Name: La definizione del substrato Specificità per lipasi e fosfolipasi candidati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Scopri un protocollo computazionale per ottimizzare l'attività di lipasi e fosfolipasi e identificare i loro substrati naturali. Questo metodo accelera la comprensione dei ruoli fisiologici degli enzimi nel metabolismo lipidico.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-Messico (CONACYT-Messico) (82614, 153998, 253549, e 178.359 in Investigación Científica Básica e 118 in Investigación en Fronteras de la Ciencia) e dalla Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM DGAPA-; PAPIIT IN202616, IN203612).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel corso degli ultimi 20 anni, genomi di molti organismi sono stati sequenziati e anche se una ricchezza di dati sequenza del genoma è stato generato, interpretazione funzionale è in ritardo e ostacola quindi la nostra comprensione della funzione del genoma. funzioni geniche in genomi sono spesso assegnati in base alla somiglianza con geni di funzione nota o di insorgenza di motivi conservati. Tuttavia, la precisa funzione di un dato gene spesso non è noto. Soprattutto, previsto geni strutturali per enzimi non possono ...

Lipidi glicerolo-based come trigliceridi e fosfolipidi (glycero) costituiscono importanti e probabilmente il più noti classi di lipidi 1. Trigliceridi (tag) sono grassi o oli, che di solito fungono da lipidi di stoccaggio, e quindi come potenziali fonti di energia e di carbonio. TAG possono essere degradati dalla lipasi, che sono spesso secrete dall&#39;organismo produzione di digerire variabili esterne e renderli disponibili come fonti di carbonio. Inoltre, lipasi sono stati ampiamente studiati negli anni, grazie alle loro importanti applicazioni biotecnologiche 2. A causa della loro natura anfifilica e la loro forma quasi cilindrica, proprietà di membrana formante (glycero) fosfolipidi esporre e generalmente costituiscono i principali componenti lipidici di membrana doppo strato 3. In microrganismi semplici, come il batterio Escherichia coli, solo tre varianti principali del gruppo testa, fosfatidilglicerolo (PG), cardiolipina (CL), e phosphatidylethanolamine (PE) è riscontrabile, anche se si deve essere consapevoli che ciascuno di essi può essere sostituito con un considerevole numero di differenti catene grassi acil al sn -1 o sn posizione -2 dando luogo ad un grande numero di differenti specie molecolari 4 . Altri batteri possono avere altri fosfolipidi in aggiunta o al posto. Ad esempio, Sinorhizobium meliloti, un batterio del suolo, che è in grado di formare una radice nodulo simbiosi azotofissatrice con l&#39;erba medica legume (Medicago sativa), contiene in aggiunta al PE un secondo fosfolipide zwitterionico, fosfatidilcolina (PC) 5. Inoltre, i lipidi non contenenti fosforo o glicerolo potrebbe essere parte anfifilico e la forma della membrana cellulare. Ad esempio, dalle condizioni di crescita fosforo limitativo, in S. meliloti, (glycero) fosfolipidi sono in gran parte sostituiti da lipidi di membrana che non contengono fosforo, cioè, sulfolipids, lipidi ornitina, e diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. Nei batteri, DGTS è formata da diacilglicerolo (DAG) in un percorso in due fasi 7, ma la fonte per la generazione di DAG non era chiaro. Esperimenti di pulse-chase suggerito che il PC potrebbe essere un precursore per DGTS 8 e utilizzando la metodologia descritta in questo manoscritto abbiamo potuto identificare un fosfolipasi C (PLCP, SMc00171) che si forma in condizioni di fosforo-limitante e che può convertire il PC in DAG e phosphocholine 8. In uno studio separato, abbiamo scoperto che un sintetasi acil-CoA (FADD) mutante -carente di S. meliloti o di Escherichia coli accumulato acidi grassi liberi entrando fase stazionaria della crescita 9. Sebbene questi acidi grassi sembravano essere derivato da lipidi di membrana, la fonte precisa per gli acidi grassi liberi o l&#39;enzima (s) liberandoli non erano noti. Anche in questo caso, utilizzando la strategia delineata in questo manoscritto, due 10 (fosfo) lipasi Patatin-like (SMc00930 e SMc01003), che ha contribuito alla formazione di acidi grassi liberi a S. meliloti 11 sono stati previsti. Sorprendentemente, SMc01003 utilizzato DAG come substrato convertirlo monoacilglicerolo e infine glicerolo e acidi grassi liberi 11. Pertanto, SMc01003 è una lipasi DAG (DGLA). Sebbene un certo numero di algoritmi esistenti per prevedere il potenziale (fosfo) lipasi 12,13, la loro funzione precisa e ruolo fisiologico non è generalmente noto. Qui descriviamo un protocollo, per clonare e iperespressione di lipasi (fosfo) previsti o potenziali. Questo manoscritto spiega come saggi enzimatici possono essere sviluppati e ottimizzati per la (fosfo) lipasi sovraespresso utilizzando substrati cromogeni artificiali. Forniamo esempi di come con un metodo enzimatico ottimizzato il vero (fosfo) substrato lipasi può essere incontrato e di come queste scoperte potrebbero arricchire la nostra comprensione della fisiologia microbica.

<table><tbody><tr><td>Cloroformio</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td>Analisi TLC & Estrazione lipidica</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>Analisi TLC & Estrazione lipidica</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>JT Baker</td><td>9507-05</td><td>Analisi TLC & Estrazione lipidica</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>JT Baker</td><td>9309-02</td><td>Analisi TLC & Estrazione lipidica</td></tr><tr><td>Dietiletere</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>acqua bidistillata</td><td>&nbsp; QUALSIASI&</td><td>nbsp; NA</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>LB broth</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Crescita batterica, 10 g triptone + 5 g estratto di lievito + 10 g NaCl per litro di acqua bidistillata</td></tr><tr><td>triptone</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>211705</td> Estratto di lievito <td>per la crescita batterica</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>Crescita batterica</td></tr><tr><td>Brodo TY</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Crescita batterica, 8 g di triptone + 3 g di estratto di lievito + 66 mg di CaCl2&#183; 2H2O per litro di acqua bidistillata</td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Baker</td><td>1332-01</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>isopropil-beta;-D-tiogalattoside (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td>Crescita batterica</td></tr><tr><td>Dietanolammina</td><td>Sigma</td><td>D-8885</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Fosfolipasi A2 snake veleno</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Fosfolipasi C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Bis-p-nitrofenil fosfato</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil stearato</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil dodecanoato</td><td>Sigma</td><td>61716</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil decanoato</td><td>Sigma</td><td>N0252</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil palmitato</td><td>Sigma</td><td>N2752</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil butirrato</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>p-nitrofenil ottanoato</td><td>Sigma</td><td>21742</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Acido acetico, sale sodico [1-14C]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC084</td><td>Crescita batterica</td></tr><tr><td>dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Alluminio HPTLC gel di silice 60 piastre. Lastre HPTLC in gel di silice dimensioni 20 x 20 cm, 25 fogli.</td><td>Merck</td><td>105547</td><td>analisi TLC & Spettrometro per estrazione lipidica</td></tr><tr><td>UV/VIS Lambda 35</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>Storm 820 Phosphorimager</td><td>Molecular Dynamics</td><td>NA</td><td>Scanner a luminescenza fotostimolabile</td></tr><tr><td>Contatore a scintillazione multiuso</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Quantificazione della radioattività</td></tr><tr><td>Cella a pressione francese</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NA&nbsp;</td><td>Rottura delle celle</td></tr><tr><td>carta per cromatografia 3MM Chr</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>TLC analysis</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021il nostro</td><td>riferimento 11</td><td></td><td>ceppo studiato</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Cellule competenti</td> Vettore di espressione proteica <td>Novagen</td><td>69451</td><td>ceppo</td></tr><tr><td>pET9a vettore</td><td>Novagen</td><td>69431</td> vettore di <td>espressione proteica</td></tr><tr><td>vettore pET17b</td><td>Novagen</td><td>69663</td><td>vettore di espressione proteica</td></tr><tr><td>polistirene sterile provetta a fondo tondo (14 ml) Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352057</td><td>radiomarcatura di colture batteriche</td></tr><tr><td>provette per microcentrifuga in polipropilene (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td>Saggi enzimatici</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicerolo</td><td>Sigma</td><td>D9135</td><td>lipidi standard</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilcolina, dipalmitoil</td><td>Sigma</td><td>P6267</td><td>lipidi standard</td></tr><tr><td>DL-&alfa;-monopalmitina</td><td>Sigma</td><td>M1640</td><td>lipidi standard</td></tr><tr><td>acido palmitico</td><td>Sigma</td><td>P0500</td><td>lipidi standard</td></tr></tbody></table>

la definizione del substrato specificità per lipasi e fosfolipasi candidati

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

I microrganismi producono un ampio spettro di lipasi (fosfo) che vengono secreti per rendere substrati esterni disponibili per l&#39;organismo. In alternativa, altri (fosfo) lipasi possono essere fisicamente associate con l&#39;organismo producendo causando un turnover di lipidi intrinseche e spesso dando origine ad un rimodellamento delle membrane cellulari. Sebbene potenziali (fosfo) lipasi possono essere previsti con un certo numero di algoritmi quando la sequenza del gene / proteina è disponibile, prova sperimentale delle attività enzimatiche, specificità di substrato e potenziali funzioni fisiologiche è spesso non è stata ottenuta. Questo manoscritto descrive l&#39;ottimizzazione delle condizioni di analisi per i potenziali (fosfo) lipasi con specificità di substrato sconosciute e come impiegare queste condizioni ottimali nella ricerca per il substrato naturale di un rispettivo (fosfo) lipasi. Usando substrati cromogeni artificiali, come i derivati p -nitrophenyl, può aiutare a rilevare un minoreattività enzimatica per un (fosfo) lipasi previsto in condizioni standard. Avendo riscontrato un attività enzimatica tale minore, i parametri distinti di un saggio enzimatico possono essere variate per ottenere un&#39;idrolisi più efficiente del substrato artificiale. Dopo aver determinato le condizioni in cui un enzima funziona bene, una varietà di potenziali substrati naturali devono essere analizzati per la loro degradazione, un processo che può essere seguita con metodi cromatografici distinti. La definizione di specificità di substrato per nuovi enzimi, fornisce spesso ipotesi per un potenziale ruolo fisiologico di questi enzimi, che poi possono essere testati sperimentalmente. Seguendo queste linee guida, siamo stati in grado di identificare una fosfolipasi C (SMc00171) che degrada fosfatidilcolina di phosphocholine e diacylglycerol, in una fase cruciale per il rimodellamento delle membrane nel batterio Sinorhizobium meliloti dalle condizioni di fosforo-limitante della crescita. Per due predetto patatin-come fosfolipasi (SMc00930 e SMc01003) dello stesso organismo, potremmo ridefinire le loro specificità di substrato e chiarire che SMc01003 è una lipasi diacilglicerolo.

Attività di specifici PC fosfolipasi C SMc00171 con Bis- p -nitrophenyl fosfato Estratti privi di cellule ottenute da E. coli BL21 (DE3) pLysS x, che avevano smc00171 espressi, sono stati studiati per la loro capacità di idrolizzare bis- p esteri -nitrophenyl fosfato, utilizzando un saggio enzimatico spettrofotometrica, misurando la -NP ...

Molte (fosfo)lipasi previste sono scarsamente caratterizzate per quanto riguarda le loro specificità di substrato e le funzioni fisiologiche. Qui forniamo un protocollo per ottimizzare le attività enzimatiche, cercare substrati naturali e proporre funzioni fisiologiche per questi enzimi.

La definizione del substrato Specificità per lipasi e fosfolipasi candidati

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è accelerare l'individuazione di substrati fisiologici per potenziali lipasi e fosfolipasi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'entomologia, ad esempio in che modo le fosfolipasi partecipano al rimodellamento dei lipidi nelle membrane biologiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'ottimizzazione dell'attività enzimatica e la ricerca del substrato naturale per l'enzima possono essere eseguite in modo indipendente.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla specificità del substrato delle lipasi e fosfolipasi batteriche, può anche essere modificato per studiare le idrolasi di qualsiasi altro organismo modello. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo cercato un'attività enzimatica in grado di degradare il lipide intrinseco della membrana, la fosfatidilcolina, in *Rhizobium meliloti*. Per preparare estratti proteici privi di cellule, scongelare le sospensioni cellulari batteriche e conservarle sul ghiaccio.Quindi, passare le sospensioni cellulari tre volte attraverso una cella a pressione fredda a 20.000 pound per pollice quadrato. Rimuovere le cellule integre e i detriti cellulari mediante centrifugazione a 5.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, preparare aliquote di 100 e 500 microlitri dal soprannatante per analisi successive.Impostare il saggio enzimatico precedentemente ottimizzato utilizzando gli schemi di pipettaggio riportati nel protocollo testuale. Per una copertura iniziale di attività enzimatiche distinte, utilizzare substrati artificiali che producono un prodotto colorato dopo idrolisi, come derivati del para-nitrofenolo o del PNP. Seguire l'andamento nel tempo dell'aumento dell'assorbanza a 405 nanometri, dovuto alla formazione di PNP in uno spettrofotometro a 30 gradi Celsius nel corso di un periodo di cinque minuti.Infine, eseguire i calcoli come descritto nel protocollo testuale. Per la marcatura radioattiva dei lipidi, preparare una pre-coltura notturna di un organismo di interesse in cinque millilitri di mezzo di coltura desiderato e coltivare a 30 gradi Celsius. Dalla pre-coltura, inoculare 20 millimetri di mezzo fresco in un matraccio da coltura da 100 millimetri, al fine di ottenere una densità ottica iniziale a 620 nanometri pari a 0,3 per la coltura.Successivamente, trasferire un'aliquote di un millilitro della coltura in un tubo sterile in polistirene da 14 millilitri con fondo rotondo, in condizioni sterili. Aggiungere un microcurie di acetato 114 c all'aliquote di un millilitro di coltura. Quindi, incubare la coltura liquida sotto agitazione a 30 gradi Celsius per un periodo di 24 ore.Al termine del periodo di incubazione, trasferire la coltura in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 12.000 ×g a temperatura ambiente per cinque minuti. Ri-sospendere il pellet in 100 microlitri di acqua. A questo punto, conservare la sospensione cellulare a meno 20 gradi Celsius oppure procedere immediatamente all'estrazione dei lipidi polari.Per eseguire l'estrazione dei lipidi polari, aggiungere 375 microlitri di una soluzione di metanolo e cloroformio in rapporto due a uno ai 100 microlitri di sospensione cellulare acquosa. Eseguire la vortexazione del campione per 30 secondi prima di incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, centrifugare per cinque minuti a 12.000 ×g a temperatura ambiente.Quindi, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitro. Successivamente, aggiungere 125 microlitri di cloroformio e 125 microlitri di acqua al soprannatante. Dopo aver agitato a vortice per 30 secondi, centrifugare il campione per un minuto a 12.000 ×g a temperatura ambiente.Trasferire la fase cloroformica inferiore in un tubo nuovo. Quindi, asciugare la soluzione con un flusso di gas azoto. Sciogliere i lipidi asciutti in 100 microlitri di soluzione di cloroformio in metanolo.Per la separazione dei lipidi polari neutri mediante cromatografia su strato sottile, applicare aliquote di tre microlitri dei campioni lipidici su una lastrina di silice gel ad alte prestazioni su alluminio, partendo da due centimetri dai bordi della piastra. Se si analizzano più campioni mediante cromatografia monodimensionale, mantenere una distanza di almeno 1,5 centimetri tra i diversi punti di applicazione dei campioni. Trasferire la fase mobile in una camera di sviluppo per TLC, internamente rivestita con carta cromatografica.Coprire con una lastra di vetro per permettere alla camera di saturarsi per 30 minuti. Trasferire il foglio di gel di silice HPTLC su alluminio con i campioni di lipidi essiccati nella camera. Lasciare sviluppare la lastra per 30 minuti in una camera chiusa prima di rimuoverla.Quindi, lasciare evaporare i solventi in una cappa per due ore. Una volta che il foglio di TLC sviluppato è asciutto, incubarlo con una schermatura a luminescenza fotostimolabile in una cassetta chiusa per tre giorni. Successivamente, esporre la schermatura incubata a uno scanner PSL e acquisire un'immagine virtuale dei lipidi marcati radioattivamente separati.Per determinare l'attività della diacilglicerolo (DAG) lipasi, aggiungere prima 5.000 CPM di DAG marcato con 14 C in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere anche una soluzione di Triton X-100 al tubo e mescolare mediante vortex. Essiccare la soluzione sotto un flusso di azoto.Per un saggio finale di 100 microlitri, aggiungere tampone Tris-HCl, una soluzione di cloruro di sodio e acqua bidistillata. Vortexare per cinque secondi. Avviare la reazione aggiungendo cinque microlitri di enzima alla soluzione.Incubare la soluzione a 30 gradi Celsius per quattro ore. Arrestare la reazione aggiungendo 250 microlitri di metanolo e 125 microlitri di cloroformio, quindi estrarre i lipidi come descritto in precedenza in questo video. Procedere all'analisi dei lipidi neutri polari mediante 1DTLC e successiva imaging PSL come in precedenza.Sebbene la fosfolipasi predetta SMc01003 mostri attività con esteri acilici artificiali di para-nitrofenolo, l'attività è soltanto doppia o tripla rispetto all'attività di fondo presente in estratti privi di cellule di Escherichia coli, in cui nessun gene estraneo era stato espresso. Ciò indica che gli esteri acilici di para-nitrofenile non sembrano essere buoni substrati per SMc01003. Mentre gli estratti privi di cellule di E. coli non possono degradare il diacilglicerolo, gli estratti di ceppi in cui era stata espressa la fosfolipasi predetta SMc01003 hanno determinato una degradazione del diacilglicerolo.Sebbene fosse previsto che SMc01003 fosse una fosfolipasi, in realtà si tratta di una diacilglicerolo lipasi che degrada il diacilglicerolo in monoacilglicerolo e un acido grasso. Successivamente degrada il monoacilglicerolo in glicerolo e un altro acido grasso. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in poche settimane se eseguita correttamente.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottimizzare le attività enzimatiche delle lipasi e delle fosfolipasi e di come proseguire nella ricerca dei loro substrati fisiologici. Un vantaggio cruciale di questa procedura è che l'ottimizzazione dell'attività enzimatica può essere separata dalla ricerca del substrato naturale dell'enzima. Non dimenticare che lavorare con solventi organici o sostanze radioattive può essere estremamente pericoloso e le precauzioni necessarie devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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