Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo
19 dicembre 2016
Vi presentiamo un protocollo per studiare le interazioni umane endoteliali-periciti in mouse utilizzando una variazione del saggio spina angiogenesi gel matrice.
L'obiettivo generale di questo test su gel di matrice in vivo è studiare l'interazione delle cellule endoteliali con i parassiti. Questo test matrigel è progettato per aiutare i ricercatori a studiare le fasi principali dell'androgenesi. Consentirà inoltre l'identificazione delle vie di segnalazione responsabili dei passaggi principali nella formazione dei vasi sanguigni, nonché dei geni la cui disfunzione può portare a disturbi vascolari e altre aberrazioni dell'androgenesi.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di studiare la formazione dei vasi sanguigni in vivo che coinvolge sia le cellule endoteliali che le loro cellule di supporto, i periciti. Per iniziare, coltiva colture di cellule endoteliali umane e di parassiti su piastre da 100 millimetri con 10 millilitri di terreno appropriato. Cambiare il supporto ogni due o tre giorni fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza.
Per preparare la soluzione di gel per matrice da miscelare con le cellule, scongelare una scorta di gel per matrice durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi preparare aliquote da 1,5 millilitri per la conservazione a -20 gradi Celsius a lungo termine, o a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Ogni tappo sperimentale richiederà 200 microlitri di gel per matrici.
Quindi un tubo immagazzinato può fornire sei tappi con un eccesso del 25%. Preparare ogni aliquota necessaria per l'uso aggiungendo 15 microlitri di brodo 100x beta-FGF scongelato. Miscelare il beta-FGF in soluzione mediante pipettaggio, quindi incubare su ghiaccio per almeno 30 minuti prima di aggiungere le cellule.
A questo punto, raffreddare alcune siringhe da insulina da 28 cc per le iniezioni. Per raccogliere le cellule dalle piastre di coltura, rimuovere il terreno e lavare le cellule una volta con PBS. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina e rimettere le piastre nell'incubatore per un minuto.
Quindi, pipettare due millilitri di terreno di coltura sulle piastre per staccare le cellule e raccogliere il terreno in una provetta da 15 millilitri. Ora, controlla la concentrazione delle collezioni utilizzando un emocitometro. Quindi, preparare aliquote di cellule in provette da 15 millilitri.
Per il gruppo sperimentale viene utilizzata una combinazione di un milione di cellule endoteliali e 200.000 parassiti. Quindi, centrifugare le aliquote cellulari a 400 g per cinque minuti. Quindi, aggiungere il volume calcolato di gel della matrice al pellet cellulare e mescolare con un pipettaggio delicato in modo che non si formi schiuma, poiché non è possibile iniettare bolle d'aria.
Ora tieni i preparati sul ghiaccio fino a quando i topi non sono pronti per l'iniezione. Dopo aver anestetizzato un topo con isoflurano e aver confermato lo stato anestetizzato con un pizzico di dita, collegare il topo al sistema di non respirazione che fornisce isoflurano e posizionarlo sul termoforo, con il lato ventrale rivolto verso il basso. Ora rimuovi circa un centimetro quadrato di peli da entrambe le regioni posteriori laterali.
Quindi, pulire la pelle esposta con alcol al 70%. Quindi, caricare un millilitro della soluzione cellulare preparata in una siringa refrigerata, che è sufficiente per quattro tappi. Per effettuare un'iniezione, sollevare la pelle della schiena per localizzare lo spazio sottocutaneo.
Quindi iniettare lentamente 200 microlitri in modo uniforme nello spazio sottocutaneo posteriore della gabbia toracica e rimuovere lentamente l'ago per evitare perdite. Dopo l'iniezione, si formerà una protuberanza nel sito. Pulisci il sito con alcool, quindi delinea la protuberanza con un pennarello indelebile in modo che possa essere trovata in seguito.
Quindi, ripeta la procedura di iniezione sull'altro lato del mouse. Assicurati di iniettare tutte le cellule entro tre minuti o inizieranno ad attaccarsi alla siringa. La fase di iniezione è fondamentale per garantire che il tappo in gel della matrice si formi tra la pelle e gli strati muscolari in modo che il tappo mantenga una buona forma e non si diffonda.
Prima di procedere all'iniezione del mouse successivo, lasciare che il mouse iniettato rimanga sul termoforo per un minuto per dare alla matrice il tempo di gelificare. Dopo l'eutanasia, posizionare il mouse sulla fase operativa. Dopo aver rimosso i peli ricresciuti dal sito di iniezione, trovare le linee di marcatura che identificano la posizione del tappo.
Quindi, usando le forbici chirurgiche sottili, praticare un'incisione lungo il bordo segnato del tappo, perpendicolare alla pelle e attraverso il muscolo sottostante. Tagliare con cura intorno alla periferia del bordo segnato. Quindi rimuovere il tappo, tenendolo inserito tra la pelle e gli strati muscolari.
Sciacquare immediatamente il tappo in un piccolo bicchiere di PBS per rimuovere il sangue. Quindi, posizionare l'intero tappo in un tubo da 50 millilitri con 25 millilitri di paraformaldeide al 4%. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 24 ore senza alcuna agitazione.
Il giorno successivo, trasferire le spine in 25 millilitri di etanolo al 70% per 24 ore. Quindi, procedere con l'inclusione di paraffina. Sezioni di tappi contenenti solo cellule endoteliali mostrano che alcuni vasi non vengono perfusi con il sangue dell'ospite dopo 14 giorni in vivo.
Al contrario, i tappi contenenti sia cellule endoteliali che parassiti, mostrano molti vasi perfusi dopo 14 giorni in vivo. Questi tappi hanno cellule positive per la colorazione dell'actina della muscolatura liscia, viste in rosso, immediatamente adiacenti alle cellule endoteliali CD31 positive, viste in verde. Pertanto, i parassiti possono svolgere un ruolo sostanziale nella formazione dei vasi sanguigni nascenti.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare questa potente tecnica in vivo per studiare la formazione dei vasi sanguigni in uso in più tipi di cellule. Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori per esplorare vari argomenti di biologia vascolare in modelli murini. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire anche altri metodi, come la PCR quantitativa e l'immunoblotting occidentale, per rispondere a ulteriori domande come i cambiamenti nell'espressione genica e la proteomica.
Questa potente tecnica consentirà allo sperimentatore di studiare in vivo come le cellule endoteliali e i parassiti interagiscono durante la formazione dei vasi sanguigni. Che è un passaggio fondamentale nell'androgenesi. Questa potente tecnica consentirà inoltre allo sperimentatore di studiare altre interazioni cellula-cellula rilevanti per la comprensione delle malattie vascolari come l'ipertensione polmonare, tra le altre.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un metodo per studiare le interazioni endoteliali-pericitarie umane in vivo mediante un saggio di angiogenesi basato su un gel matrice. Il saggio ha lo scopo di chiarire le vie di segnalazione coinvolte nella formazione dei vasi sanguigni e di identificare i geni associati ai disturbi vascolari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Angiogenesi
- Interazioni cellulari
- Biologia vascolare
Sfondo
- L'interazione tra cellule endoteliali e periciti è fondamentale per la stabilità dei vasi sanguigni.
- Comprendere queste interazioni può fornire informazioni sui disturbi vascolari.
- Il saggio del coagulo di gel matrice consente l'osservazione in vivo di questi processi.
- Studi precedenti hanno evidenziato l'importanza delle vie di segnalazione nell'angiogenesi.
Scopo dello studio
- Studiare le interazioni tra endotelio e periciti.
- Identificare le vie di segnalazione coinvolte nella formazione dei vasi sanguigni.
- Esplorare i geni che possono portare a disturbi vascolari quando disfunzionali.
Metodi Utilizzati
- Saggio in vivo con gel di matrice.
- Coltura di cellule endoteliali e periciti umani.
- Osservazione della formazione dei vasi sanguigni.
- Analisi delle vie di segnalazione e dell'espressione genica.
Risultati principali
- Stabilimento con successo di interazioni endotelio-pericito in vivo.
- Identificazione delle principali vie di segnalazione coinvolte nell'angiogenesi.
- Informazioni sui geni associati ai disturbi vascolari.
- Dimostrazione dei vantaggi del saggio con tappo di gel di matrice.
Conclusioni
- Il saggio del coagulo di gel matrice è efficace per lo studio delle interazioni endoteliali-pericitarie.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della formazione dei vasi sanguigni.
- Implicazioni potenziali per strategie terapeutiche rivolte ai disturbi vascolari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo saggio in vivo con gel matrice a tampone colma una lacuna fondamentale nella ricerca sull'angiogenesi, consentendo lo studio delle interazioni umane tra endotelio e periciti all'interno di un microambiente fisiologico, essenziale per ridurre i rischi nella validazione dei bersagli vascolari e migliorare l'affidabilità predittiva dei modelli preclinici. Il saggio supporta studi meccanicistici sulla maturazione dei vasi sanguigni e sul reclutamento dei periciti, offrendo rilevanza traslazionale per le patologie vascolari polmonari e sistemiche. Complementa i sistemi in vitro esistenti fornendo letture funzionali come la formazione di vasi perfusi e la copertura da parte dei periciti, direttamente applicabili ai flussi di lavoro di validazione dei bersagli e di identificazione dei composti promettenti nella ricerca e sviluppo biofarmaceutica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche riguardanti la segnalazione endotelio-pericito nella maturazione vascolare.
- Valore operativo: Fornisce un sistema rilevante per la malattia per valutare l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso in vivo.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando il ruolo funzionale dei periciti nella stabilità e nella perfusione dei vasi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi basati sull'istologia, inclusi lunghezza, numero, dimensione dei vasi e copertura pericitaria, per analisi comparative.
- Valore operativo: Fornisce letture vascolari standardizzate e riproducibili, adatte alla validazione dei saggi e ai processi di screening di composti.
- Valore scientifico: Consente la preparazione di sistemi biologici validati per la valutazione successiva di candidati angiogenici o anti-angiogenici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Offre un modello rilevante per la malattia per lo studio di disturbi vascolari come l'ipertensione polmonare, mediante l'impianto di cellule umane in topi immunodepressi.
- Valore operativo: Facilita l'allineamento traslazionale dei biomarcatori collegando la copertura dei periciti e la maturazione dei vasi ai risultati funzionali.
- Valore scientifico: Sostiene la continuità preclinica consentendo la valutazione di interventi genetici o farmacologici sulla formazione della rete vascolare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica, in particolare per programmi di biologia vascolare che richiedono una validazione funzionale di meccanismi angiogenetici o di stabilizzazione dei vasi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'osservazione della comunicazione endotelio-pericito in un microambiente vivente.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso la formazione standardizzata di tappi, fissazione e sezione per analisi istologica quantitativa.
- Analisi: Fornisce parametri morfometrici e basati sulla perfusione (dimensione dei vasi, numero, copertura da parte dei periciti, lumi contenenti globuli rossi) che consentono la valutazione comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando in vivo interazioni vascolari umane, rilevanti per l'angiogenesi polmonare e sistemica.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per studi genetici, analisi dei percorsi e campagne di scoperta di farmaci su bersagli vascolari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei bersagli vascolari attraverso l'osservazione diretta della maturazione dei vasi dipendente dai periciti.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione grazie a rapporti cellulari definiti, preparazione del gel della matrice e protocolli di quantificazione istologica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto fornendo dati funzionali sulla maturazione vascolare in una fase precoce del processo di scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei bersagli vascolari aggiustata in base al rischio, basata sul reclutamento dei periciti e sulla funzionalità vascolare in vivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura primaria di cellule umane, tecniche chirurgiche sterili ed elaborazione istologica.
- Dipende da modelli murini immunocompromessi (ad esempio, SCID) e dall'accesso a gel di matrice, marcatori di perfusione e reagenti per immunohistochimica.
- Necessita di standardizzazione tra gruppi diversi per la preparazione delle cellule, la costanza delle iniezioni e l'analisi istologica in cieco.
- Le considerazioni per l'adattamento includono fonti cellulari specifiche per specie, tipi di periciti e test di composti angiogenici versus anti-angiogenici.
- I limiti pratici comprendono la durata del saggio di 14 giorni, la variabilità nel recupero del plug e la dipendenza dall'analisi istologica a fine sperimentazione piuttosto che da imaging in tempo reale.
