L'applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

L'obiettivo di questo intervento chirurgico è quello di chiarire i meccanismi di induzione dell'arto nell'embrione di pollo, impedendo alle molecole di segnalazione di diffondersi dai tessuti mediali alle cellule nel mesoderma della placca laterale e studiando il suo effetto sull'espressione genica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, come ad esempio quali sono i segnali induttivi per controllare l'inizio delle gemme degli arti. Il vantaggio di questa tecnica è che l'embrione di pollo è accessibile alla manipolazione chirurgica e molto robusto, inoltre, la gemma dell'arto di controllo controlaterale non operato funge da controllo interno molto utile.

Susan Wilde dimostrerà la procedura. Per iniziare, taglia un pezzo quadrato di 1 cm di foglio di alluminio spesso 0,013 mm e sterilizzalo strofinandolo con etanolo al 70%. Quindi, posizionare il quadrato su una capsula di Petri di plastica sterile da 6 cm.

Per evitare l'adesione statica, scartare il coperchio e crearne uno nuovo per il piatto con la stessa pellicola. Quindi, posizionare la capsula di Petri sopra un reticolo di tavolino sotto un microscopio binoculare impostato su un ingrandimento di 1,6x. Utilizzare un bisturi piccolo con lama numero 15 per tagliare strisce di pellicola larghe 1,3 mm e lunghe 2 mm.

Separare le strisce di alluminio utilizzando due paia di pinze per orologiai numero quattro. Quindi, fai una curva ad angolo retto al centro della barriera di alluminio in modo che assomigli a una cerniera. Allineare le barriere al centro della capsula di Petri con un lato piatto contro la piastra e l'altro rivolto verso l'esterno della capsula, preparare 20 o più barriere prima del giorno dell'operazione.

Posiziona il coperchio di alluminio sopra il piatto e riponi le barriere in un luogo dove non verranno disturbate. Con l'uovo sdraiato su un lato, afferra saldamente un paio di pinze forti di tipo AA e usa un movimento di pugnalata controllato per perforare l'estremità smussata dell'uovo contenente la sacca d'aria mentre tieni l'uovo con la mano libera. Assicurarsi che la membrana interna del guscio sia stata rotta.

Quindi, prendi l'uovo con entrambe le mani e giralo di 180 gradi lungo il suo asse orizzontale. Quindi, prendi un pezzo di nastro adesivo trasparente, di circa 5 cm quadrati e incollalo strettamente sulla superficie più alta dell'uovo per evitare che il guscio dell'uovo si sbricioli sull'embrione quando l'uovo viene aperto. Usa un paio di forbici ricurve per sfondare delicatamente il guscio e le membrane cellulari interne associate al centro della parte superiore dell'uovo.

Fai un foro molto piccolo con una lama delle forbici in modo che l'aria possa entrare nell'ovulo sopra l'embrione. Usa le forbici per allargare il foro nel guscio in un cerchio con un diametro di circa 1 cm. Rimuovi questo pezzo di guscio delle dimensioni di un uovo dall'uovo.

Coprite il buco dell'uovo con un pezzo di nastro adesivo trasparente di circa 5 cm quadrati. Premere il nastro per incollarlo solo sul bordo del foro lasciando libero il nastro rimanente. Il nastro libero può quindi essere afferrato per aprire facilmente l'uovo.

Prelevare un embrione di stadio 15 dall'incubatrice e posizionare l'ovulo su un supporto per uova sotto un microscopio binoculare impostato su un ingrandimento di 3,2x o superiore. Quindi, rimuovere lo strato superiore di nastro trasparente. Utilizzando un micro coltello in acciaio, praticare un'incisione attraverso la membrana vitellina e posizionare lateralmente il mesoderma adiacente ai somiti 26-32 sul lato destro dell'embrione.

Prendi la barriera con il numero 5 di micro pinze a un'estremità e ruota la barriera per inserire l'estremità libera nell'incisione. Il prima possibile, sigillare l'uovo con del nastro adesivo trasparente e rimetterlo nell'incubatrice. Se una perlina deve essere inserita insieme a una barriera, in primo luogo, preparare le perle imbevute di acido retinoico come descritto nel protocollo di testo allegato.

Quindi, prendi il cordone e un paio di micro pinze numero 5 e inseriscilo nella faccia tagliata del mesoderma laterale sul lato distale dell'incisione. Quindi, inserire la barriera nell'incisione prossimale al tallone. Sigillare l'uovo e rimetterlo prontamente nell'incubatrice.

Se una o più perline devono essere inserite senza barriera, non praticare l'incisione lunga. Invece, praticare una piccola incisione attraverso la membrana vitellina e nel mesoderma della placca laterale nella posizione in cui deve essere posizionata la perlina. Quindi, prendi la perlina e il numero 5 micro pinze e inseriscilo nel foro del mesoderma della placca laterale.

Spingerlo un po' più in là con le estremità chiuse della pinza. Prendi un embrione di stadio dieci dalla finestra dall'incubatrice e posiziona l'ovulo su un poggiauova al microscopio binoculare impostato su un ingrandimento di 3,2x o superiore, se preferisci. Quindi, utilizzando un micro coltello in acciaio, praticare un'incisione attraverso la membrana vitellina e il mesoderma della placca laterale, lateralmente alla striscia primitiva all'estremità caudale dell'embrione in linea con i somiti, lunga circa sei lunghezze di somite.

Quindi, raccogli la barriera con un paio di micro pinze numero 5, all'estremità sporgenti dalla capsula di Petri e ruota la mano per inserire l'estremità libera della barriera nell'incisione. Il prima possibile, sigillare l'uovo con del nastro adesivo trasparente e rimetterlo nell'incubatrice. Se una perlina deve essere inserita senza barriera, praticare una piccola incisione attraverso la membrana vitellina e nel mesoderma della placca laterale nella posizione in cui la perlina deve essere posizionata.

Quindi, prendi la perlina e un paio di micro pinze numero 5 e inseriscile nel foro del mesoderma della placca laterale. Infine, spingilo un po' più in là con le estremità chiuse della pinza. Qui è mostrata la posizione della barriera al livello presunto della gamba dei somiti 26-32 in un embrione allo stadio 15.

Questa barriera porta all'assenza dell'espressione di Fhf10 e Fhf8 nella regione delle gemme delle zampe nel lato operato e presente nel lato sinistro non operato. Tuttavia, l'espressione di Tbx4 è osservata sia allo stadio 19 che allo stadio 23 sul lato operato. Ciò implica che l'espressione di Tbx4 da sola non è sufficiente per avviare la crescita degli arti posteriori dall'lpm.

Quando le perle imbevute di acido retico sono posizionate distalmente alla barriera allo stadio 15, Tbx4, Fgf10 e Fgf8 sono tutte espresse sul lato operato poiché si trovano sul lato di controllo sinistro. Pertanto, nel normale sviluppo, l'acido retinoico dei somiti è essenziale prima che possa iniziare la crescita delle gemme degli arti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le barriere impermeabili e le perle fattorizzate imbevute di candidati per studiare come i segnali induttivi regolano l'inizio delle gemme degli arti nell'embrione di pollo.