Name: Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Scopri le interazioni endoteliali-pericitarie umane in vivo con l'assay a tappo di gel di matrice nel topo. Questo metodo identifica vie di segnalazione e geni associati a disturbi vascolari.

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Il Dr. K. Yuan è stato supportato da un American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) e dal Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Il Dr. V. de Jesus Perez è stato supportato da un premio per lo sviluppo della carriera dalla Robert Wood Johnson Foundation, un premio NIH K08 HL105884-01, un premio dell'Associazione per l'ipertensione polmonare, un premio per la ricerca biomedica dall'American Lung Association e un premio per la ricerca traslazionale e la medicina applicata premio dell'Università di Stanford.

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Stanford University School of Medicine. NOTA: Gli animali sono sotto anestesia con il 3% isoflurano vaporizzatore e fornitura 3% di O 2 gas. L&#39;uso del veterinario pomata sugli occhi può aiutare a prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. 1. Preparazione delle cellule <ol><li> Crescere endoteliali e cellule pericyte culture umane in piastre da 100 mm con 10 ml di supporto appropriato. Sostituire 10 ml di mezzo fresco ogni 2 - 3 giorni fino cellule raggiungono l&#39;80% di confluenza. <ol><li> cellule endoteliali cultura (ECS) in supporto completo delle cellule endoteliali (ECM) integrato con la società forniti 5% di siero fetale bovino (FBS), il 10% di penicillina / streptomicina e 10% supplemento di crescita delle cellule endoteliali. </li><li> periciti cultura in mezzi pericyte completa (PM) integrato con società forniti 2% FBS, 10% di penicillina / streptomicina e 10% supplemento di crescita pericyte. </li&gt; </ol></li><li> Preparare miscele di cellule <ol><li> Calcolare il numero di cellule necessario per i gruppi trattati e di controllo. NOTA: Ogni plug nel gruppo sperimentale contiene un milione (1 x 10 6) EC umana e duecentomila (2 x 10 5) periciti. Per il gruppo di controllo, ogni spina contiene solo 1,2 milioni di EC umani. Il gruppo di controllo negativo ha solo gel matrice. Ogni gruppo deve comprendere almeno quattro spine, che richiederebbero due topi come spine possono essere iniettati in ogni lato di un topo parte bassa della schiena. Tre spine servirebbero come triplice copia per l&#39;esperimento e il quarto potrebbero essere utilizzati nel caso in cui uno non riesce. Preparare 25% in più celle in base al volume extra di gel. </li><li> Raccogliere e contare le cellule da piastre di coltura. <ol><li> Per staccare cellule, rimuovere il supporto e lavare una volta con 1x temperatura ambiente tampone fosfato salino (PBS). Rimuovere PBS, aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina / 2.21 mM EDTA e incubare per 1 min. Lavare le cellule la piastra con l&#39;aggiunta di 2medio ml e raccogliere in una provetta da 15 ml. </li><li> Conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Centrifugare il numero appropriato di celle in una pallina a 400 xg per 5 min. Per il gruppo sperimentale, centrifuga sia ECS e periciti giù insieme in un unico pellet. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Matrix Gel di Preparazione <ol><li> Scongelare gel matrice completamente a 4 ° C per 4 ore o durante la notte per ottenere una soluzione omogenea. Non è necessaria alcuna miscelazione. </li><li> Aliquota gel matrice provette da 1,5 ml e conservare a 4 ° C. </li><li> Pre-freddo sterili provette da 1,5 ml e 28 G 1 siringhe da insulina cc a 4 ° C. Attenzione: Mantenere il gel matrice sul ghiaccio in ogni momento. </li><li> Mescolare gel matrice freddo con bFGF in un rapporto volumetrico di 1: 100 (concentrazione finale di bFGF = 0,5 mg / ml; bFGF di soluzione = 50 pg / ml) Dopo miscelazione soluzione di gel matrice pipettando su e giù parecchie volte, incubare su ghiaccio per il 30 - 60 min before miscelazione con le cellule in fase 3.1. NOTA: Scongelare lo stock bFGF prima della miscelazione. Calcolare il numero di tasselli necessari per l&#39;iniezione. Per esempio, ogni plug richiede 200 gel matrice ul. Pertanto, la preparazione del 25% gel in più. </li></ol> 3. Matrix Gel Mix con cellule <ol><li> Per ogni gruppo, risospendere il pellet cellulare (contenente il numero di cella appropriata) con il volume calcolato di gel matrice contenente bFGF. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma e lasciare in tubo da 15 ml in ghiaccio fino topi sono preparati per l&#39;iniezione. </li></ol> 4. Preparazione del mouse <ol><li> Anestetizzare 1 topi SCID per 5 min a 3% isoflurano + 3% O 2 in una camera di induzione. Focus su un gruppo sperimentale, o 2 topi, alla volta. </li><li> Rimuovere il mouse dalla camera di induzione, posto su un lato ventrale piastra elettrica verso il basso e collegare rapidamente un ugello muso al volto del topo mediante un sistema non-rirespirazione per la fornitura di anestesia in tutto il InjeProcedura ction. Passare il flusso di gas dalla camera di induzione al sistema antireflusso e abbassare la pressione del gas al 1,5% isoflurano e 1,5% O 2. </li><li> Rimuovere i capelli da entrambe le regioni posteriori laterali (circa 1 cm di diametro) con una crema di rimozione rasoio o dei capelli. </li><li> Pulire la zona della pelle con un tampone imbevuto di alcool al 70%. </li><li> Ritorna il mouse per la camera di induzione e ripetere i passaggi 4,2-4,4 con il secondo mouse. </li></ol> 5. Matrix Gel iniezione <ol><li> Preparare un mouse per l&#39;iniezione collegando al sistema di non-rirespirazione e l&#39;immissione sul lato ventrale rilievo di riscaldamento verso il basso. </li><li> Caricare il gel matrice in un pre-raffreddata 28 G 1 cc siringa di insulina un mouse alla volta. <ol><li> Caricare il completo volume di 500 ml di gel di matrice per due tasselli (200 pl per alveolo più il 25% in più) nella siringa. </li><li> Assicurarsi di iniettare il gel matrice nei topi nel raggio di 3 min di caricare le cellule nella siringa per evitare che il ceLLS da stabilirsi al lato della siringa ed evitare gel matrice solidifichi all&#39;interno della siringa. </li></ol></li><li> Sollevare la pelle torna per individuare lo spazio sottocutaneo, quindi iniettare 200 ml di gel di matrice lentamente e in modo uniforme nello spazio sottocutaneo del posteriore posteriore della gabbia toracica. </li><li> Rimuovere l&#39;ago per l&#39;iniezione lentamente, facendo attenzione a evitare che il gel matrice fuoriuscita del sito di iniezione. Un urto formerà nel sito di iniezione. Pulire sito di iniezione con un tampone di alcool. </li><li> iniezione Ripetere i passi 5.2 - 5.5 dall&#39;altra parte posteriore del mouse, quindi lasciare il mouse sul retro per 1 min per consentire gelificazione del gel matrice sul cuscino termico. </li><li> Outline entrambi urti con un pennarello indelebile per identificare l&#39;urto dopo 14 giorni. Dopo un po &#39;i capelli ricrescono, sarà più facile trovare l&#39;urto. </li></ol> 6. Matrix Isolamento Gel Plug: 14 giorni dopo l&#39;iniezione <ol><li> Euthanize i topi umanamente esponendo l&#39;animales per&gt; 5 min di inalazione di anidride carbonica seguita da dislocazione cervicale per assicurare la morte. </li><li> Togliere il tappo di gel di matrice dalla schiena del mouse. <ol><li> Rimuovere delicatamente i capelli ricresciuti intorno al sito di iniezione in cui la spina si trova ripetendo il passaggio 4.3. La linea di riferimento indica la dimensione di urto originale sotto la pelle. </li><li> Asportare il tappo insieme con la pelle ei muscoli circostanti strati attaccati ai lati superiore e inferiore della spina, rispettivamente. <ol><li> Utilizzando le forbici chirurgiche sottili, effettuare un&#39;incisione sul marcato confine della spina che è perpendicolare alla pelle e tagliare al muscolo sotto il tappo. Poi, accuratamente tagliato intorno alla periferia del tappo lungo il confine marcato. </li><li> Togliere il tappo, mantenendolo inserita tra gli strati della pelle e dei muscoli. Sciacquare immediatamente in un piccolo bicchiere con 1x PBS per lavare via il sangue in eccesso. La spina è ora pronta per essere fissata (passo successivo, 6.3). </li></ol></li></ol></li><li> Fissare le plug in 4% paraformaldeide. <ol><li> Inserire l&#39;intera spina, compresi gli strati cutanei e muscolari, in un tubo da 50 ml con 25 ml di paraformaldeide al 4% per 24 ore a temperatura ambiente senza dondolo. Il giorno successivo, trasferire la spina in 25 ml di etanolo al 70% per un altro 24 ore prima di paraffina. NOTA: maneggiare con cautela paraformaldeide. Indossare i guanti. </li></ol></li></ol> 7. Processo di paraffina Matrix Gel Plug <ol><li> Preparare la spina per paraffina. <ol><li> Orientare la spina come mostrato in figura 1a; inserire la spina in una cassetta tessuto in modo che il lato del tappo rivolto verso l&#39;alto ed entrambi gli strati di pelle e muscolari sono visibili attraverso la superficie del blocco di tessuto che verrà tagliato prima durante il sezionamento. </li></ol></li><li> Paraffina incorporare la spina secondo i protocolli standard di paraffina 13. </li><li> Tagliare 8 - 10 micron sezioni spesse fuori del blocco dei tessuti e montare su vetrini da microscopio according ai protocolli standard di paraffina sezionamento 13. </li><li> Conservare i vetrini in un luogo fresco e asciutto a temperatura ambiente fino al momento per la colorazione. </li></ol> 8. Le sezioni macchia con ematossilina e eosina (H &amp; E) 13 <ol><li> Sparaffinare le sezioni di tessuto passando le diapositive attraverso 100% xilene due volte, 100% di etanolo, 95% di etanolo, 70% di etanolo ed infine 1x PBS, ciascuno per 5 min a temperatura ambiente. Lasciare i vetrini in PBS 1x fino al passo successivo. </li><li> Dispensare 100 ul H &amp; E soluzione sulla sezione e incubare per 1-5 minuti, o fino a quando non vi è chiaro contrasto tra i nuclei blu e rosa citoplasma in una cella come visto sotto un microscopio ottico verticale a 10X di ingrandimento. Fare attenzione a non lasciare alcuna soluzione H &amp; E toccare l&#39;obiettivo. </li><li> Lavare H &amp; E soluzione al largo della slitta da inzuppare il vetrino in un grande bicchiere di acqua di rubinetto, quindi inserire la diapositiva in un rack nel bicchiere e sciacquare con acqua corrente per 2 minuti. </li><li> momentove al punto 9.8 per montare le diapositive. </li></ol> 9. Stain altre diapositive per Capillari umani e periciti <ol><li> Sparaffinare le sezioni di tessuto passando le diapositive attraverso 100% xilene due volte, 100% di etanolo, 95% di etanolo, 70% di etanolo ed infine 1x PBS, ciascuno per 5 min a temperatura ambiente. Lasciare i vetrini in PBS 1x fino al passo successivo. </li><li> Lessare le sezioni in soluzione di antigene di recupero. <ol><li> In un becher 2 L, preparare antigene soluzione bollente recupero utilizzando 1x tampone citrato (pH 7,0) a 95 ° C su una piastra riscaldante. </li><li> Una volta ebollizione, mettere i vetrini in un rack di metallo e immergere nella soluzione di recupero dell&#39;antigene bollente per 20 minuti. </li><li> Rimuovere con cautela il bicchiere dal blocco di riscaldamento con gli scivoli ancora sommerse e consentire la soluzione per tornare lentamente a temperatura ambiente per circa 30 min. </li><li> Porre i vetrini in PBS 1x fino al prossimo passo. </li></ol></li><li> Bloccare le sezioni in tampone di bloccaggio (1x PBS, 5% di siero di capra, 0.3% Triton X-100). <ol><li> Disegnare un cerchio idrofobico intorno ai bordi di ciascuna sezione con una penna PAP. </li><li> Porre i vetrini in un vassoio di umidità con acqua distillata sul fondo del vassoio. </li><li> Dispensare 100 microlitri tampone di bloccaggio sulle sezioni assicurandosi tutto il tessuto è coperto da fluido (può richiedere più di 100 ml). </li><li> Incubare sezioni con tampone di arresto per 1 ora. </li></ol></li><li> Incubare sezioni con anticorpo primario. <ol><li> Preparare una soluzione con due anticorpi primari per sondare ogni sezione per CD31 (ECS) e actina muscolo liscio (periciti) diluito in tampone di diluizione (1x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100). NOTA: Qui, la concentrazione di anti-CD31 è 01:50 e anti-liscia concentrazione actina muscolo è 1: 300. </li><li> Incubare sezioni notte a 4 ° C con 100 microlitri anticorpi primari in un vassoio di umidità contenente acqua distillata. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini tre volte in 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) per 5 minuti ogni lavaggio. </li><li> Incubare sezioni con anticorpo secondario. <ol><li> Preparare una soluzione con una capra coniugato anticorpo secondario anti-coniglio fluoroforo per riconoscere l&#39;anticorpo di coniglio anti-CD31 diluito in tampone di diluizione. <ol><li> NOTA: L&#39;anticorpo primario actina muscolo liscio è già coniugato con un fluoroforo CY3, quindi non è necessaria alcuna colorazione anticorpo secondario. Capra anti-coniglio concentrazione di anticorpi secondario è 1: 250. </li></ol></li><li> Incubare sezioni per 1 ora con 100 microlitri anticorpo secondario nel vassoio di umidità contenente acqua distillata. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini tre volte in 1x PBST per 5 minuti ogni lavaggio. </li><li> Montare le diapositive. <ol><li> Pipettare 2 - 3 gocce (~ 40 - 60 microlitri) di antifade soluzione di montaggio con colorazione DAPI nucleare su ogni sezione. </li><li> Posizionare delicatamente un no. 1.5 coprioggetto sopra le sezioni e soluzione di montaggio, permettendo al fluido distribuito su sezioni e ai bordila polizza di copertura. usare delicatamente un dito per premere le bolle d&#39;aria che possono essere situati sulla sezione. </li><li> Lasciate che le diapositive asciugare per almeno 1 ora prima dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 10. Quantificare capillare densità e struttura 14 <ol><li> Contare il numero di capillari in H &amp; E sezioni colorate, espressa in # / mm 2. <ol><li> Acquisire le foto di quattro diversi campi su un microscopio ottico in posizione verticale sotto 40X di ingrandimento. NOTA: Capillari sono identificati come tubi riempiti di globuli rossi. </li><li> In alternativa, invece di capillari conteggio manualmente, utilizzare un&#39;immagine software di analisi (ad esempio, Wimasis Image Analysis) quantificare diversi parametri angiogenesi come il numero nave, lunghezza media nave e diametro, e punti di ramificazione. </li></ol></li><li> Analizzare struttura capillare nelle sezioni di immunofluorescenza macchiato. <ol><li> Acquisire le foto di quattro diversi campi su un microscopio a fluorescenza invertitocon il cubo filtro FITC e TxRed. <ol><li> Utilizzare un cubo FITC di immagine EC da eccitazione a 488 nm di lunghezza d&#39;onda e utilizzare un cubo TxRed di periciti immagine da eccitazione a 594 nm di lunghezza d&#39;onda. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
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Il saggio spina gel matrice ha dimostrato di essere un metodo comodo e potente per valutare regolazione genica nell&#39;angiogenesi, composti angiogenici e antiangiogenici in vivo, e per integrare test in vitro. Qui, descriviamo in dettaglio un romanzo spina saggio gel matrice dell&#39;angiogenesi umana che indaga l&#39;interazione tra cellule endoteliali e periciti durante la formazione dei vasi. Ci sono alcuni punti nuovi e critici in questo protocollo. Le cellule in bass...

L&#39;angiogenesi è il processo attraverso il quale nuovi vasi sanguigni si formano da una rete vascolare preesistente 1 ed è il centro di ricerca in corso in molti settori che vanno dallo sviluppo normale alla malattia. Questo processo dinamico coinvolge la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali (EC) e reclutamento di periciti per costruire un tubo vascolare rivolta verso il sito che ha bisogno di ossigeno e nutrienti consegna 2. Per studiare questo processo richiede un saggio altrettanto dinamico, soprattutto uno che può riassumere la natura tridimensionale di formazione del tubo. In vitro matrice 3D sono state sviluppate per rispondere a questa esigenza e hanno lavorato bene per consentire ai ricercatori di definire i passi discreti nello spazio e nel tempo in cui si svolge l&#39;angiogenesi 3, 4, 5, 6. Tuttavia, questi modelli di matrici in vitro 3D sono limitati a studiare i vasi non perfuso und pertanto mancano componenti critici pertinenti al processo di angiogenesi (ad esempio, la crescita e fattori inibitori, tensione innaturale / forze che circola attraverso il letto vascolare) e non riescono a simulare l&#39;ambiente complesso presente nel tessuto vivo. Per far fronte a questa limitazione, diversi saggi di angiogenesi in vivo sono stati sviluppati 7, tra cui il saggio spina gel matrice che sarà al centro della nostra relazione 8, 9. Il saggio spina gel matrice è un vivo test consolidata nell&#39;angiogenesi che fa appello a ricercatori in quanto fornisce una solida piattaforma per testare i ruoli delle diverse cellule e sostanze nell&#39;angiogenesi. Gel Matrix è una soluzione membrana basale disponibile in commercio che viene secreto dalla linea cellulare del mouse sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) che si solidifica in un materiale simile a gel a 37 ° C. Il gel matrice può essere miscelata con cellule e / o sostanze, quali fattori di crescita, e injeCTED per via sottocutanea nel mouse. L&#39;host EC invaderà la spina più di 14 giorni, formare una rete vascolare, e diventare perfusi con sangue dell&#39;ospite. Fino ad oggi, le analisi dei plug gel matrice si sono concentrati esclusivamente sullo studio del comportamento delle cellule endoteliali durante l&#39;angiogenesi, tuttavia, al meglio delle nostre conoscenze nessuno sforzo è stato ancora fatto per determinare se questo test può essere utilizzato cellule endoteliali di co-coltura e periciti per studiare come questi due tipi di cellule interagiscono durante l&#39;angiogenesi. In particolare, la comprensione del rapporto tra EC e periciti è prezioso per lo studio di malattie in cui la perdita dei vasi sanguigni è patologico, tra cui l&#39;ischemia microvascolare e malattia vascolare periferica 10, 11, 12. Qui, descriviamo un protocollo che introduce periciti di derivazione umana alla miscela di gel matrice con EC umana e il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Questa miscela può essere iniettata per via sottocutanea in dorso di topi SCID per consentire la formazione di, rivestito periciti, vasi ibridi completamente funzionale. Il nostro protocollo descrive come preparare i tappi di gel matrice contenente cellule endoteliali umane con o senza periciti umani, il posizionamento in topi SCID e come analizzare le sezioni istologiche per gli endpoint angiogenesi critici.

<table><tbody><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina/0,53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kit di terreni cellulari endoteliali (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>include terreni, supplemento per la crescita EC e penicillina/streptomicina, ciascuno fornito al volume appropriato per una facile miscelazione</td></tr><tr><td>Kit di terreni pericitici (PM)</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>include terreni, integratore per la crescita dei periciti e penicillina/streptomicina, ciascuno fornito al volume appropriato per una facile miscelazione</td></tr> delle <tr><td>cellule endoteliali microvascolari polmonari umane primarie</td> Iniziativa rivoluzionaria per <td>l'ipertensione polmonare Questo</td><td></td><td>tipo di cellula è disponibile anche in commercio. Cellule utilizzate al passaggio 1-4</td></tr><tr><td>periciti polmonari umani primari</td> Iniziativa <td></td> di <td>svolta per l'ipertensione polmonare</td><td>Questo tipo di cellula non è disponibile in commercio, ma i pariciti cerebrali lo sono. Cellule utilizzate al passaggio 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (fattore di crescita basico dei fibroblasti)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>la soluzione madre è 50 &mu; g/ml in 0,1% BSA in PBS, aliquote a 50 &mu; l e conservato a -20 gradi</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Insluin Siringa</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Grave Combined Immune Deficiency) topi</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD. Il ceppo SCID IL2R gamma knockout è il ceppo migliore; 4-6 settimane di età</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml, sterili</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Provette con tappo a vite da 15 ml, sterili</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>emocitometro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria Nair</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticorpo primario CD31 umano</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>la soluzione di lavoro è l'anticorpo fluorescente primario 1:50</td></tr><tr><td>anti-muscolo liscio umano actina CY3</td> La soluzione di lavoro <td>Sigma</td><td>C6198</td> è un anticorpo secondario <td>anti-coniglio di capra 1:300</td></tr><tr><td>; 488/verde</td> La soluzione di lavoro <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>è 1:250</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI</td><td>solution Cell Segnalazione</td> Vetrini per microscopio <td>8961S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>n. 1,5 vetrini coprioggetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>tampone citrato 10x</td><td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>forbici chirurgiche extra fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Formalina (paraformaldeide)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>Cassette di tessuto</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>siero di capra</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

studio in vivo di human interaction endoteliale-pericyte utilizzando la matrice di gel plug assay nel topo

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

L'angiogenesi è il processo attraverso il quale si formano nuovi vasi sanguigni da vasi esistenti. La crescita di nuovi vasi richiede la proliferazione, la migrazione e l'allineamento coordinati delle cellule endoteliali per formare strutture tubulari, seguite dal reclutamento di periciti per fornire supporto murale e facilitare la maturazione dei vasi. Gli attuali approcci di coltura cellulare in vitro non sono in grado di riprodurre completamente il complesso ambiente biologico in cui le cellule endoteliali e i periciti interagiscono per produrre vasi funzionali. Presentiamo una nuova applicazione del test in vivo su gel plug per matrice per studiare le interazioni endoteliale-pericitario e la formazione di vasi sanguigni funzionali utilizzando topi con grave mutazione combinata da immunodeficienza (SCID). In breve, il gel della matrice viene miscelato con una soluzione contenente cellule endoteliali con o senza periciti, seguito da un'iniezione nella parte posteriore di topi SCID anestetizzati. Dopo 14 giorni, i tappi in gel della matrice vengono rimossi, fissati e sezionati per l'analisi istologica. La lunghezza, il numero, le dimensioni e l'estensione della copertura pericitaria dei vasi maturi (definita dalla presenza di globuli rossi nel lume) possono essere quantificati e confrontati tra i gruppi sperimentali utilizzando piattaforme statistiche commerciali. Oltre al suo utilizzo come test di angiogenesi, questo test di tappo in gel per matrici può essere utilizzato per condurre studi genetici e come piattaforma per la scoperta di farmaci. In conclusione, questo protocollo consentirà ai ricercatori di integrare i saggi in vitro disponibili per lo studio delle interazioni endoteliale-pericitario e della loro rilevanza per l'angiogenesi sistemica o polmonare.

Rappresentante H &amp; E e immunofluorescenza colorazione di sezioni spina gel matrice sono mostrati in Figura 2. Sezioni dalla CE solo spine mostrano alcune navi che non sono per lo più perfusi con il sangue (figura 2 in alto a sinistra, frecce nere), mentre le spine contenenti sia EC e periciti visualizzare diverse perfuso navi con diametri maggiori e copertura pericyte completo, come dimostra positivo SMA colorazione immediatamente adiacente alla EC C...

Vi presentiamo un protocollo per studiare le interazioni umane endoteliali-periciti in mouse utilizzando una variazione del saggio spina angiogenesi gel matrice.

Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

L'obiettivo generale di questo saggio in vivo con gel di matrice è studiare l'interazione tra cellule endoteliali e parassiti. Questo saggio con matrigel è stato ideato per aiutare i ricercatori a esaminare le fasi principali dell'androgenesi. Inoltre, permetterà l'identificazione dei percorsi di segnalazione responsabili delle fasi chiave della formazione dei vasi sanguigni, nonché dei geni la cui disfunzione può portare a disturbi vascolari e ad altre alterazioni dell'androgenesi.Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di studiare la formazione dei vasi sanguigni in vivo, che coinvolge sia le cellule endoteliali sia le loro cellule di sostegno, i periciti. Per iniziare, coltivare colture cellulari di cellule endoteliali umane e di parassiti su piastre da 100 millimetri con 10 millilitri del relativo terreno di coltura. Cambiare il terreno ogni due o tre giorni fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza dell'80%.Per preparare la soluzione di gel matrice da mescolare con le cellule, scongelare una provetta di gel matrice durante la notte a quattro gradi Celsius. Preparare quindi aliquote da 1,5 millilitro da conservare a meno venti gradi Celsius a lungo termine, oppure a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Ogni tampone sperimentale richiederà 200 microlitri di gel matrice.Pertanto, un tubo preparato può fornire sei piastre con un eccesso del 25%. Preparare ogni aliquota necessaria aggiungendo 15 microlitri di soluzione madre scongelata di beta-FGF 100x. Mescolare il beta-FGF nella soluzione mediante pipettaggio, quindi incubare sul ghiaccio per almeno 30 minuti prima di aggiungere le cellule.A questo punto, raffreddare alcune siringhe per insulina da 1 cc con ago da 28 gauge per le iniezioni. Per raccogliere le cellule dalle piastre di coltura, rimuovere il terreno e lavare le cellule una volta con PBS. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina e reinserire le piastre nell'incubatore per un minuto.Quindi, pipettare due millilitri di terreno di coltura sulle piastre per staccare le cellule e raccogliere il terreno in un tubo da 15 millilitri. A questo punto, verificare la concentrazione dei campioni utilizzando un emocitometro. Successivamente, preparare aliquote di cellule in tubi da 15 millilitri.Qui viene utilizzata una combinazione di un milione di cellule endoteliali e 200.000 parassiti per il gruppo sperimentale. Successivamente, centrifugare gli aliquote cellulari a 400g per cinque minuti. Poi, aggiungere il volume calcolato di gel matrice al pellet cellulare e mescolare delicatamente con una pipetta in modo da non formare schiuma, poiché le bolle d'aria non possono essere iniettate.Ora mantenere le preparazioni sul ghiaccio fino a quando i topi sono pronti per l'iniezione. Dopo aver anestetizzato un topo con isoflurano e aver confermato lo stato di anestesia mediante pizzicamento della zampa, fissare il topo al sistema a non-reintegrazione che fornisce isoflurano e posizionarlo sul tappetino riscaldante, con il lato ventrale rivolto verso il basso. A questo punto rimuovere circa un centimetro quadrato di pelo da entrambe le regioni laterali posteriori.Quindi, pulire la pelle esposta utilizzando alcol al 70%. Successivamente, caricare un millilitro della soluzione cellulare preparata in una siringa fredda, quantità sufficiente per quattro impianti. Per effettuare un'iniezione, sollevare la pelle del dorso per individuare lo spazio sottocutaneo.Quindi iniettare lentamente 200 microlitri in modo uniforme nello spazio sottocutaneo posteriore alla gabbia toracica ed estrarre lentamente l'ago per evitare perdite. Dopo l'iniezione, si formerà un rigonfiamento nel sito. Pulire il sito con alcol, quindi delimitare il rigonfiamento con un pennarello indelebile in modo che possa essere ritrovato in seguito.Quindi, ripetere la procedura di iniezione sull'altro lato del topo. Assicurarsi di iniettare tutte le cellule entro tre minuti, altrimenti inizieranno ad aderire alla siringa. Il passaggio dell'iniezione è fondamentale e deve essere eseguito correttamente per garantire che il tappo di gel matrice si formi tra i tessuti cutaneo e muscolare, in modo che mantenga una buona forma e non si diffonda.Prima di procedere con l'iniezione nel topo successivo, lasciare il topo iniettato sul pad riscaldato per un minuto, in modo da permettere al matrix di polimerizzarsi. Dopo l'eutanasia, posizionare il topo sul tavolo operatorio. Dopo aver rimosso qualsiasi pelo ricresciuto nel sito di iniezione, individuare le linee di marcatura che identificano la posizione del tappo.Quindi, utilizzando forbici chirurgiche fini, effettuare un'incisione lungo il bordo segnato del tassello, perpendicolarmente alla pelle e fino al muscolo sottostante. Tagliare con attenzione lungo la periferia del bordo segnato. Quindi rimuovere il tassello, mantenendolo compreso tra gli strati di pelle e muscolo.Risciacquare immediatamente il campione in un piccolo becher contenente PBS per rimuovere il sangue. Successivamente, posizionare l'intero campione in un tubo da 50 millilitri contenente 25 millilitri di paraformaldeide al 4%. Lasciare fissare a temperatura ambiente per 24 ore senza alcuna agitazione.Il giorno successivo, trasferire i tasselli in 25 millilitri di etanolo al 70% per 24 ore. Procedere quindi con l'inclusione in paraffina. Sezioni dei tasselli contenenti solo cellule endoteliali mostrano che alcuni vasi non vengono perfusi con il sangue dell'ospite dopo 14 giorni in vivo.Al contrario, i plug contenenti sia cellule endoteliali che parassiti mostrano numerosi vasi perfusi dopo 14 giorni in vivo. Questi plug presentano cellule positive alla colorazione per l'actina del muscolo liscio, visibili in rosso, immediatamente adiacenti a cellule endoteliali positive per CD31, visibili in verde. Pertanto, i parassiti potrebbero svolgere un ruolo significativo nella formazione dei nuovi vasi sanguigni.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare questa potente tecnica in vivo per studiare la formazione dei vasi sanguigni utilizzando diversi tipi cellulari. Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori per esplorare vari argomenti di biologia vascolare in modelli murini. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi, come la PCR quantitativa e il Western immunoblotting, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come i cambiamenti nell'espressione genica e nella proteomica.Questa potente tecnica permetterà al ricercatore di studiare in vivo come le cellule endoteliali e i parassiti interagiscono durante la formazione dei vasi sanguigni, un passaggio chiave nell'androgenesi. Questa potente tecnica consentirà inoltre al ricercatore di studiare altre interazioni tra cellule che sono rilevanti per comprendere malattie vascolari come l'ipertensione polmonare, tra le altre.

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Qui, descriviamo una metodologia per fornire cordone umano derivati ​​dal sangue umano endoteliali che formano colonie cellule (ECFCs) e dal midollo osseo le cellule staminali mesenchimali (MSCs), inserita in un collagene / fibronectina gel, per via sottocutanea in topi immunodeficienti. Questa cella / gel combinazione genera una rete umana vascolare che collega con la vascolarizzazione del mouse.

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In questo video, dimostriamo la visualizzazione in tempo reale delle interazioni cellula del sangue-endoteliale nelle vene mesenteriali di un modello murino iniettato per via intraperitoneale con lipopolisaccaride.

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Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Descriviamo un test matrigel plug per illustrare il potenziale angiogenico di un pool di fattori secreti dalle cellule tumorali utilizzando due modalità di imaging complementari, ecografia ed endomicroscopia. Il matrigel, un gel che imita la matrice extracellulare (ECM), viene utilizzato per introdurre l'ospite (topo) con fattori angiogenici secreti al mezzo condizionato (C.M.).

Funzionalità di monitoraggio e di Morfologia Vasculature Reclutato da fattori secreti dalle cellule a crescita rapida, la generazione di tumore

Questo manoscritto descrive un saggio di formazione di tubi per quantificare gli effetti di un dato composto o condizione sull'angiogenesi utilizzando la formazione di tubi di cellule endoteliali in un ambiente controllato.

Strategico cellule endoteliali tubo saggio Formazione: Confronto tra matrice extracellulare e fattore di crescita ridotto matrice extracellulare

Questa presenta protocollo una perlina di romanzo in vitro test che più modelli in modo appropriato il processo di in vivo l'angiogenesi di germogliatura incorporando i periciti. Questa modifica consente il dosaggio di perlina di ricapitolare più fedelmente le interazioni cellulari eterotipiche tra cellule endoteliali e cellule murale che sono critiche per l'angiogenesi.

Incorporare i periciti un tallone di cellule endoteliali Assay di germogliatura

Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere matrici 3D derivate dal fibroblasto come scaffold naturale per i successivi saggi cellulari. I fibroblasti vengono semiizzati in una piastra di coltura pretrattata e stimolati con acido ascorbico per la generazione di matrici. Le matrici vengono decellularizzate e bloccate alle cellule rilevanti di coltura (ad esempio, cellule endoteliali).

Sistema a matrice 3D derivato da fibroblasti applicabile al saggio di formazione di tubi endoteliali

Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.

In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

Il metodo qui presentato può valutare l'effetto dei reagenti sull'angiogenesi o sulla permeabilità vascolare in vivo senza colorazione. Il metodo utilizza l'iniezione di destrano-FITC attraverso la vena caudale per visualizzare i neovasi o le perdite vascolari.

Saggio modificato in vivo del gel plug della matrice per gli studi sull'angiogenesi

Scopri le interazioni endoteliali-pericitarie umane in vivo con l'assay a tappo di gel di matrice nel topo. Questo metodo identifica vie di segnalazione e geni associati a disturbi vascolari.

Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo

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