Name: Lapplicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Impara a utilizzare barriere impermeabili e perline imbevute di acido retinoico per studiare i segnali induttivi nell'embrione di pollo. Questo metodo chirurgico analizza l'espressione genica di Tbx4, Fgf10 e Fgf8 nella biologia dello sviluppo.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Descriviamo l&#39;uso di barriere impermeabili per evitare formazione di gemme arto in embrione di pollo. Questa tecnica ha un numero di passaggi critici. A seguito di esperimenti preliminari, abbiamo scoperto che le forma di cerniera barriere utilizzati in 9, 10 restano in vigore nell&#39;embrione molto meglio di barriere diritte. Il lato piatto distale della barriera attacca alla membrana vitellina e mantiene la barriera in posizione (Figura 2C &#39;). Una preparazione accurata di cerniera barriere sagomati di un foglio di alluminio come descritto al punto 1.6 del protocollo è essenziale per il successo dell&#39;operazione. Un secondo passo importante è quello di garantire che le uova non sono lasciati fuori dell&#39;incubatore per troppo tempo in seguito a finestre e messa in scena prima di operare su l&#39;embrione. Nella nostra esperienza, embrioni sopravvivono un&#39;operazione meglio se sono in prossimità o temperatura di incubazione quando l&#39;operazione viene eseguita. Le operazioni dovrebbero quindi essere effettuate il più rapidamente possibile e le uova risigillati prontamente per garantire i tassi di sopravvivenza buoni. Molti ricercatori aggiungere una goccia di antibiotici per l&#39;embrione seguente microchirurgia prima di ritornare le uova per l&#39;incubatore. La presenza del liquido impedito le barriere di attaccarsi bene in posizione. L&#39;aggiunta di antibiotici potrebbe anche rimuovere perline dopo il posizionamento. Quindi non l&#39;uso di antibiotici, le operazioni veloci e buona la pulizia con strumenti si raccomanda di evitare l&#39;infezione. Pulendo strumenti con il 70% di etanolo dopo ogni fase di un&#39;operazione è essenziale per prevenire gli strumenti di diventare appiccicoso dal contatto con la membrana vitellina che può causare sia barriere o perline di aderire alla pinza (vedere il passaggio del protocollo 3.1.2.2). Entrambe le varietà di perline usati potrebbero cadere fuori luogo dopo l&#39;operazione. Quando la posizione barriera è stata verificata il giorno successivo non era possibile vedere attraverso la barriera di verificare se il tallone è rimasto in luogo o meno. Nei casi in cui il tallone era caduto ala gemma conseguenza non è stato salvato ( <strong&gt; Tabella 1). Evitare il trasferimento di liquido con il tallone, quando l&#39;impianto di loro significa che le microsfere attaccano più facilmente al volto taglio della LPM (vedi protocollo 2.3.2.3). Infine assicurando che gli embrioni sono fissati immediatamente dopo la raccolta è fondamentale per una buona successive analisi di espressione genica (vedere il passaggio del protocollo 4.2). Questo protocollo modifica esperimenti precedentemente pubblicati che hanno usato le barriere per impedire arto iniziazione gemma, definisce specifiche larghezze ottimali per le barriere e introduce la combinazione di barriera e il posizionamento tallone seguita da analisi di espressione genica. Abbiamo trovato con un foglio di alluminio convenzionale, che è a buon mercato e facilmente reperibili in tutti i laboratori, produce risultati uguali a quelli che in precedenza utilizzati fogli di tantalio. Il foglio può essere lasciato nell&#39;embrione quando effettuano ibridazione in situ (Figura 2C &#39;) ma di solito rimuoverlo se più di un embrione viene elaborato per evitare gli spigoli della lamina danneggiare embrioni. PStudi Ilot dimostrato che la larghezza della regione gamba barriere è particolarmente importante. Inizialmente le barriere trialed erano troppo breve e escrescenza gamba germoglio non è stato impedito. 1,2-1,3 mm è la larghezza ottimale per una barriera per bloccare completamente escrescenza germoglio gamba. Le barriere ala più stretti che si può collocare con precisione per evitare conseguenza gemma danno i migliori tassi di sopravvivenza. Questo può essere il più stretto 0,5-0,7 mm. Tuttavia, le barriere che sono un po &#39;più ampio hanno maggiori probabilità di tradursi in completo blocco di ala escrescenza gemma perché consentono per un po&#39; di imprecisione di posizionamento (abbiamo usato 0,7-1 mm). Prevenzione dei vasi sanguigni quando si effettua l&#39;incisione è fondamentale per le barriere a livello dell&#39;ala nascere. barriere semi-permeabili sono state precedentemente utilizzato per tagliare in due la gemma pulcino arto. MacCabe e Parker, 1976 e Summerbell 1979 filtri sia utilizzato 0,45 micron e 0,8 micron di dimensione dei pori, rispettivamente, 16, 17. Essi hanno riferito che i segnali diffusibili potrebbero passare attraverso i pori nei filtri e chei risultati hanno guadagnato con barriere semi-permeabile erano a metà strada tra un bocciolo arto con alcuna barriera presente e uno con una barriera foglio di tantalio impermeabile. Questo protocollo potrebbe essere adattato per usare barriere semipermeabili di varia dimensione dei pori di differenziare segnali candidati in base alle dimensioni o per modificare la dinamica di diffusione del segnale. Questo protocollo ha varie limitazioni principalmente associati al modello organismo stesso. Tali tecniche potrebbero essere utilizzati per sondare ulteriori domande in fase di sviluppo degli arti e anche altre questioni di embriogenesi dei vertebrati. Una condizione è che l&#39;organo / area in questione dovrebbe essere in via di sviluppo quando l&#39;embrione pulcino è accessibile a un intervento. La presenza di grandi vasi sanguigni nella zona in cui una barriera deve essere posizionato rende il posizionamento barriera dopo le fasi 13 o 14 tecnicamente impegnativo. Se grandi vasi sanguigni sono tagliati durante il posizionamento barriera questo può causare la mortalità embrionale. La nostra indagine di quando i fattori di trascrizione TBX5 e Tbx4 vengono prima indotte nel LPM è stata limitata dalla prima fase in cui potremmo mettere una barriera che avrebbe poi finire opposta sia l&#39;ala o un batuffolo di gamba, rispettivamente. Potrebbe essere illuminante per tentare di bloccare TBX induzione genica nelle fasi precedenti, più vicino alla gastrulazione. La prima barriera potrebbe essere collocato nella regione fascia presuntiva era successo fase 8 e nella fase zona della gamba 10. Questo protocollo non è probabilmente adatto per lo studio dell&#39;espressione genica oltre fasi arto germoglio perché successiva crescita rapida sposterebbe la barriera e risultati concerne solo alla posizione iniziale della barriera. Dopo aver correlate i limiti del embrione di pollo in questo contesto, i suoi vantaggi rispetto ad altri organismi modello vertebrati sono molti. L&#39;embrione di pollo è un modello animale molto adatto per questo tipo di intervento fisico in un embrione vertebrato. Gli embrioni sono relativamente grandi e sono facilmente accessibili throuGH guscio d&#39;uovo. Si può tornare all&#39;embrione per ulteriori sperimentazioni (ad esempio, la rimozione di un cordone 18 o anche una barriera) o per verificare progresso semplicemente rimuovendo la finestra del nastro. Non è possibile campo di applicazione alle immagini dal vivo o l&#39;imaging lasso di tempo. Descriviamo un metodo di windowing uova di gallina che è particolarmente adatto per operare su embrioni in fase iniziale. Nel caso di studi degli arti è molto importante ed utile che ci sia un arto di controllo controlaterale per ogni esperimento che serve come controllo interno ideale per ogni replica biologica. La combinazione di utilizzo di barriere impermeabili per evitare arto conseguenza e perline imbevuto di molecole di segnalazione non è stata segnalata in precedenza. La nostra analisi di espressione dell&#39;mRNA a seguito di tali interventi è anche romanzo. Queste tecniche ci hanno permesso di sezionare il difficile problema di quando specifici fattori di trascrizione degli arti Tbx5 e Tbx4 sono indotti nel LPM e ancheper dimostrare che successivamente, prima dell&#39;inizio arto germoglio, la presenza di questi geni tbx nel LPM non è sufficiente per l&#39;attivazione di FGF10 trascrizione e l&#39;inizio di conseguenza arto gemma. Figure 2G, 2D e 2E illustrano bene questi risultati. L&#39;assenza di espressione Tbx4 seguito dell&#39;inserimento di una barriera nella fase 10 nella figura 2G è in netto contrasto con la sua presenza in 2D e 2E seguente inserimento facilitato nella fase 15, dopo l&#39;induzione di Tbx4. L&#39;impianto di perline RA imbevuti facilitato il salvataggio di arto iniziazione gemma dopo l&#39;inserimento di barriera e così indica RA dai somiti che sono essenziali nel LPM prima arto gemma conseguenza può iniziare. Tali tecniche potrebbero essere usate per risolvere ulteriori domande in fase di sviluppo degli arti, ma anche altre questioni di vertebrati embriogenesi. Aree del cervello, occhio e tronco sono suscettibili di essere adatto.

embriologi classici tradizionalmente impiegate tecniche fisiche per interrogare i meccanismi che controllano lo sviluppo embrionale. Negli anni 1960 e 1970 ricercatori hanno sviluppato tecniche che hanno usato le barriere impermeabili inseriti tra i tessuti dell&#39;embrione in via di sviluppo per dimostrare l&#39;importanza dei segnali induttivi durante l&#39;embriogenesi. Il nostro interesse è in vertebrati sviluppo degli arti e, in particolare, quali eventi precedono escrescenza arto gemma. Ad esempio, l&#39;inserimento di una barriera può impedire arto gemma conseguenza di verificarsi su un lato del embrione di pollo pur consentendo di procedere normalmente sul lato non operato controlaterale. I materiali utilizzati per rendere queste barriere vario; per esempio, piastre di mica 1 e tantalio lamina 2. Queste barriere separano efficacemente la piastra mesoderma laterale (LPM), da cui le forme arto germoglio, dai somiti formano dalla mesoderma parassiale. tecniche di innesto chirurgico dimostrano che stretta associazione ingegnoh la somiti è essenziale se iniziazione arto germoglio deve avvenire nel LPM 3 4. Negli anni &#39;80 e &#39;90 biologi dello sviluppo hanno scoperto diffusibile molecole che sono essenziali nel controllo dei processi di sviluppo di segnalazione. Perle imbevuti di queste molecole di segnalazione possono essere impiantati in specifiche regioni del dell&#39;embrione e produrre alterazioni dello sviluppo embrionale. Ad esempio, l&#39;acido retinoico (RA) ripresa da perle di scambio ionico viene rilasciato per un periodo di 24 ore quando impiantato in un embrione di pollo e può produrre speculare la duplicazione delle cifre 5. Eparina perline acrilici contenenti proteine FGF possono avviare arto gemma conseguenza dal interlimb LPM 6. Più di recente il mouse e pesce genetica hanno preso lo studio dei vertebrati arto iniziazione in una nuova era (rivisto in 7). Ci sono buone evidenze che RA presente nei somiti prima dell&#39;inizio arto gemma è il segnale diffusibile essenziale, prevista dal LPM per avviare arto in erba. Abbiamo voluto sfruttare l&#39;accessibilità e la robustezza sperimentale del embrione di pollo di sezionare l&#39;effetto di sbarramento dell&#39;impianto sull&#39;espressione genica nel LPM intorno al periodo di iniziazione arto gemma. Un romanzo adattamento del nostro metodo è quello di combinare una barriera che blocca i segnali dai tessuti assiali con posizionamento tallone laterale alla barriera esogenamente fornitura candidati fattori endogeni che sono stati bloccati dalla barriera. I seguenti protocolli sono quelli sviluppati per prendere in giro i meccanismi di induzione arto gemma e l&#39;iniziazione. Studiare iniziazione arto gemma significa usare embrioni dello stadio precoce. Molte uova di gallina finestra ricercatori di primo rimuovendo alcune dell&#39;albumina attraverso la sacca d&#39;aria con un ago ipodermico. L&#39;embrione, che si trova sulla parte superiore del tuorlo, poi giacere inferiore nell&#39;uovo. Questo è un vantaggio per alcune tecniche, come l&#39;elettroporazione, ma può essere uno svantaggio se manipolazione chirurgica dell&#39;embrione è desiderato.Troviamo avendo l&#39;embrione come vicino all&#39;apertura nell&#39;uovo possibile è un vantaggio. Le domande rimangono per quanto riguarda i segnali che controllano vertebrati arto induzione gemma e l&#39;iniziazione e le seguenti protocolli sono adatti per affrontarle. Siamo i primi a sviluppare un protocollo per l&#39;inserimento di barriere per impedire pulcino arto gemma conseguenza in una fase precedente alla fase 12 8. versioni modificate di questi protocolli potrebbero essere utilizzati anche per affrontare altre questioni sull&#39;origine e la tempistica di segnali induttivi in ​​cui un tessuto Induzione accessibili si trova adiacente al primordio essere indotta. Purché la regione dell&#39;embrione è accessibile in fase di sviluppo rilevante, quindi una barriera potrebbe essere inserito tra i due tessuti e conseguenti cambiamenti nello sviluppo studiati. Esempi possono essere trovati in sviluppo del cervello, estensione dell&#39;asse e sviluppo possibilmente organo come fegato o reni induzione.

<table><tbody><tr><td>Dumont No. 5 pinze per orologiai, x2</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 4 pinze per orologiai, x2</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont strong pinze, tipo AA</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici curve con lame lunghe</td> <td>2,5 cmStrumenti di Fine Science&nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinza curva smussata, estremità circa 0,5&nbsp; cm di lunghezza</td><td>Fine Science Tools www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Perno in acciaio, 0,2 mm di larghezza</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Pietra per affilare, quadrato</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Olio</td><td></td><td></td><td></td>minerale</tr><tr><td>Porta aghi</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Nastro trasparente, 50 mm x 66&nbsp; m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>proteina</td><td></td><td></td> FGF4 <td>Un regalo di Cliff Tabin.</td></tr><tr><td>acido all-trans-retinoico</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Ricordati di proteggere dalla luce.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi n. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>gatto n. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, gel per cromatografia di affinità</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Perline per l'erogazione di proteine.</td></tr><tr><td>AG1-X2 Resina a scambio ionico</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>Perline per l'erogazione di RA o BMS 493.</td></tr><tr><td>Incubatrice per uova</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Nocivo, irritante, corrosivo. Maneggiare la polvere nella cappa aspirante con indumenti protettivi completi.</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td> Microscopio binoculare da <td>500 ml</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>Sostituito da M60</td></tr><tr><td>Uova di gallina</td><td>Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Uova marroni</td></tr></tbody></table>

l&#39;applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di candidato perle soaked per studiare i segnali induttivi nel chick

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

L&#39;embrione pulcino fornisce un modello vertebrato superba che può essere utilizzato per sezionare domande di sviluppo in modo diretto. La sua accessibilità e la robustezza dopo l&#39;intervento chirurgico sono importanti punti di forza sperimentali. Piatti Mica sono state le prime barriere usati per prevenire pulcino arto gemma iniziazione 1. Protocolli che utilizzano un foglio di alluminio come una barriera impermeabile al germoglio ala o induzione gamba gemma e l&#39;iniziazione o sono descritti. Uniamo questa tecnica con posizionamento tallone laterale alla barriera esogenamente fornitura candidati fattori endogeni che sono stati bloccati dalla barriera. I risultati vengono analizzati mediante ibridazione in situ della successiva espressione genica. Il nostro obiettivo principale è il ruolo della segnalazione dell&#39;acido retinoico nella induzione e iniziazione successiva alla ribalta embrione di pollo e degli arti posteriori. Usiamo BMS 493 (un agonista inverso di recettori dell&#39;acido retinoico (RAR)) perline bagnati impiantati nella piastra laterale mesoderma (LPM) per simulare l&#39;effetto di un barrier posto tra i somiti (una fonte di acido retinoico (RA)) e la LPM da cui gemme degli arti crescono. versioni modificate di questi protocolli potrebbero essere utilizzati anche per affrontare altre questioni sull&#39;origine e la tempistica di spunti induttivi. Purché la regione di embrione di pollo è accessibile in fase di sviluppo rilevante, una barriera potrebbe essere inserito tra i due tessuti e conseguenti cambiamenti nello sviluppo studiati. Esempi possono essere trovati nel cervello di sviluppo, l&#39;estensione dell&#39;asse e nello sviluppo di organi, come il fegato o il rene induzione.

Il protocollo descritto sopra descritti i metodi utilizzati per Nishimoto et al. 2015. Il documento studia arti induzione gemma e l&#39;iniziazione sia in primo piano e arti posteriori del embrione di pollo. I risultati dopo l&#39;inserimento di barriere impermeabili per evitare la conseguenza della gemma zampa anteriore sono stati pubblicati in precedenza 1, 2, 9, ma c&#39;è stato solo uno studio che descrive gli ostacoli che impediscono la gamba gemma iniziazione 1. I dati degli arti posteriori da Nishimoto et al. 2015 sono presentati qui come risultati rappresentativi dello studio di espressione di mRNA seguenti inserimento di barriera. Tbx4 ​​Espressione nella LPM non è sufficiente ad avviare degli arti posteriori escrescenza: Figure 2B e C (Tabella 2) mostra che l&#39;inserimento facilitato nella fase 15 (Figura 2A) (vedi protocollo 3.2) porta ad entrambi FGF10ed espressione Fgf8 assente nella zona della gamba germoglio (indicato con staffa) sul lato destro operato. Confronto con il lato non operato di sinistra. Tuttavia, l&#39;espressione Tbx4 è osservata sia fase 19 e la fase 23 sul lato operato (Figura 2D e E). Concludiamo che l&#39;espressione Tbx4 da sola non è sufficiente per avviare degli arti posteriori escrescenza dal LPM. Altri studi nel pulcino hanno suggerito che l&#39;espressione TBX gene è sufficiente per avviare la formazione degli arti anteriori gemma 12, 13. Figura 2C &#39;è incluso per illustrare come una barriera sembra inserita in regione tappa del fissaggio dell&#39;embrione palo. Nella maggior parte dei casi ostacoli sono stati rimossi prima ibridazione in situ (protocollo 4.3). RA dalle Somiti è essenziale nel LPM prima FGF10 Induce Limb Bud Outgrowth: La figura 3A è uno schema che rappresenta l&#39;aggiunta di un distale tallone RA imbevuto di una barriera inserita nella fase 15 (protocollo 3.2.1.3). Successivamente a tale operazione escrescenza arto gemma (contrassegnata da un asterisco) si osserva sul lato destro gestito e Tbx4, FGF10 e Fgf8 sono espressi sul nascere come sono nel lato di comando sinistra (Figura 3B, C e D, tabella 2) . Così aggiunta di RA al LPM supera l&#39;effetto barriera e degli arti procede iniziazione gemma. Abbiamo concluso che in normali RA sviluppo dal somiti è essenziale nella LPM prima conseguenza arto gemma può essere avviata. I germogli arti posteriori risultanti sono generalmente più piccoli di quelli sul lato di controllo. Ciò può essere dovuto alla dose RA nella LPM non essendo equivalente alla situazione wild type. Se la dose RA è troppo alto il apicale ectodermica Ridge (ARE) può essere abbreviato e boccioli più piccoli si tradurrebbe14, 15. Per confermare che RA (dai somiti) nella LPM è necessaria per la normale iniziazione arto gemma un agonista inverso di RAR, BMS 493, è stato utilizzato. Beads vengono impiantati nella regione LPM gamba allo stadio 15 (vedi protocollo 3.2.1.4) (Figura 3E). Espressione FGF10 è downregulated seguente applicazione di BMS 493 perline in LPM, con conseguente più piccole gemme arti posteriori rispetto al lato di controllo (Figura 3F; Tabella 3). Le sfere di controllo DMSO non causano questi difetti (Figure 3G e 3H; Tabella 3). I difetti osservati dopo l&#39;applicazione BMS 493 sono più miti rispetto a quelli indotti da un&#39;operazione di sbarramento; vale a dire, FGF10 è ancora espresso e si formano gemme degli arti. Questo è probabilmente perché gli effetti di BMS 493 sono limitate a livello locale intorno alle perline e potrebbero non essere in grado di antagonizzare tutto il RA prodotto da axiAl tessuti. All&#39;inizio Segnali assiali Specificare le cellule LPM che espresso poi Tbx4: Abbiamo testato quando il LPM acquisisce la sua capacità di esprimere Tbx4 nella regione prospettico gamba di formazione. La prima fase in cui un ostacolo può essere inserito che saranno successivamente bloccare gamba gemma conseguenza, è palcoscenico 10. Siamo i primi a sviluppare un protocollo per inserire le barriere nelle fasi precedenti alla fase 12. Le barriere inseriti tra il mesoderma parassiale e la gamba presuntiva LPM nella fase 10 (vedi protocollo 3.4) formazione di gemme blocco gamba e l&#39;espressione del Tbx4 alla gamba formazione LPM (figure 2F e 2G, Tabella 2), suggerendo che un segnale da tessuti assiali nella fase 10 è necessaria per l&#39;espressione successiva Tbx4 in hindlimb LPM. Confrontare questo risultato con le figure 2D e E dove l&#39;inserimento di barriera in seguito permette l&#39;espressione Tbx4da stabilire. Inoltre, abbiamo testato se questo segnale assiale potrebbe essere RA osservando se l&#39;agonista inverso di RAR riduce espressione Tbx4. Un BMS 493 tallone collocato nella LPM arti posteriori allo stadio 10 (vedi protocollo 3.4.1.3) diminuisce l&#39;espressione Tbx4 (figure 2H e 2I), mentre sfere di controllo imbevuti di DMSO non influenzano l&#39;espressione Tbx4 (figure 2J e 2K). Insieme, questi risultati supportano un modello che un segnale RA dai tessuti assiali regola induzione arto regolando positivamente Tbx4 in arti posteriori LPM 7. La morte post-operatorio: Tabelle 1, 2 e 3 forniscono dettagli di risultati sperimentali, tra cui il numero di embrioni di pollo, che è morto post operazione e prima della raccolta. Alcuni decessi sono da aspettarsi dopo microchirurgia di questa natura. La morte numeri può essere mantenuto<html> al minimo facendo in modo che gli strumenti sono pulite, il foro nell&#39;uovo è la dimensione minima richiesta, che gli embrioni sono lasciati senza la protezione della guarnizione nastro adesivo per un tempo minimo e, in combinazione con questo ultimo punto che l&#39;operazione viene effettuata il più rapidamente possibile. Nessuna di queste operazioni sono molto in termini di tempo, ma le operazioni che coinvolgono perline e barriere prendere un po &#39;più di tempo. Nonostante queste misure, le operazioni effettuate nelle prime fasi e quelle della regione dell&#39;ala hanno maggiori probabilità di provocare la morte. Ci sono grandi vasi sanguigni intorno alle regioni degli arti di formazione e la rottura accidentale di questi vasi possono portare alla morte a causa di perdita di sangue. Troviamo che le uova aperte in fase di 8 o 9, in cui gli embrioni non sono stati operati, spesso muoiono entro il giorno successivo. Pertanto, l&#39;unica soluzione a questi problemi è di effettuare un elevato numero di esperimenti. d / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Marker I cambiamenti di espressione genica seguenti barriera o tallone di inserimento presuntiva Leg livello. (A) posizione mostra Schema barriera (linea verde) a livello delle gambe presuntiva (somiti 26-32) in una fase embrionale 15. (B - E e G) analisi WISH sugli embrioni gestite. La regione gamba è delineato (parentesi). (B) l&#39;espressione FGF10 è assente nel LPM operato, ma l&#39;espressione robusto viene rilevato sul nascere sinistra. (C) espressione Fgf8 è assente nel lato operato, suggerendo non c&#39;è AER. (C &#39;) Lo stesso embrione prima della barriera è stato rimosso. (D) Tbx4 è espresso nel LPM allo stesso livello rostro-caudale come il germoglio di controllo. (E) espressione Tbx4 è mantenuto nella regione gamba destra nonostante assenza di crescita dell&#39;arto. (F) Schema di uno stadio<html> 10 embrionali di pollo mostrando posizione di barriera (linea verde) a livello della gamba presuntiva. (G) espressione Tbx4 è assente nel operato destra LPM (staffa). (H) Schema di uno stadio 10 embrionali di pollo mostrando BMS 493 posizione tallone (cerchio viola) a livello della gamba presuntiva. (I) espressione Tbx4 è inibiti sul lato destro azionato dopo trattamento con BMS 493. (J) Schema di uno stadio 10 embrionali di pollo che mostra controllo di posizione DMSO tallone (cerchio grigio). (K) Tbx4 è espresso sul lato destro funzionare ad un livello simile a quello del controllo laterale sinistra seguendo trattamento con solo DMSO. Questa cifra è stata modificata da 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> d / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; Assenza Figura 3. RA Rescues Limb di Bud causato dalla Barriera inserimento ed è essenziale nel LPM Prima di Leg Bud escrescenza. (A) Schema che indica la posizione di barriera (linea verde) a livello della gamba presuntiva (somiti 26-32) ed un tallone RA-imbevuto (cerchio rosso). (B - D) RA salvataggi escrescenza gamba gemma (indicato da un asterisco). (B) l&#39;espressione Tbx4 è presente sul nascere gamba salvato simile al lato non-operato. (C) FGF10 è espressa nella gamba salvato gemma simile al lato non-operato. (D) Fgf8 si esprime nella AER della gemma gamba destra in salvo. (E) Schema che indica dove BMS 493 perline (cerchi viola) sono stati collocati in una gamba LPM presuntiva di fase 15 embrioni. (F) espressione FGF10 è downregulated sul lato destro gestito e il bocciolo gamba è piccolo BMS 49 segue3 trattamento. Beads sono asterisco. (G) schematica simile a (E), che indica la posizione di controllo DMSO perline (cerchi grigi). (H) perle di DMSO (indicati con un asterisco) non ha modificato l&#39;espressione FGF10 o dimensione gamba gemma. Questa cifra è stata modificata da 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Barriera Fase posto (+ tallone) * </td><td> numero operato </td><td> Ala mancante ** </td><td> Ala presente ** </td><td> numero morti </td></tr><tr><td> fase 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> fase 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> Fase 12-13 (FGF4 tallone) </td><td> 41 </td><td> 7 (mancante tallone) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Fase 12-13 (RA tallone) </td><td> 75 </td><td> 9 (mancante tallone) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> Tappa 13 (microsfera di controllo) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0,7-1 mm barriere stagnola poste tra somiti 15-20 e la piastra mesoderma laterale. 0,35 mg / ml tallone FGF4. 0,05-0,1 mg / ml tallone RA. </td></tr><tr><td colspan="5"> microsfera di controllo DMSO. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** fasi embrioni di pollo fisse 21-23 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Ala Livello barriera e Experiment Bead risultati. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Barriera Fase posto (+ tallone) * </td&gt; <td> numero operato </td><td> Leg mancante ** </td><td> Leg presente ** </td><td> numero morti </td></tr><tr><td> fase 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> fase 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Fase 15 (tallone FGF4) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Fase 15 (tallone RA) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0,7-1,3 mm barriere stagnola poste tra somiti 26-32 e la piastra mesoderma laterale. 0,35 mg / ml tallone FGF4. 0,05-0,1 mg / ml tallone RA. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** fasi embrioni di pollo fisse 18-24 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Leg Barriera e Bead Esperimento risultati. <table border = &quot;1&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-con-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> numero operato </td><td> Leg gemma piccola </td><td> Leg gemma po &#39;piccolo </td><td> Leg gemma dimensioni normali </td><td> numero morti </td></tr><tr><td> BMS 493 perline * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> perline DMSO ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3 perline imbevute di 5 mg / ml BMS 493 collocati nella giusta fase 14-15 LPM a livello della gamba. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 2-3 perline imbevute di DMSO solo collocati nella giusta fase 15 LPM a livello delle gambe. </td></tr><tr><td colspan="5"> embrioni di pollo fissati nelle fasi 17-19. </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Leg livello BMS 493 Bead Experiment risultati.

Vengono descritti protocolli che utilizzano barriere impermeabili per bloccare gli eventi di induzione tra i tessuti dell'asse principale del corpo e il fianco nell'embrione di pollo necessari per la formazione degli arti. Le perle imbevute di segnali induttivi candidati vengono utilizzate per superare l'effetto del posizionamento della barriera e l'analisi dell'espressione genica lo conferma.

L&#39;applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

L'obiettivo di questo intervento chirurgico è chiarire i meccanismi dell'induzione degli arti nell'embrione di pollo impedendo alle molecole segnale di diffondere dai tessuti mediali alle cellule del mesoderma della lamina laterale e studiandone l'effetto sull'espressione genica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in biologia dello sviluppo, come ad esempio quali siano i segnali induttivi che controllano l'avvio del primordio dell'arto. Il vantaggio di questa tecnica è che l'embrione di pollo è facilmente accessibile per manipolazioni chirurgiche ed è molto resistente; inoltre, il primordio dell'arto controlaterale non operato funge da controllo interno estremamente utile.Susan Wilde illustrerà la procedura. Per iniziare, tagliare un pezzo quadrato di alluminio spesso 0,013 mm di 1 cm di lato e sterilizzarlo passandovi sopra etanolo al 70%. Successivamente, posizionare il quadrato su una piastra di Petri sterile in plastica da 6 cm.Per evitare l'effetto elettrostatico, scartare il coperchio e crearne uno nuovo per la piastra utilizzando lo stesso foglio di alluminio. Successivamente, posizionare la piastra di Petri sopra una graticola micrometrica sotto un microscopio binoculare impostato su un ingrandimento di 1,6x. Utilizzare un bisturi con lama numero 15 per tagliare strisce di alluminio larghe 1,3 mm e lunghe 2 mm.Separare le strisce di foglio metallico utilizzando due paia di pinzette da orologiaio numero quattro. Successivamente, piegare al centro la barriera di alluminio formando un angolo retto in modo che assomigli a una cerniera. Disporre le barriere al centro della piastra di Petri con un lato appoggiato piatto sul fondo della piastra e l'altro rivolto verso l'alto, fuori dalla piastra; preparare 20 o più barriere prima del giorno dell'intervento.Posizionare il coperchio di alluminio sulla piastra e conservare le barriere in un luogo dove non possano essere disturbate. Tenendo l'uovo in posizione laterale, afferrare saldamente una coppia di pinzette di tipo AA ad alta forza e, con la mano libera che sostiene l'uovo, praticare un foro nell'estremità più larga dell'uovo contenente la camera d'aria mediante un movimento controllato di punta. Assicurarsi che la membrana interna del guscio sia stata perforata.Successivamente, prendere l'uovo con entrambe le mani e ruotarlo di 180 gradi lungo il suo asse orizzontale. Poi, prendere un pezzo di nastro trasparente di circa 5 cm di lato e applicarlo accuratamente sulla superficie superiore dell'uovo per evitare che la buccia si sbricioli sull'embrione quando l'uovo verrà aperto. Utilizzare un paio di forbici curve per rompere delicatamente il guscio e le membrane cellulari interne ad esso associate al centro della parte superiore dell'uovo.Fare un foro molto piccolo con una delle lame delle forbici in modo che l'aria possa entrare nell'uovo sopra l'embrione. Utilizzare le forbici per allargare il foro nel guscio fino a formare un cerchio con un diametro di circa 1 cm. Rimuovere questa porzione di guscio dell'uovo.Coprire il foro sull'uovo con un pezzo di nastro trasparente di circa 5 cm quadrati. Premere il nastro in modo da farlo aderire solo al bordo del foro, lasciando il resto del nastro libero. Il nastro libero può quindi essere afferrato per aprire facilmente l'uovo.Prendere un embrione allo stadio 15 dall'incubatrice e posizionare l'uovo su un supporto per uova sotto un microscopio binoculare impostato su un ingrandimento di 3,2x o superiore. Successivamente, rimuovere lo strato superiore di nastro trasparente. Utilizzando un microbisturi in acciaio, praticare un'incisione attraverso la membrana vitellina e il mesoderma laterale adiacente ai somiti 26-32 sul lato destro dell'embrione.Prendere la barriera con pinzette microforza numero 5 a un'estremità e ruotare la barriera per inserire l'estremità libera nell'incisione. Appena possibile, sigillare l'uovo con del nastro trasparente e riporlo nell'incubatrice. Se si deve inserire una perla insieme alla barriera, preparare innanzitutto le perle imbevute di acido retinoico come descritto nel protocollo testuale allegato.Successivamente, prendere la perla e una pinzetta microforza numero 5 ed inserirla nella superficie tagliata del mesoderma della placca laterale sul lato distale dell'incisione. Quindi, inserire la barriera nell'incisione prossimale rispetto alla perla. Sigillare l'uovo e riporlo prontamente nell'incubatrice.Se si deve inserire una perlina o più perline senza barriera, non effettuare un'incisione lunga. Invece, praticare una piccola incisione attraverso la membrana vitellina e nel mesoderma della lamina laterale nella posizione in cui deve essere collocata la perlina. Successivamente, prendere la perlina e pinzette microchirurgiche numero 5 ed inserirle nel foro nel mesoderma della lamina laterale.Spingerlo ulteriormente con le estremit&agrave; chiuse della pinzetta. Prelevare un embrione allo stadio dieci con finestra dall'incubatrice e posizionare l'uovo su un supporto per uova sotto un microscopio stereoscopico impostato su un ingrandimento di 3,2x o superiore, se preferito. Quindi, utilizzando un microbisturi in acciaio, praticare un'incisione attraverso la membrana vitellina e il mesoderma della lamina laterale, lateralmente alla stria primitiva all'estremit&agrave; caudale dell'embrione in linea con i somiti, per una lunghezza di circa sei lunghezze di somiti.Successivamente, afferrare la barriera con una pinzetta microchirurgica n. 5, all'estremità che sporge dalla piastra di Petri, e ruotare la mano per inserire l'estremità libera della barriera nell'incisione. Appena possibile, sigillare l'uovo con del nastro trasparente e riposizionarlo nell'incubatrice. Se si deve inserire una perlina senza barriera, praticare una piccola incisione attraverso la membrana vitellina e nel mesoderma della lamina laterale nella posizione in cui deve essere collocata la perlina.Quindi, prendere la perla e una pinzetta microforza numero 5 ed inserirla nel foro nel mesoderma della lamina laterale. Infine, spingerla leggermente più in profondità con le estremità chiuse della pinzetta. Qui viene mostrata la posizione della barriera al livello presunto delle zampe dei somiti 26-32 in un embrione allo stadio 15.Questa barriera porta all'assenza di espressione sia di Fhf10 che di Fhf8 nella regione del gemmulo della zampa nel lato operato e alla presenza nel lato sinistro non operato. Tuttavia, l'espressione di Tbx4 è osservata sia allo stadio 19 che allo stadio 23 nel lato operato. Ciò implica che l'espressione di Tbx4 da sola non è sufficiente per avviare la crescita del membro posteriore dal mesoderma laterale parietale (lpm).Quando perle imbevute di acido retinoico vengono posizionate in posizione distale rispetto alla barriera al livello 15, Tbx4, Fgf10 e Fgf8 vengono tutti espressi nel lato operato come nel lato controllo sinistro. Pertanto, nello sviluppo normale, l'acido retinoico proveniente dai somiti è essenziale affinché possa iniziare la formazione dell'abbozzo dell'arto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare barriere impermeabili e perle imbevute di fattori candidati per studiare come i segnali induttivi regolano l'inizio della formazione dell'abbozzo dell'arto nell'embrione di pollo.

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Lapplicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick (Video) | JoVE Journal

L'applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

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