L'applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

L'obiettivo di questo intervento chirurgico è chiarire i meccanismi dell'induzione degli arti nell'embrione di pollo impedendo alle molecole segnale di diffondere dai tessuti mediali alle cellule del mesoderma della lamina laterale e studiandone l'effetto sull'espressione genica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in biologia dello sviluppo, come ad esempio quali siano i segnali induttivi che controllano l'avvio del primordio dell'arto. Il vantaggio di questa tecnica è che l'embrione di pollo è facilmente accessibile per manipolazioni chirurgiche ed è molto resistente; inoltre, il primordio dell'arto controlaterale non operato funge da controllo interno estremamente utile.

Susan Wilde illustrerà la procedura. Per iniziare, tagliare un pezzo quadrato di alluminio spesso 0,013 mm di 1 cm di lato e sterilizzarlo passandovi sopra etanolo al 70%. Successivamente, posizionare il quadrato su una piastra di Petri sterile in plastica da 6 cm.

Per evitare l'effetto elettrostatico, scartare il coperchio e crearne uno nuovo per la piastra utilizzando lo stesso foglio di alluminio. Successivamente, posizionare la piastra di Petri sopra una graticola micrometrica sotto un microscopio binoculare impostato su un ingrandimento di 1,6x. Utilizzare un bisturi con lama numero 15 per tagliare strisce di alluminio larghe 1,3 mm e lunghe 2 mm.

Separare le strisce di foglio metallico utilizzando due paia di pinzette da orologiaio numero quattro. Successivamente, piegare al centro la barriera di alluminio formando un angolo retto in modo che assomigli a una cerniera. Disporre le barriere al centro della piastra di Petri con un lato appoggiato piatto sul fondo della piastra e l'altro rivolto verso l'alto, fuori dalla piastra; preparare 20 o più barriere prima del giorno dell'intervento.

Posizionare il coperchio di alluminio sulla piastra e conservare le barriere in un luogo dove non possano essere disturbate. Tenendo l'uovo in posizione laterale, afferrare saldamente una coppia di pinzette di tipo AA ad alta forza e, con la mano libera che sostiene l'uovo, praticare un foro nell'estremità più larga dell'uovo contenente la camera d'aria mediante un movimento controllato di punta. Assicurarsi che la membrana interna del guscio sia stata perforata.

Successivamente, prendere l'uovo con entrambe le mani e ruotarlo di 180 gradi lungo il suo asse orizzontale. Poi, prendere un pezzo di nastro trasparente di circa 5 cm di lato e applicarlo accuratamente sulla superficie superiore dell'uovo per evitare che la buccia si sbricioli sull'embrione quando l'uovo verrà aperto. Utilizzare un paio di forbici curve per rompere delicatamente il guscio e le membrane cellulari interne ad esso associate al centro della parte superiore dell'uovo.

Fare un foro molto piccolo con una delle lame delle forbici in modo che l'aria possa entrare nell'uovo sopra l'embrione. Utilizzare le forbici per allargare il foro nel guscio fino a formare un cerchio con un diametro di circa 1 cm. Rimuovere questa porzione di guscio dell'uovo.

Coprire il foro sull'uovo con un pezzo di nastro trasparente di circa 5 cm quadrati. Premere il nastro in modo da farlo aderire solo al bordo del foro, lasciando il resto del nastro libero. Il nastro libero può quindi essere afferrato per aprire facilmente l'uovo.

Prendere un embrione allo stadio 15 dall'incubatrice e posizionare l'uovo su un supporto per uova sotto un microscopio binoculare impostato su un ingrandimento di 3,2x o superiore. Successivamente, rimuovere lo strato superiore di nastro trasparente. Utilizzando un microbisturi in acciaio, praticare un'incisione attraverso la membrana vitellina e il mesoderma laterale adiacente ai somiti 26-32 sul lato destro dell'embrione.

Prendere la barriera con pinzette microforza numero 5 a un'estremità e ruotare la barriera per inserire l'estremità libera nell'incisione. Appena possibile, sigillare l'uovo con del nastro trasparente e riporlo nell'incubatrice. Se si deve inserire una perla insieme alla barriera, preparare innanzitutto le perle imbevute di acido retinoico come descritto nel protocollo testuale allegato.

Successivamente, prendere la perla e una pinzetta microforza numero 5 ed inserirla nella superficie tagliata del mesoderma della placca laterale sul lato distale dell'incisione. Quindi, inserire la barriera nell'incisione prossimale rispetto alla perla. Sigillare l'uovo e riporlo prontamente nell'incubatrice.

Se si deve inserire una perlina o più perline senza barriera, non effettuare un'incisione lunga. Invece, praticare una piccola incisione attraverso la membrana vitellina e nel mesoderma della lamina laterale nella posizione in cui deve essere collocata la perlina. Successivamente, prendere la perlina e pinzette microchirurgiche numero 5 ed inserirle nel foro nel mesoderma della lamina laterale.

Spingerlo ulteriormente con le estremità chiuse della pinzetta. Prelevare un embrione allo stadio dieci con finestra dall'incubatrice e posizionare l'uovo su un supporto per uova sotto un microscopio stereoscopico impostato su un ingrandimento di 3,2x o superiore, se preferito. Quindi, utilizzando un microbisturi in acciaio, praticare un'incisione attraverso la membrana vitellina e il mesoderma della lamina laterale, lateralmente alla stria primitiva all'estremità caudale dell'embrione in linea con i somiti, per una lunghezza di circa sei lunghezze di somiti.

Successivamente, afferrare la barriera con una pinzetta microchirurgica n. 5, all'estremità che sporge dalla piastra di Petri, e ruotare la mano per inserire l'estremità libera della barriera nell'incisione. Appena possibile, sigillare l'uovo con del nastro trasparente e riposizionarlo nell'incubatrice. Se si deve inserire una perlina senza barriera, praticare una piccola incisione attraverso la membrana vitellina e nel mesoderma della lamina laterale nella posizione in cui deve essere collocata la perlina.

Quindi, prendere la perla e una pinzetta microforza numero 5 ed inserirla nel foro nel mesoderma della lamina laterale. Infine, spingerla leggermente più in profondità con le estremità chiuse della pinzetta. Qui viene mostrata la posizione della barriera al livello presunto delle zampe dei somiti 26-32 in un embrione allo stadio 15.

Questa barriera porta all'assenza di espressione sia di Fhf10 che di Fhf8 nella regione del gemmulo della zampa nel lato operato e alla presenza nel lato sinistro non operato. Tuttavia, l'espressione di Tbx4 è osservata sia allo stadio 19 che allo stadio 23 nel lato operato. Ciò implica che l'espressione di Tbx4 da sola non è sufficiente per avviare la crescita del membro posteriore dal mesoderma laterale parietale (lpm).

Quando perle imbevute di acido retinoico vengono posizionate in posizione distale rispetto alla barriera al livello 15, Tbx4, Fgf10 e Fgf8 vengono tutti espressi nel lato operato come nel lato controllo sinistro. Pertanto, nello sviluppo normale, l'acido retinoico proveniente dai somiti è essenziale affinché possa iniziare la formazione dell'abbozzo dell'arto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare barriere impermeabili e perle imbevute di fattori candidati per studiare come i segnali induttivi regolano l'inizio della formazione dell'abbozzo dell'arto nell'embrione di pollo.