La definizione del substrato Specificità per lipasi e fosfolipasi candidati

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di accelerare l'individuazione di substrati fisiologici per potenziali lipasi e fosofolipasi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'entomologia, come ad esempio come le fosfolipasi contribuiscono al rimodellamento dei lipidi nelle membrane biologiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'ottimizzazione dell'attività enzimatica e la ricerca del substrato naturale per l'enzima possono essere eseguite in modo indipendente.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla specificità del substrato delle lipasi batteriche e delle fosfolipasi, può anche essere modificato per studiare le idrolasi di qualsiasi altro organismo modello. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo cercato un'attività enzimatica in grado di degradare il lipide intrinseco di membrana fosfatidilcolina inorhizobium meliloti. Per preparare estratti proteici privi di cellule, scongelare le sospensioni cellulari batteriche e conservarle in ghiaccio.

Quindi, passare le sospensioni cellulari tre volte attraverso una cella a pressione fredda a 20.000 libbre per pollice quadrato. Rimuovere le cellule intatte e i detriti cellulari mediante centrifugazione a 5.000 volte g per 30 minuti, a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, preparare aliquote da 100 e 500 microlitri dal surnatante per la successiva analisi.

Impostare il test enzimatico precedentemente ottimizzato utilizzando gli schemi di pipettaggio riportati nel protocollo di testo. Per una copertura iniziale delle attività enzimatiche distinte, utilizzare substrati artificiali che producono un prodotto colorato dopo idrolisi, come i derivati del para-nitrofenolo o del PNP. Seguire l'andamento temporale per un aumento dell'assorbanza a 405 nanometri, dovuto alla formazione di PNP in uno spettrofotometro a 30 gradi Celsius per un periodo di cinque minuti.

Infine, eseguire i calcoli come descritto nel protocollo di testo. Per la marcatura radio dei lipidi, preparare una pre-coltura notturna di un organismo di interesse in cinque millilitri del terreno di coltura desiderato e crescere a 30 gradi Celsius. Dalla pre-coltura, inoculare in 20 millimetri di terreno fresco in un pallone di coltura da 100 millimetri, per ottenere una densità ottica iniziale a 620 nanometri di 0,3 per la coltura.

Quindi, trasferire un'aliquota di un millilitro della coltura in una provetta a fondo tondo di polistirene sterile da 14 millilitri in condizioni sterili. Aggiungere una microcurie di acetato di 114 c alla coltura da un millilitro. Quindi, incubare la coltura liquida sotto agitazione a 30 gradi Celsius per un periodo di 24 ore.

Al termine del periodo di incubazione, trasferire la coltura in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 12.000 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Risospendere il pellet in 100 microlitri di acqua. A questo punto, conservare la sospensione cellulare a meno 20 gradi centigradi o proseguire immediatamente con l'estrazione dei lipidi polari.

Per eseguire l'estrazione dei lipidi polari, aggiungere 375 microlitri di una soluzione di metanolo due a uno per cloroformio ai 100 microlitri di sospensione cellulare acquosa. Agitare il campione per 30 secondi prima di incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, centrifugare per cinque minuti a 12.000 volte g a temperatura ambiente.

Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, aggiungi 125 microlitri di cloroformio e 125 microlitri di acqua al surnatante. Dopo aver agitato per 30 secondi, centrifugare il campione per un minuto a 12.000 volte g a temperatura ambiente.

Trasferire la fase inferiore di cloroformio in una provetta nuova. Quindi, asciugare la soluzione con un getto di azoto gassoso. Sciogliere i lipidi essiccati in 100 microlitri di soluzione di cloroformio in metanolo.

Per la separazione dei lipidi polari neutri mediante cromatografia su strato sottile, applicare aliquote di tre microlitri dei campioni lipidici, su un foglio di alluminio in gel di silice per cromatografia su strato sottile ad alte prestazioni, a partire da due centimetri dai bordi della piastra. Se più campioni vengono analizzati in cromatografia unidimensionale, mantenere una distanza di almeno 1,5 centimetri tra i diversi punti di applicazione del campione. Trasferire la fase mobile in una camera di sviluppo TLC, rivestita internamente con carta per cromatografia.

Coprire con una lastra di vetro per far saturare la camera per 30 minuti. Trasferire il foglio di alluminio in gel di silice HPTLC con i campioni lipidici essiccati nella camera. Lasciare sviluppare la piastra per 30 minuti in una camera chiusa prima di rimuoverla.

Quindi, lasciare asciugare i solventi in una cappa di flusso per due ore. Una volta che il foglio TLC sviluppato è asciutto, incubarlo con uno schermo di luminescenza fotostimolabile in una cassetta chiusa per tre giorni. Quindi, esporre lo schermo incubato a uno scanner PSL e acquisire un'immagine virtuale dei lipidi radiomarcati separati.

Per determinare l'attività della lipasi del diacilglicerolo, o DAG, aggiungere prima 5.000 CPM di 14 DAG marcati con C a una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Inoltre, aggiungere una soluzione di Triton X-100 al tubo e mescolare a vortice. Asciugare la soluzione sotto un getto di azoto.

Per un test finale da 100 microlitri, aggiungere un tampone Tris-HCl, una soluzione di cloruro di sodio e acqua bidistillata. Vortice per cinque secondi. Avviare la reazione aggiungendo cinque microlitri di enzima alla soluzione.

Incubare la soluzione a 30 gradi Celsius per quattro ore. Fermare la reazione con l'aggiunta di 250 microlitri di metanolo e 125 microlitri di cloroformio, prima di estrarre i lipidi come descritto in precedenza in questo video. Procedere all'analisi dei lipidi polari neutri mediante 1DTLC e successivo imaging PSL come in precedenza.

Sebbene la fosofolipasi SMc01003 mostri attività con esteri acilici artificiali para-nitrofenolici, l'attività è solo il doppio o il triplo dell'attività di fondo presente negli estratti privi di cellule di Escherichia coli, in cui non era stato espresso alcun gene estraneo. Ciò indica che gli esteri para-nitrofenil acilici non sembrano essere buoni substrati per SMc01003. Mentre gli estratti privi di cellule di E.Coli non possono degradare il diacilglicerolo, gli estratti di ceppi in cui era stata espressa la fosfolipasi prevista, SMc01003, hanno causato una degradazione del diacilglicerolo.

Sebbene si sia previsto che SMc01003 sia una fosfolipasi, in realtà è una diacilglicerolo lipasi che degrada il diacilglicerolo in monoacilglicerolo e un acido grasso. Quindi degrada ulteriormente il monoacilglicerolo in glicerolo e un altro acido grasso. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche settimane se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottimizzare le attività enzimatiche delle lipasi e delle fosfolipasi, e di come continuare con la ricerca dei loro substrati fisiologici. Un vantaggio cruciale di questa procedura è che l'ottimizzazione dell'attività enzimatica può essere separata dalla ricerca del substrato enzimatico naturale. Non dimenticare che lavorare con solventi organici o sostanze radioattive può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre le precauzioni necessarie durante l'esecuzione di questa procedura.