Un modello acuta della retina per la valutazione sanguigni della retina barriera breccia e potenziali farmaci per il trattamento

A basso costo, il sistema facile da usare e potente è stabilito per valutare i potenziali trattamenti che potrebbero migliorare barriera emato-retinica violazione indotta da istamina. perdita dei vasi sanguigni, l'attivazione delle cellule Müller e la continuità dei processi neuronali sono utilizzati per valutare la risposta al danno e la sua inversione con un potenziale farmaco, Lipoxin A4.

L'obiettivo generale di questo sistema modello retinico ex vivo è quello di eseguire lo screening di farmaci che migliorano la violazione della barriera neurale del sangue. Questo metodo può rispondere a diverse domande chiave nel campo delle malattie neurali degenerative, come ad esempio quali sono gli eventi precoci e come possiamo selezionare i farmaci che possono aiutare a trattare questi pazienti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è a basso costo, facile da usare, veloce e adattabile.

Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ottenere dati affidabili e riproducibili dipende dalle capacità tecniche per generare buoni campioni. Qui vengono utilizzate le prime retine suine, ottenute da una fonte commerciale. Dopo l'approvvigionamento dalla fonte, i bulbi oculari devono essere mantenuti a quattro gradi, o su ghiaccio, e lavorati il prima possibile.

Iniziare la dissezione in una cappa per coltura tissutale tagliando intorno alla lente per aprire il tappo oculare. Quindi, con un pennello, rimuovere delicatamente l'umor vitreo, senza tirare la retina. Utilizzare un pennello per staccare delicatamente la retina dal bordo tagliato, per esporre il disco ottico.

Recidere il nervo ottico con un rasoio e rilasciare la retina. Trasferisci la retina in una capsula di Petri e risciacqua accuratamente la retina una volta usando l'HBSS freddo. Posizionare il campione in HBSS su ghiaccio.

Quindi, usa un rasoio per tagliare la retina a metà simmetricamente. Quando sono necessari trattamenti, viene trattata una metà della retina, mentre l'altra metà della stessa retina deve essere elaborata per impostare la linea di base e correggere le variazioni dell'animale. Trasferire delicatamente i campioni in una piastra a sei pozzetti contenente tre millilitri di terreno di stabilizzazione per pozzetto.

Equilibrare le retine per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un'incubatrice con l'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, aspirare con cura il terreno di stabilizzazione e aggiungere tre millilitri di terreno contenente istamina e LXA4 a ciascun pozzetto. Incubare i campioni per un'altra ora.

Dopo aver risciacquato con PBS sterile caldo, aggiungere tre millilitri di PFA al 4% in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Una volta trascorso il tempo di incubazione, aspirare rapidamente il PFA e sciacquare i campioni una volta con PBS. Aggiungere il 10% di saccarosio ai pozzetti e incubare per due o quattro ore a quattro gradi Celsius.

Successivamente, sostituisci il 10% di saccarosio con il 30% di saccarosio e incuba per una notte a quattro gradi Celsius. Quindi mescolare una parte di mezzo di congelamento commerciale con due parti di saccarosio al 20%, per ottenere un mezzo di congelamento funzionante. Lasciare a quattro gradi Celsius durante la notte o più a lungo fino a quando le bolle d'aria scompaiono.

Il giorno successivo, sostituire il saccarosio al 30% con un mezzo di congelamento di lavoro e lasciarlo riposare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'equilibrio, tagliare ogni retina in rettangoli di tre millimetri per cinque millimetri, quindi congelare le fette di retina mettendole in un mezzo di congelamento, contenuto in un cilindro di carta stagnola. Assicurarsi che le fette di retina siano verticali per fornire una sezione trasversale della retina durante il sezionamento e congelarle in azoto liquido.

Sezionare ogni blocco su un criostato in fette da 14 micron e montare le sezioni su vetrini. Conservare i vetrini a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Iniziare l'immunocolorazione lavando le sezioni con tampone fosfato di saccarosio al 5% o SPB.

Quindi bloccare i siti di legame non specifici, incubando le sezioni e bloccando il tampone per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, incubare le sezioni con l'anticorpo primario appropriato per un'ora. Trascorso l'ora, aspirare la soluzione e lavare tre volte le sezioni al 5%SPB.

Quindi incubare le sezioni con gli anticorpi secondari corrispondenti per un'ora, al riparo dalla luce. Dopo aver lavato le sezioni tre volte con il 5% di SPB, preparare i campioni per la microscopia montandoli in un terreno contenente DAPI e coprendoli con vetrini. Infine, acquisisci le immagini utilizzando un microscopio confocale.

Per misurare l'ampiezza del processo, utilizzare lo strumento lente di ingrandimento per scegliere un'area della sezione in cui i processi stanno gestendo, come lo strato nucleare esterno. Quindi scegli un campo ottico in cui tali processi siano visibili e continui. Fare clic sullo strumento di analisi nel menu principale, quindi fare clic su imposta scala nel sottomenu per impostare la barra della scala in base all'impostazione microscopica.

Seleziona la funzione linea nel menu principale e traccia una linea attraverso il processo. Fare clic su Analizza nel menu principale, quindi fare clic su Misura nel sottomenu per eseguire la misurazione. Per analizzare la continuità del processo, tornare al menu principale e utilizzare la funzione poligono per selezionare lo strato plessiforme interno come regione di interesse.

Misurare l'area facendo clic su Analizza e quindi su Misura. Fare clic su Elabora, Filtra e quindi su Varianti per migliorare i bordi dell'immagine sostituendo ogni pixel con la relativa variante vicina. Quindi regolare automaticamente il contrasto e la luminosità facendo clic su immagine, regola, luminosità e contrasto, quindi auto nel sottomenu.

Quindi conta le righe. In queste immagini, l'immunoreattività delle IGG è visibile in rosso. Nei gruppi di controllo, le IGG sono limitate all'interno dei vasi sanguigni.

Nel gruppo istaminico, le IGG vengono rilevate dai vasi sanguigni, dove formano nuvole di perdita indicate da cerchi tratteggiati. Nei gruppi trattati con LXA4, le IGG sono nuovamente limitate all'interno dei vasi sanguigni. Un'ulteriore aggiunta di LXA4 salva la funzione dei vasi indotta dall'istamina.

Questo istogramma mostra la percentuale di vasi sanguigni che perdono nei gruppi testati. In queste immagini viene presentata l'immunocolorazione per GFAP, che colora le cellule di Muller. La colorazione positiva si ottiene nei processi delle cellule di Muller, attraverso la retina e intorno ai vasi sanguigni.

Viene presentata l'ampiezza dei processi cellulari di Muller, di tutti i gruppi. Il trattamento con istamina, o LXA4 da solo, ha ridotto l'ampiezza del processo. Ma quando entrambi i reagenti sono stati applicati insieme, l'ampiezza del processo è stata recuperata.

In queste immagini viene presentata l'immunocolorazione per MAP2. Si osserva una colorazione positiva dai processi e dai corpi cellulari delle cellule ganglionari. Viene presentata la densità dei processi continui delle cellule gangliari positive MAP2 di tutti i gruppi.

Il trattamento con istamina riduce la continuità dei processi dendritici, mentre LXA4 non ha effetti significativi. Una volta padroneggiato, questo esperimento può essere eseguito in tre o cinque giorni, se eseguito correttamente, con cinque minuti per retina per la dissezione, sei minuti per il trattamento, seguiti da sezionamento, immunocolorazione e analisi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare tessuto fresco e controlli adeguati.

Seguendo questa procedura, è possibile aggiungere altri metodi, come l'imaging dal vivo, per monitorare in tempo reale i cambiamenti nei livelli di calcio e nelle proprietà mitocondriali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questo modello di coltura retinica acuta ex vivo, per creare una disfunzione BRB, per valutare il danno e per lo screening di potenziali farmaci. Grazie mille per aver guardato e tutto il meglio per i tuoi esperimenti.