un protocollo computazionale per ottimizzare l'attività di lipasi e fosfolipasi e identificare i loro substrati naturali. Questo metodo accelera la comprensione dei ruoli fisiologici degli enzimi nel metabolismo lipidico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-Messico (CONACYT-Messico) (82614, 153998, 253549, e 178.359 in Investigación Científica Básica e 118 in Investigación en Fronteras de la Ciencia) e dalla Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM DGAPA-; PAPIIT IN202616, IN203612).

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger%2C+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger, Principles of Biochemistry</a>. , W. H. Freeman and Company. New York. (2013).</li>
<li>Jaeger, K. E., Eggert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipases+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lipases for biotechnology.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).</li>
<li>Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDowhan%2C+W+%22Biochemistry+of+Lipids%2C+Lipoproteins+and+Membranes%22">Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes</a>. , 5th, Elsevier. Amsterdam, The Netherlands. 1-37 (2008).</li>
<li>Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+membrane+phospholipid+diversity%3A+why+are+there+so+many+lipids%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?</a> Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).</li>
<li>De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti+mutants+deficient+in+phospholipid+N-methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).</li>
<li>Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulator+gene+phoB+mediates+phosphate+stress-controlled+synthesis+of+the+membrane+lipid+diacylglyceryl-N%2CN%2CN-trimethylhomoserine+in+Rhizobium+%28Sinorhizobium%29+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti.</a> Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).</li>
<li>Klug, R. M., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+enzymes+of+diacylglyceryl-O-4%27-%28N%2CN%2CN%2C-trimethyl%29homoserine+biosynthesis+are+encoded+by+btaA+and+btaB+in+the+purple+bacterium+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Two enzymes of diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).</li>
<li>Zavaleta-Pastor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinorhizobium+meliloti+phospholipase+C+required+for+lipid+remodeling+duringphosphorus+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).</li>
<li>Pech-Canul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FadD+is+required+for+utilization+of+endogenous+fatty+acids+released+from+membrane+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids.</a> J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).</li>
<li>Banerji, S., Flieger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patatin-like+proteins%3A+a+new+family+of+lipolytic+enzymes+present+in+bacteria%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?</a> Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).</li>
<li>Sahonero-Canavesi, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-releasing+activities+in+Sinorhizobium+meliloti+include+unusual+diacylglycerol+lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase.</a> Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).</li>
<li>Fischer, M., Pleiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipase+Engineering+Database%3A+a+navigation+and+analysis+tool+for+protein+families%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acid.+Res%22%5BJournal%5D)">The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families.</a> Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).</li>
<li>Sigrist, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+continuing+developments+at+PROSITE%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New and continuing developments at PROSITE.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+-+new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3 - new capabilities and interfaces.</a> Nucl. Acids Res. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JH+%22Experiments+in+Molecular+Genetics%22">Experiments in Molecular Genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY, USA. (1972).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), e1610(2009).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Molecular Dynamics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphorimager+SI+User%C2%B4s+Guide%22">Phosphorimager SI User´s Guide</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf">http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf</a> (1994).</li>
<li>Dixon, M., Webb, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDixon%2C+M+%22Enzymes%3A+Third+Edition%22">Enzymes: Third Edition</a>. , Longman, USA. (1979).</li>
<li>Rudolph, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+characterization%2C+and+mutagenesis+of+the+Yersinia+pestis+murine+toxin%2C+a+phospholipase+D+superfamily+member%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member.</a> J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).</li>
<li>Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+a+novel+lipolytic+enzyme+YvdO+from+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).</li>
<li>Peppelenbosch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica+%28Cairo%29%22%5BJournal%5D)">Kinome profiling.</a> Scientifica (Cairo). , Article ID 306798 (2012).</li>
<li>Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+and+chromogenic+substrates+used+in+bacterial+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics.</a> Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).</li>
<li>Kuznetsova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+genomics%3A+Application+of+general+enzymatic+screens+to+discover+new+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes.</a> FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).</li>
<li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScopes%2C+RK+%22Protein+Purification%2C+Principles+and+Practice%22">Protein Purification, Principles and Practice</a>. , Springer. New York. (2010).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel corso degli ultimi 20 anni, genomi di molti organismi sono stati sequenziati e anche se una ricchezza di dati sequenza del genoma è stato generato, interpretazione funzionale è in ritardo e ostacola quindi la nostra comprensione della funzione del genoma. funzioni geniche in genomi sono spesso assegnati in base alla somiglianza con geni di funzione nota o di insorgenza di motivi conservati. Tuttavia, la precisa funzione di un dato gene spesso non è noto. Soprattutto, previsto geni strutturali per enzimi non possono ...

Lipidi glicerolo-based come trigliceridi e fosfolipidi (glycero) costituiscono importanti e probabilmente il più noti classi di lipidi 1. Trigliceridi (tag) sono grassi o oli, che di solito fungono da lipidi di stoccaggio, e quindi come potenziali fonti di energia e di carbonio. TAG possono essere degradati dalla lipasi, che sono spesso secrete dall&#39;organismo produzione di digerire variabili esterne e renderli disponibili come fonti di carbonio. Inoltre, lipasi sono stati ampiamente studiati negli anni, grazie alle loro importanti applicazioni biotecnologiche 2. A causa della loro natura anfifilica e la loro forma quasi cilindrica, proprietà di membrana formante (glycero) fosfolipidi esporre e generalmente costituiscono i principali componenti lipidici di membrana doppo strato 3. In microrganismi semplici, come il batterio Escherichia coli, solo tre varianti principali del gruppo testa, fosfatidilglicerolo (PG), cardiolipina (CL), e phosphatidylethanolamine (PE) è riscontrabile, anche se si deve essere consapevoli che ciascuno di essi può essere sostituito con un considerevole numero di differenti catene grassi acil al sn -1 o sn posizione -2 dando luogo ad un grande numero di differenti specie molecolari 4 . Altri batteri possono avere altri fosfolipidi in aggiunta o al posto. Ad esempio, Sinorhizobium meliloti, un batterio del suolo, che è in grado di formare una radice nodulo simbiosi azotofissatrice con l&#39;erba medica legume (Medicago sativa), contiene in aggiunta al PE un secondo fosfolipide zwitterionico, fosfatidilcolina (PC) 5. Inoltre, i lipidi non contenenti fosforo o glicerolo potrebbe essere parte anfifilico e la forma della membrana cellulare. Ad esempio, dalle condizioni di crescita fosforo limitativo, in S. meliloti, (glycero) fosfolipidi sono in gran parte sostituiti da lipidi di membrana che non contengono fosforo, cioè, sulfolipids, lipidi ornitina, e diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. Nei batteri, DGTS è formata da diacilglicerolo (DAG) in un percorso in due fasi 7, ma la fonte per la generazione di DAG non era chiaro. Esperimenti di pulse-chase suggerito che il PC potrebbe essere un precursore per DGTS 8 e utilizzando la metodologia descritta in questo manoscritto abbiamo potuto identificare un fosfolipasi C (PLCP, SMc00171) che si forma in condizioni di fosforo-limitante e che può convertire il PC in DAG e phosphocholine 8. In uno studio separato, abbiamo scoperto che un sintetasi acil-CoA (FADD) mutante -carente di S. meliloti o di Escherichia coli accumulato acidi grassi liberi entrando fase stazionaria della crescita 9. Sebbene questi acidi grassi sembravano essere derivato da lipidi di membrana, la fonte precisa per gli acidi grassi liberi o l&#39;enzima (s) liberandoli non erano noti. Anche in questo caso, utilizzando la strategia delineata in questo manoscritto, due 10 (fosfo) lipasi Patatin-like (SMc00930 e SMc01003), che ha contribuito alla formazione di acidi grassi liberi a S. meliloti 11 sono stati previsti. Sorprendentemente, SMc01003 utilizzato DAG come substrato convertirlo monoacilglicerolo e infine glicerolo e acidi grassi liberi 11. Pertanto, SMc01003 è una lipasi DAG (DGLA). Sebbene un certo numero di algoritmi esistenti per prevedere il potenziale (fosfo) lipasi 12,13, la loro funzione precisa e ruolo fisiologico non è generalmente noto. Qui descriviamo un protocollo, per clonare e iperespressione di lipasi (fosfo) previsti o potenziali. Questo manoscritto spiega come saggi enzimatici possono essere sviluppati e ottimizzati per la (fosfo) lipasi sovraespresso utilizzando substrati cromogeni artificiali. Forniamo esempi di come con un metodo enzimatico ottimizzato il vero (fosfo) substrato lipasi può essere incontrato e di come queste scoperte potrebbero arricchire la nostra comprensione della fisiologia microbica.

<table><tbody><tr><td>Cloroformio</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td>Analisi TLC & Estrazione lipidica</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>Analisi TLC & Estrazione lipidica</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>JT Baker</td><td>9507-05</td><td>Analisi TLC & Estrazione lipidica</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>JT Baker</td><td>9309-02</td><td>Analisi TLC & Estrazione lipidica</td></tr><tr><td>Dietiletere</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>acqua bidistillata</td><td>&nbsp; QUALSIASI&</td><td>nbsp; NA</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>LB broth</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Crescita batterica, 10 g triptone + 5 g estratto di lievito + 10 g NaCl per litro di acqua bidistillata</td></tr><tr><td>triptone</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>211705</td> Estratto di lievito <td>per la crescita batterica</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>Crescita batterica</td></tr><tr><td>Brodo TY</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Crescita batterica, 8 g di triptone + 3 g di estratto di lievito + 66 mg di CaCl2&#183; 2H2O per litro di acqua bidistillata</td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Baker</td><td>1332-01</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>isopropil-beta;-D-tiogalattoside (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td>Crescita batterica</td></tr><tr><td>Dietanolammina</td><td>Sigma</td><td>D-8885</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Fosfolipasi A2 snake veleno</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Fosfolipasi C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Bis-p-nitrofenil fosfato</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil stearato</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil dodecanoato</td><td>Sigma</td><td>61716</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil decanoato</td><td>Sigma</td><td>N0252</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil palmitato</td><td>Sigma</td><td>N2752</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil butirrato</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil ottanoato</td><td>Sigma</td><td>21742</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Acido acetico, sale sodico [1-14C]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC084</td><td>Crescita batterica</td></tr><tr><td>dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Alluminio HPTLC gel di silice 60 piastre. Lastre HPTLC in gel di silice dimensioni 20 x 20 cm, 25 fogli.</td><td>Merck</td><td>105547</td><td>analisi TLC & Spettrometro per estrazione lipidica</td></tr><tr><td>UV/VIS Lambda 35</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Storm 820 Phosphorimager</td><td>Molecular Dynamics</td><td>NA</td><td>Scanner a luminescenza fotostimolabile</td></tr><tr><td>Contatore a scintillazione multiuso</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Quantificazione della radioattività</td></tr><tr><td>Cella a pressione francese</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NA&nbsp;</td><td>Rottura delle celle</td></tr><tr><td>carta per cromatografia 3MM Chr</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>TLC analysis</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021il nostro</td><td>riferimento 11</td><td></td><td>ceppo studiato</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Cellule competenti</td> Vettore di espressione proteica <td>Novagen</td><td>69451</td><td>ceppo</td></tr><tr><td>pET9a vettore</td><td>Novagen</td><td>69431</td> vettore di <td>espressione proteica</td></tr><tr><td>vettore pET17b</td><td>Novagen</td><td>69663</td><td>vettore di espressione proteica</td></tr><tr><td>polistirene sterile provetta a fondo tondo (14 ml) Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352057</td><td>radiomarcatura di colture batteriche</td></tr><tr><td>provette per microcentrifuga in polipropilene (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicerolo</td><td>Sigma</td><td>D9135</td><td>lipidi standard</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilcolina, dipalmitoil</td><td>Sigma</td><td>P6267</td><td>lipidi standard</td></tr><tr><td>DL-&alfa;-monopalmitina</td><td>Sigma</td><td>M1640</td><td>lipidi standard</td></tr><tr><td>acido palmitico</td><td>Sigma</td><td>P0500</td><td>lipidi standard</td></tr></tbody></table>

la definizione del substrato specificità per lipasi e fosfolipasi candidati

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

I microrganismi producono un ampio spettro di lipasi (fosfo) che vengono secreti per rendere substrati esterni disponibili per l&#39;organismo. In alternativa, altri (fosfo) lipasi possono essere fisicamente associate con l&#39;organismo producendo causando un turnover di lipidi intrinseche e spesso dando origine ad un rimodellamento delle membrane cellulari. Sebbene potenziali (fosfo) lipasi possono essere previsti con un certo numero di algoritmi quando la sequenza del gene / proteina è disponibile, prova sperimentale delle attività enzimatiche, specificità di substrato e potenziali funzioni fisiologiche è spesso non è stata ottenuta. Questo manoscritto descrive l&#39;ottimizzazione delle condizioni di analisi per i potenziali (fosfo) lipasi con specificità di substrato sconosciute e come impiegare queste condizioni ottimali nella ricerca per il substrato naturale di un rispettivo (fosfo) lipasi. Usando substrati cromogeni artificiali, come i derivati p -nitrophenyl, può aiutare a rilevare un minoreattività enzimatica per un (fosfo) lipasi previsto in condizioni standard. Avendo riscontrato un attività enzimatica tale minore, i parametri distinti di un saggio enzimatico possono essere variate per ottenere un&#39;idrolisi più efficiente del substrato artificiale. Dopo aver determinato le condizioni in cui un enzima funziona bene, una varietà di potenziali substrati naturali devono essere analizzati per la loro degradazione, un processo che può essere seguita con metodi cromatografici distinti. La definizione di specificità di substrato per nuovi enzimi, fornisce spesso ipotesi per un potenziale ruolo fisiologico di questi enzimi, che poi possono essere testati sperimentalmente. Seguendo queste linee guida, siamo stati in grado di identificare una fosfolipasi C (SMc00171) che degrada fosfatidilcolina di phosphocholine e diacylglycerol, in una fase cruciale per il rimodellamento delle membrane nel batterio Sinorhizobium meliloti dalle condizioni di fosforo-limitante della crescita. Per due predetto patatin-come fosfolipasi (SMc00930 e SMc01003) dello stesso organismo, potremmo ridefinire le loro specificità di substrato e chiarire che SMc01003 è una lipasi diacilglicerolo.

Attività di specifici PC fosfolipasi C SMc00171 con Bis- p -nitrophenyl fosfato Estratti privi di cellule ottenute da E. coli BL21 (DE3) pLysS x, che avevano smc00171 espressi, sono stati studiati per la loro capacità di idrolizzare bis- p esteri -nitrophenyl fosfato, utilizzando un saggio enzimatico spettrofotometrica, misurando la -NP ...

Molte (fosfo)lipasi previste sono scarsamente caratterizzate per quanto riguarda le loro specificità di substrato e le funzioni fisiologiche. Qui forniamo un protocollo per ottimizzare le attività enzimatiche, cercare substrati naturali e proporre funzioni fisiologiche per questi enzimi.

La definizione del substrato Specificità per lipasi e fosfolipasi candidati

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è accelerare l'individuazione di substrati fisiologici per potenziali lipasi e fosfolipasi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'entomologia, ad esempio in che modo le fosfolipasi partecipano al rimodellamento dei lipidi nelle membrane biologiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'ottimizzazione dell'attività enzimatica e la ricerca del substrato naturale per l'enzima possono essere eseguite in modo indipendente.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla specificità del substrato delle lipasi e fosfolipasi batteriche, può anche essere modificato per studiare le idrolasi di qualsiasi altro organismo modello. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo cercato un'attività enzimatica in grado di degradare il lipide intrinseco della membrana, la fosfatidilcolina, in *Rhizobium meliloti*. Per preparare estratti proteici privi di cellule, scongelare le sospensioni cellulari batteriche e conservarle sul ghiaccio.Quindi, passare le sospensioni cellulari tre volte attraverso una cella a pressione fredda a 20.000 pound per pollice quadrato. Rimuovere le

defining-substrate-specificities-for-lipase-phospholipase

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

La fosforilazione delle proteine è una caratteristica centrale del modo in cui le cellule interpretano e rispondono alle informazioni nel loro ambiente extracellulare. Qui, presentiamo un protocollo di screening ad alto rendimento che utilizza chinasi purificate da cellule di mammifero per identificare rapidamente le chinasi che fosforilano uno o più substrati di interesse.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening

Descriviamo un test basato sulla fluorescenza per misurare lo scrambling dei fosfolipidi in grandi liposomi unilamellari ricostituiti con opsina.

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Qui presentiamo un bilingue lipidico supportato nel contesto di una piattaforma microfluidica per studiare le interazioni proteine-fosfoinositide usando un metodo senza etichetta basato sulla modulazione del pH.

PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

Qui, presentiamo un protocollo per determinare la specificità di proteasi in tessuto grezzo del mouse estratti usando spettrometria MALDI-TOF.

La determinazione della specificità della proteasi nel Mouse tessuto estratti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF: manipolazione di PH per causare i cambiamenti di specificità

Presentato qui è un saggio di fluorescenza sensibile per monitorare l'attività dell'apolipoproteina N-aciltransferasi utilizzando il peptide diacilglicerile e gli alchino-fosfolipidi come substrati con click-chemistry.

Saggio fluorometrico basato sulla chimica dei clic per l'apolipoproteina N-aciltransferasi dalla caratterizzazione enzimatica allo screening ad alta produttività

Qui, descriviamo protocolli che utilizzano sensori lipidici fluorescenti e liposomi per determinare se una proteina estrae e trasporta fosfatidilserina o fosfatidilinositolo 4-fosfato in vitro.

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Questo protocollo utilizza il gonfiore dell'agarosio come tecnica potente e generalizzabile per incorporare proteine di membrana integrali (PIM) in vescicole lipidiche unilamellari giganti (GUV), come descritto qui per la ricostituzione della proteina del recettore della serotonina 1A umana (5-HT1AR), una delle classi di recettori accoppiati a proteine G farmacologicamente importanti.

Costruzione di membrane lipidiche modello che incorporano recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)

Una bilancia del film superficiale a goccia pendente implementata con uno scambio multi-sottofase, soprannominato OCTOPUS, consente di imitare le condizioni digestive mediante lo scambio sequenziale di sottofase della soluzione originale di massa con fluidi gastrointestinali simulati. La digestione simulata in vitro viene monitorata registrando in situ la tensione interfacciale dello strato interfacciale digerito.

In vitro Digestione delle emulsioni in una singola goccia tramite scambio multifase di fluidi gastrointestinali simulati

Questo metodo descrive un saggio di sedimentazione in vitro basato sulla lectina per quantificare l'affinità di legame della fosfatasi glucana e dell'amilopectina. Questo saggio di co-sedimentazione è affidabile per misurare il legame del substrato della glucanofosfatasi e può essere applicato a vari substrati di glucano solubilizzati.

Saggio di sedimentazione basato sulla concanavalina A per misurare il legame del substrato delle fosfatasi glucane

Presentiamo un metodo economico per valutare la permeabilità della membrana liposomiale con sensibilità e risoluzione superiori rispetto alle tecniche convenzionali. Utilizzando una nuova reazione di sostituzione del ligando incapsulato, questa tecnica rileva i cambiamenti indotti dalla fosfolipasi A2 nelle membrane del modello. Facilmente integrabile con le analisi standard, questo approccio accessibile migliora la risoluzione per lo studio della biofisica delle membrane e delle interazioni...

Un saggio di permeabilità della membrana liposomica per studiare gli effetti dei gruppi fosfatidilinositolo fosfato sull'azione membranotropica del veleno PLA2

Scopri un protocollo computazionale per ottimizzare l'attività di lipasi e fosfolipasi e identificare i loro substrati naturali. Questo metodo accelera la comprensione dei ruoli fisiologici degli enzimi nel metabolismo lipidico.

La definizione del substrato Specificità per lipasi e fosfolipasi candidati

Esplora altri video