Misurare Progressive neurologico disabilità in un modello murino di sclerosi multipla

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la progressiva compromissione neurologica nei topi con malattie demielinizzanti croniche. A tal fine, offriamo raccomandazioni di parametri di test adatti allo studio della disabilità neurologica a lungo termine nel modello di sclerosi multipla progressiva del virus di Theilers, utilizzando il test Rotarod. Questa procedura fornisce una linea di base rispetto alla quale valutare la rilevanza del modello murino per la demielinizzazione progressiva ed è utile per testare terapie volte a trattare condizioni neurologiche progressive come la sclerosi multipla.

Il vantaggio di questo test ottimizzato rispetto al tradizionale sistema di punteggio visivo è che genera una variabile oggettiva per quantificare l'effetto a lungo termine delle terapie e delle procedure sperimentali sulle funzioni motorie. A dimostrare questa procedura sarà Darlene Royce, un tecnico del laboratorio di neuroimmunologia di Dartmouth. Al fine di valutare la coordinazione dell'equilibrio di base e il controllo motorio, iniziare il protocollo di adattamento cinque giorni prima dell'infezione da TMEV consentendo prima ai topi di acclimatarsi alla sala di prova per almeno 30 minuti.

Mentre i mouse si acclimatano, preimposta il Rotarod con i parametri di allenamento meno cinque DPI. Quindi, prendi un topo per la coda e posizionalo sull'asta rivolto lontano dall'operatore. Se il mouse cade o salta, riposizionalo nella sua corsia sul Rotarod finché tutti i mouse non sono in posizione.

Dopo aver caricato tutti e quattro i topi, premere il pulsante Invio per avviare l'esperimento. Assicurarsi che i timer si avviino automaticamente e osservare le rotazioni al minuto sul display per ogni corsia. Quindi, man mano che ogni animale cade dall'asta, registra la velocità dell'asta al momento della caduta, nonché la durata del tempo in cui l'animale è rimasto sull'asta.

Dopo che tutti i topi sono caduti, usa un fazzoletto per rimuovere eventuali boli fecali e urina dall'asta poiché la presenza di urina e materiale fecale può influire sulla capacità dei topi di afferrare correttamente l'asta. Dopo un riposo di tre minuti, dare ai topi una seconda e poi una terza prova in cui il tempo massimo per singola prova è di 240 secondi. Somministrare un totale di tre prove durante ogni giorno di test.

Infine, riporta i topi nella loro gabbia di casa. Nei giorni negativo quattro, negativo tre, negativo due e negativo un PI, preimpostare il Rotarod con i parametri del protocollo di allenamento appropriati e ripetere l'esperimento Rotarod. Inizia spostando le gabbie contenenti topi SJL femmine di quattro o sei settimane dal rack a uno spazio di lavoro confortevole.

Utilizzare i punzoni per le orecchie per contrassegnare i topi per consentire la valutazione individuale della malattia clinica e istologica. Quindi, aspirare 30 microlitri di TMEV che infetta il brodo in PBS in un ago per siringa da insulina calibro 29. Preparare la macchina per gas anestesiologici assicurandosi della presenza di quantità adeguate di ossigeno e isoflurano per tutta la durata della procedura.

Posizionare l'animale nella camera di induzione e sigillare la parte superiore. Dopo alcuni minuti, rimuovere l'animale dalla camera e testare il mouse pizzicando il cuscinetto del piede per garantire un'anestesia adeguata. Successivamente, pulire il sito di iniezione con alcol isopropilico al 70% e iniettare i 30 microlitri di TMEV infettante nell'emisfero cerebrale destro mediante iniezione a mano libera.

Infine, riporta il mouse nella sua gabbia di contenimento una volta che è completamente vigile e mobile. Il settimo giorno dopo l'infezione, preimpostare il Rotarod con i parametri sperimentali appropriati e ripetere l'esercizio completo di addestramento Rotarod con i parametri del protocollo sperimentale appropriati. Dopo la terza prova di ogni giorno, pesare ogni topo e prendere nota del peso corporeo sulla scheda tecnica.

Testa i topi due volte a settimana per le successive sei settimane allo stesso modo. Dopo sei settimane, testare i topi una volta alla settimana con lo stesso protocollo sperimentale per una media di 150 giorni sperimentali. Successivamente, analizza i dati grezzi ed esprimili come indice funzionale neurologico, o NFI.

Per determinare il valore NFI individuale, calcolare la soglia di prestazione basale di ciascun mouse come media di tutti i tempi di esecuzione da 15 a 45 giorni dopo l'infezione. Al fine di consentire la valutazione delle prestazioni motorie a seguito di demielinizzazione progressiva ed escludere eventuali deficit concomitanti dovuti ad encefalite precoce. Quindi, calcolare il valore NFI come la media dei tre tempi di corsa medi più recenti divisa per la soglia di prestazioni di base del mouse.

Infine, calcolare un NFI rettificato dividendo il valore NFI per il valore NFI medio ottenuto dal gruppo trattato in modo fittizio in quel giorno specifico. Questa figura mostra che i topi infetti da TMEV mostrano deficit neurologici significativamente aumentati nel tempo rispetto ai topi di controllo. L'infezione cronica con due diversi ceppi di TMEV ha influenzato negativamente i tempi di esecuzione dei topi.

Entrambi i gruppi di topi infetti da TMEV avevano valori NFI significativamente più bassi rispetto a quelli dei topi fittizi. Inoltre, non c'era differenza nel confrontare la progressione della disabilità nei topi infettati con il ceppo BeAn e quelli infettati con il ceppo DA in tutti i momenti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire i tradizionali metodi di punteggio visivo, come il test del riflesso di raddrizzamento, al fine di valutare rapidamente la salute generale nei topi.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della sclerosi multipla e delle malattie neurodegenerative per testare l'efficacia delle terapie e di altri interventi nel ritardare la disabilità progressiva. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la disabilità progressiva a lungo termine nei topi. Questa procedura non è solo utile per rilevare la disabilità neurologica progressiva nel modello di virus Theiler, ma è anche utile per scoprire menomazioni in altri modelli murini di malattie neurodegenerative.