Misurare Progressive neurologico disabilità in un modello murino di sclerosi multipla
November 14th, 2016
In questo documento viene presentato un protocollo di test ottimizzato per il test delle prestazioni Rotarod, utilizzato per misurare la disabilità neurologica progressiva nei topi infetti da TMEV.
L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la progressiva compromissione neurologica nei topi con malattie demielinizzanti croniche. A tal fine, offriamo raccomandazioni di parametri di test adatti allo studio della disabilità neurologica a lungo termine nel modello di sclerosi multipla progressiva del virus di Theilers, utilizzando il test Rotarod. Questa procedura fornisce una linea di base rispetto alla quale valutare la rilevanza del modello murino per la demielinizzazione progressiva ed è utile per testare terapie volte a trattare condizioni neurologiche progressive come la sclerosi multipla.
Il vantaggio di questo test ottimizzato rispetto al tradizionale sistema di punteggio visivo è che genera una variabile oggettiva per quantificare l'effetto a lungo termine delle terapie e delle procedure sperimentali sulle funzioni motorie. A dimostrare questa procedura sarà Darlene Royce, un tecnico del laboratorio di neuroimmunologia di Dartmouth. Al fine di valutare la coordinazione dell'equilibrio di base e il controllo motorio, iniziare il protocollo di adattamento cinque giorni prima dell'infezione da TMEV consentendo prima ai topi di acclimatarsi alla sala di prova per almeno 30 minuti.
Mentre i mouse si acclimatano, preimposta il Rotarod con i parametri di allenamento meno cinque DPI. Quindi, prendi un topo per la coda e posizionalo sull'asta rivolto lontano dall'operatore. Se il mouse cade o salta, riposizionalo nella sua corsia sul Rotarod finché tutti i mouse non sono in posizione.
Dopo aver caricato tutti e quattro i topi, premere il pulsante Invio per avviare l'esperimento. Assicurarsi che i timer si avviino automaticamente e osservare le rotazioni al minuto sul display per ogni corsia. Quindi, man mano che ogni animale cade dall'asta, registra la velocità dell'asta al momento della caduta, nonché la durata del tempo in cui l'animale è rimasto sull'asta.
Dopo che tutti i topi sono caduti, usa un fazzoletto per rimuovere eventuali boli fecali e urina dall'asta poiché la presenza di urina e materiale fecale può influire sulla capacità dei topi di afferrare correttamente l'asta. Dopo un riposo di tre minuti, dare ai topi una seconda e poi una terza prova in cui il tempo massimo per singola prova è di 240 secondi. Somministrare un totale di tre prove durante ogni giorno di test.
Infine, riporta i topi nella loro gabbia di casa. Nei giorni negativo quattro, negativo tre, negativo due e negativo un PI, preimpostare il Rotarod con i parametri del protocollo di allenamento appropriati e ripetere l'esperimento Rotarod. Inizia spostando le gabbie contenenti topi SJL femmine di quattro o sei settimane dal rack a uno spazio di lavoro confortevole.
Utilizzare i punzoni per le orecchie per contrassegnare i topi per consentire la valutazione individuale della malattia clinica e istologica. Quindi, aspirare 30 microlitri di TMEV che infetta il brodo in PBS in un ago per siringa da insulina calibro 29. Preparare la macchina per gas anestesiologici assicurandosi della presenza di quantità adeguate di ossigeno e isoflurano per tutta la durata della procedura.
Posizionare l'animale nella camera di induzione e sigillare la parte superiore. Dopo alcuni minuti, rimuovere l'animale dalla camera e testare il mouse pizzicando il cuscinetto del piede per garantire un'anestesia adeguata. Successivamente, pulire il sito di iniezione con alcol isopropilico al 70% e iniettare i 30 microlitri di TMEV infettante nell'emisfero cerebrale destro mediante iniezione a mano libera.
Infine, riporta il mouse nella sua gabbia di contenimento una volta che è completamente vigile e mobile. Il settimo giorno dopo l'infezione, preimpostare il Rotarod con i parametri sperimentali appropriati e ripetere l'esercizio completo di addestramento Rotarod con i parametri del protocollo sperimentale appropriati. Dopo la terza prova di ogni giorno, pesare ogni topo e prendere nota del peso corporeo sulla scheda tecnica.
Testa i topi due volte a settimana per le successive sei settimane allo stesso modo. Dopo sei settimane, testare i topi una volta alla settimana con lo stesso protocollo sperimentale per una media di 150 giorni sperimentali. Successivamente, analizza i dati grezzi ed esprimili come indice funzionale neurologico, o NFI.
Per determinare il valore NFI individuale, calcolare la soglia di prestazione basale di ciascun mouse come media di tutti i tempi di esecuzione da 15 a 45 giorni dopo l'infezione. Al fine di consentire la valutazione delle prestazioni motorie a seguito di demielinizzazione progressiva ed escludere eventuali deficit concomitanti dovuti ad encefalite precoce. Quindi, calcolare il valore NFI come la media dei tre tempi di corsa medi più recenti divisa per la soglia di prestazioni di base del mouse.
Infine, calcolare un NFI rettificato dividendo il valore NFI per il valore NFI medio ottenuto dal gruppo trattato in modo fittizio in quel giorno specifico. Questa figura mostra che i topi infetti da TMEV mostrano deficit neurologici significativamente aumentati nel tempo rispetto ai topi di controllo. L'infezione cronica con due diversi ceppi di TMEV ha influenzato negativamente i tempi di esecuzione dei topi.
Entrambi i gruppi di topi infetti da TMEV avevano valori NFI significativamente più bassi rispetto a quelli dei topi fittizi. Inoltre, non c'era differenza nel confrontare la progressione della disabilità nei topi infettati con il ceppo BeAn e quelli infettati con il ceppo DA in tutti i momenti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire i tradizionali metodi di punteggio visivo, come il test del riflesso di raddrizzamento, al fine di valutare rapidamente la salute generale nei topi.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della sclerosi multipla e delle malattie neurodegenerative per testare l'efficacia delle terapie e di altri interventi nel ritardare la disabilità progressiva. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la disabilità progressiva a lungo termine nei topi. Questa procedura non è solo utile per rilevare la disabilità neurologica progressiva nel modello di virus Theiler, ma è anche utile per scoprire menomazioni in altri modelli murini di malattie neurodegenerative.
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Panoramica
Questo documento presenta un protocollo di test ottimizzato per il test delle prestazioni Rotarod, mirato a misurare la disabilità neurologica progressiva nei topi infetti da TMEV. La procedura è progettata per valutare il danno neurologico a lungo termine associato a malattie demielinizzanti croniche.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Neurologia
- Neuroimmunologia
Sfondo
- Il test Rotarod è utilizzato per valutare le funzioni motorie nei topi.
- Le malattie demielinizzanti croniche, come la sclerosi multipla, influenzano la coordinazione motoria.
- Il modello del virus di Theilers è rilevante per lo studio delle condizioni neurologiche progressive.
- I sistemi di punteggio tradizionali mancano di oggettività nel misurare la funzione motoria.
Obiettivo dello studio
- Fornire un protocollo standardizzato per valutare il danno neurologico nei topi.
- Stabilire una linea di base per valutare l'efficacia delle terapie.
- Migliorare l'obiettività delle valutazioni della funzione motoria.
Metodi utilizzati
- Protocollo ottimizzato del test delle prestazioni Rotarod.
- Acclimatazione dei topi all'ambiente di test prima dell'infezione da TMEV.
- Valutazione dell'equilibrio, della coordinazione e del controllo motorio.
- Confronto dei risultati con i metodi di punteggio visivo tradizionali.
Risultati principali
- Il protocollo ottimizzato fornisce una misura affidabile della funzione motoria.
- Consente una quantificazione obiettiva degli effetti a lungo termine dei trattamenti.
- Ha dimostrato efficacia nella valutazione del danno neurologico progressivo.
- Facilita una migliore comprensione degli impatti terapeutici sulle funzioni motorie.
Conclusioni
- Il test Rotarod ottimizzato è uno strumento prezioso per studiare le disabilità neurologiche.
- Offre un approccio più oggettivo rispetto ai metodi tradizionali.
- Questo protocollo può aiutare nello sviluppo di terapie per la sclerosi multipla.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Objective quantification of progressive neurological disability is critical for de-risking therapeutic candidates in preclinical MS models. The Rotarod test provides a continuous, measurable endpoint that enhances predictive confidence in target validation and supports go/no-go decisions in discovery pipelines. Standardized parameters improve cross-laboratory reproducibility, enabling reliable translational biomarker alignment and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying motor function decline as a functional readout of demyelination.
- Operational Value: Provides objective, continuous data reducing inter-rater variability and supporting mechanistic de-risking of targets.
- Predictive Value: Supports preclinical model selection by demonstrating disease-relevant motor impairment progression over time.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Defined training and testing parameters ensure reproducible baseline establishment prior to compound evaluation.
- Quantitative Output: Generates neurological functional index (NFI) enabling dose-response analysis and therapeutic effect measurement.
- Scalability: Protocol supports longitudinal testing over 150+ days, facilitating chronic dosing studies and therapeutic window assessment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models chronic-progressive demyelination similar to human MS, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal tracking of disability from early infection through advanced disease stages.
- Risk-Adjusted Advancement: NFI normalization against sham controls allows for standardized comparison across studies and therapeutic interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The Rotarod assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, providing a functional bridge between molecular mechanisms and phenotypic outcomes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking genetic or pharmacological interventions to measurable motor performance changes.
- Screening: Enables standardized, reproducible compound screening with defined temporal windows for acute and chronic effect assessment.
- Analytics: NFI calculation provides a normalized, quantitative readout for comparing therapeutic efficacy across time points and study groups.
- Translational Research: Connects motor function outcomes to disease progression modeling, supporting biomarker qualification efforts.
- Enterprise Reuse: Standardized SOP enables reuse across multiple therapeutic areas involving motor dysfunction, including ALS and spinal cord injury models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing objective, quantifiable motor function data in progressive disease models.
- Operational Value: Standardized parameters enhance reproducibility across sites and reduce variability in longitudinal studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by enabling early detection of therapeutic effects on functional decline.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization through standardized disability metrics that inform preclinical advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, behavioral testing, and neuroimmunological disease models.
- Dependent on calibrated Rotarod instrumentation with precise speed and acceleration control.
- Necessitates cross-team standardization of training protocols, trial numbers, and data processing procedures.
- Adaptation considerations include adjusting rod diameter and speed for different mouse strains or age cohorts.
- Practical limitations include potential confounding effects from non-motor deficits such as fatigue or motivation, necessitating complementary assays.
