Name: Un modello acuta della retina per la valutazione sanguigni della retina barriera breccia e potenziali farmaci per il trattamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Scopri un modello ex vivo della retina suina per valutare farmaci contro le lesioni della barriera emato-retinica indotte da istamina. Questo metodo a basso costo permette di analizzare la permeabilità dei vasi e l'attivazione delle cellule di Müller.

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Bringhurst Meats (Berlino, NJ) è riconosciuta per il suo aiuto genuino nel fornire i bulbi oculari ai suini.

Tutti i protocolli sono stati effettuati nel rispetto delle norme del Comitato di cura e l&#39;uso di animali istituzionale, se del caso. 1. Preparazione <ol><li> Preparare il supporto di stabilizzazione con il 75% di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), il 25% Hanks &#39;soluzione salina bilanciata (HBSS). Mescolare bene, aliquotare e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare il tampone fosfato (PBS) e sterilizzare in autoclave. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. Riscaldare la PBS a 37 ° C prima dell&#39;esperimento (5 ml per pozzetto). </li><li> Preparare 10%, 20% e 30% di saccarosio in PBS. Filtrare tutte le soluzioni individualmente oltre separati 0,22 micron filtri per la sterilizzazione. Salvare le soluzioni a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione di istamina magazzino in PBS ad una concentrazione di 90 mm. Sterilizzare la soluzione per filtrazione su filtro 0,22 micron. Aliquotare e salvare la soluzione a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento. </li><li> Rendere fresca 4% paraformaldeide (PFA) in PBS prima dell&#39;esperimento. Posizionarlo sul ghiaccio. Attenzione: tenere PFA in una cappa aspirante e indossare equipaggiamento protettivo. </li><li> Scongelare il supporto di stabilizzazione (20 ml per retina). Aggiungere penicillina-streptomicina ad una concentrazione finale di 100 U / ml. parte calda del mezzo (15 ml per retina) a 37 ° C in incubatore prima dell&#39;esperimento. Lasciare il resto del mezzo su ghiaccio. </li><li> Posizionare il HBSS (10 ml per retina) sul ghiaccio. </li></ol> 2. retina Cultura Organotipica <ol><li> Trasferire i campioni ad una cappa coltura tissutale. Aprire l&#39;oculare tagliando intorno alla lente. Utilizzando un pennello, rimuovere delicatamente il vitreo senza tirare sulla retina. staccare delicatamente la retina dal bordo di taglio con una spazzola per esporre il disco ottico. Grave il nervo ottico con un rasoio e rilasciare la retina. </li><li> Trasferire la retina in una capsula di Petri e risciacquare con cura la retina una volta con HBSS freddo. Trasferire il campione in HBSS su ICE. Sezionare il maggior numero di retine fuori, se necessario ripetendo passo 2.1 e questo passo. </li><li> Tagliare la retina a metà simmetricamente con un rasoio. Delicatamente trasferire i campioni di un 6-bene con 3 ml di mezzi di stabilizzazione per pozzetto. Consentire equilibrazione per 30 min a 37 ° C in un incubatore con l&#39;atmosfera contenente il 5% di CO 2. </li><li> Preparare i seguenti reagenti durante l&#39;incubazione a Passo 2.3: Diluire la soluzione di istamina magazzino alla concentrazione desiderata (450 micron) in media caldo. Sciogliere LXA4 (immagazzinato sotto argon) in mezzo ad una concentrazione finale di 250 ng / ml. NOTA: Quando si misura l&#39;effetto di LXA4, una metà da una singola retina viene utilizzato solo per l&#39;istamina, mentre l&#39;altra metà è utilizzato per l&#39;istamina con LXA4. </li><li> Aspirare il mezzo di stabilizzazione con attenzione e aggiungere il mezzo preparato in ogni pozzetto (3 ml per pozzetto). Incubare i campioni a 37 ° C per 1 ora in un incubatore con l&#39;atmosfera contenente il 5% di CO 2. </li><li> Sciacquare ilcampioni di volta in caldo, PBS sterile. </li></ol> 3. Preparare i campioni per Immunocolorazione <ol><li> Aspirare PBS dalle piastre. Aggiungere 4% PFA (3 ml per pozzetto) e incubare per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> aspirare rapidamente il PFA. Lavare i campioni una volta con PBS. Trasferire i campioni al 10% di saccarosio (5 ml per pozzetto) e incubare per 2 a 4 ore a 4 ° C. </li><li> Trasferire i campioni ad un saccarosio 30% (5 ml per pozzetto) e incubare una notte a 4 ° C. Mescolare una parte del mezzo di congelamento commerciale con due parti di 20% di saccarosio per rendere il mezzo congelamento lavorare. Lasciare a 4 ° C per una notte o più a lungo fino a quando l&#39;aria bolle scompaiono. </li><li> Trasferire i campioni al mezzo di congelamento di lavoro e raggiungere l&#39;equilibrio per 5 min a temperatura ambiente. Tagliare ogni retina in rettangoli (circa 3 mm di 5 mm). </li><li> Trasferire accuratamente i campioni nei mezzi congelamento lavorare contenuta in un contenitore cilindrico (circa 1 cm Altezza Raggio x 2 cm) devzato da un foglio di alluminio. Assicurarsi che le fette retiniche verticale (orientata per fornire una sezione trasversale della retina upon sezionamento) e congelare in azoto liquido. Salvare i blocchi a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Sezione ogni blocco su un criostato in 14 micron fette spesse e montare le sezioni su vetrini. Conservare i vetrini a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 4. immunocolorazione <ol><li> Lavare le sezioni con tampone fosfato 5% di saccarosio (SPB, 5% di saccarosio in PBS, pH 7,4) una volta. Bloccare le non specifici siti di legame incubando le sezioni in tampone di bloccaggio (5% SPB con 10% siero di capra normale e 0,5% Triton X-100) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare sezioni (su diapositive) con l&#39;anticorpo primario appropriata (GFAP o MAP2, diluito 1: 500 in tampone di bloccaggio) per 1 ora. Aspirare la soluzione. Lavare tre volte in 5% SPB. Per la colorazione del endogena IgG, saltare questo passaggio. </li><li> Incubare le sezioni con la seconda corrispondenteanticorpi Dary (Cyanine3 / FITC coniugato asino anti-topo / anti-IgG di coniglio, diluito 1: 800 in tampone di bloccaggio) per 1 ora. </li><li> Lavare le sezioni accuratamente con 5% SPB tre volte. Preparare i campioni per la microscopia da loro montaggio in mezzo di montaggio contenente DAPI e copertura con lamelle. </li><li> Utilizzando un laser microscopio confocale, catturare immagini attraverso una lente 20X sotto parametri identici come l&#39;intensità del laser, valore di guadagno, tempo di sosta, ecc tra i gruppi. Impostare le lunghezze d&#39;onda di eccitazione / emissione per il canale blu (per rilevare DAPI) come 408/447 nm, per il canale rosso (per rilevare Cyanine3) come 561/785 nm e per il canale verde (per rilevare FITC) come 488/525 nm . </li></ol> Analisi 5. Immagine <ol><li> Quantificare la percentuale dei vasi sanguigni che perde in base ai seguenti criteri 12: Include solo vasi sanguigni con nuclei delle cellule endoteliali all&#39;interno del piano di sezione nel conteggio; prendere in considerazione una che perde vaso sanguigno se mostra aggardiente di immunostaining che circonda la nave. </li><li> Per determinare il livello di espressione, selezionare regioni di interesse e misurare il valore di grigio medio utilizzando il software di analisi di immagine. </li><li> Per misurare la larghezza del processo, scegliere un&#39;area della sezione in cui i processi sono distinti (strato esterno nucleare ONL, per esempio). Quindi scegliere un campo ottico in cui tali processi sono visibili e continuo. Impostare la barra di scala in base all&#39;impostazione microscopico, tracciare una linea attraverso il processo ed eseguire la misurazione. </li><li> Per analizzare la continuità del processo, selezionare regioni di interesse, applicare il filtro chiamato varianza che esalta le bordi dell&#39;immagine sostituendo ogni pixel con la sua varianza zona, regolare automaticamente il contrasto e la luminosità, contare le righe e normalizzare il conteggio dal la zona. </li><li> Calcola significatività statistica con t-test di Student a due code. *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,01; ***, P &lt;0.001. Pmolto il risultato come media ± SEM. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo rapporto, presentiamo un potente modello retinico acuto ex vivo di disfunzione BRB utilizzando la retina suina. Questo sistema modello non richiede strumenti speciali e può essere facilmente adattato nella maggior parte delle impostazioni di laboratorio. Tuttavia, per ottenere un risultato di successo, diversi passaggi richiedono molta attenzione. Dopo aver ottenuto i bulbi oculari dalla fonte, questi devono essere conservati a 4 °C o su ghiaccio e lavorati il prima possibile. Quando si analizza l'effe...

Un crescente corpo di prove sostiene l&#39;esistenza di barriera retinica sangue (BRB) 1-5 e la sua somiglianza con la barriera emato-encefalica (BBB) ​​6,7. Compromesso della BBB è stata strettamente legata causalmente o come marcatore diagnostico per le malattie neurodegenerative croniche come il morbo di Alzheimer (AD) 8,9 e acuti condizioni come il delirio 10. intuizioni meccanicistici in queste patologie e scoperte per i potenziali bersagli farmacologici sono generalmente ostacolati dalla limitata accessibilità e network complessità del cervello. Alternative come l&#39;imaging in vivo 11, cervello organotipica cultura 12, colture cellulari primarie 13,14 e sistemi di co-coltura di 15 sono stati generati. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli richiede strumenti speciali, lunghi periodi sperimentali o più marcatori per identificare le cellule. somiglianze funzionali e strutturali tra BBB e BRB nonché una correlazione tra la dysfunctions dei due sono stati sostenuto 16-19. Inoltre, un più facile accesso, tipi cellulari ben definiti e una struttura stratificata hanno consentito la retina ben caratterizzato come una finestra al cervello. Le identità strutturali e funzionali della BBB e BRB ancora essere confrontato nel dettaglio. Tuttavia, patologie retiniche, soprattutto la breccia BRB, sono stati strettamente associati con la progressione di varie malattie, compreso il diabete 18-19 e AD 21,22. Pertanto, è di interesse per stabilire un sistema disfunzione BRB non solo per delineare il meccanismo ma anche per schermo potenziali farmaci. In questo rapporto, un protocollo che consente BRB disfunzione utilizzando una semplice cultura della retina acuta è sviluppato e presentato. Aumento della permeabilità BBB e cambiamenti patologici AD-simili sono stati stabiliti in una cultura organotipica cervello incubate con l&#39;istamina, un mediatore pro-infiammatorio 12. Pertanto, nel sistema presentato, istamina era applied alla cultura della retina ex vivo per indurre disfunzioni BRB. Retine da diverse specie, come il Mus musculus e Bos taurus, sono stati testati. Grazie alla loro disponibilità commerciale e somiglianza con tessuti umani, bulbi oculari suina fresca sono stati utilizzati per fornire i dati qui riportati. Dopo incubazione con istamina e / o altri farmaci, le retine sono state preparate per la valutazione mediante immunocolorazione per diverse proteine ​​12, come immunoglobuline G (IgG), uno dei principali componenti del sangue; proteina silicea fibrillare gliale (GFAP), un indicatore ben noto per l&#39;attivazione gliale; e proteine ​​associate ai microtubuli 2 (MAP2), una specifica dei neuroni del citoscheletro proteina essenziale per l&#39;assemblaggio dei microtubuli. Inoltre, la struttura a strati della retina consente un&#39;analisi dettagliata dei processi di cellule Müller e cellule gangliari, quali i cambiamenti nella loro larghezza e continuità. Così diversi parametri aggiuntivi sono disponibili per valutare le conseguenze dellaBRB violazione in una fase iniziale e per valutare gli effetti di inversione di potenziali trattamenti pure. In questo protocollo, i potenziali effetti di inversione dei farmaci schermati vengono valutati da tre prospettive: la fuoriuscita di vasi sanguigni (BVS), l&#39;attivazione delle cellule gliali e il danno-risposta delle cellule neuronali. Diversi metodi di quantificazione sono utilizzati, per esempio, il livello di espressione dimostra intensità della immunocolorazione, misura della larghezza di un processo e la continuità dei processi neuronali mostrati da un filtro accessorio. Per meglio illustrare il metodo e per interpretare i risultati, Lipoxin A4 (LXA4), un composto endogeno sintetizzato in risposta al danno infiammatorio e attenuando la disfunzione endoteliale 23, è stata scelta a scopo dimostrativo.

<table><tbody><tr><td>Tecnologie DMEM</td><td>Life&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>Istamina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Microscopia Elettronica Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Mezzi di congelamento&nbsp;</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Anticorpo</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC coniugato Donkey anti-coniglio IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 coniugato Asino anti-topo IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>supporto di montaggio contenente DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td>Microscopio confocale laser <td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopio</td><td></td><td>Nikon</td> Eclipse Ti</tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.45s</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello acuta della retina per la valutazione sanguigni della retina barriera breccia e potenziali farmaci per il trattamento

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Un sistema modello a basso costo, facile da usare e potente è stato istituito per valutare potenziali trattamenti che potrebbero migliorare la violazione della barriera emato-retinica. È stato dimostrato che un fattore infiammatorio, l'istamina, compromette l'integrità dei vasi nella retina in coltura attraverso la colorazione positiva delle IgG al di fuori dei vasi sanguigni. Gli effetti dell'istamina stessa e quelli dei farmaci candidati per potenziali trattamenti, come la lipossina A4, sono valutati utilizzando tre parametri: perdita di vasi sanguigni tramite immunocolorazione IgG, attivazione delle cellule di Müller tramite colorazione GFAP e cambiamento nei dendriti neuronali attraverso la colorazione per MAP2. Inoltre, l'organizzazione stratificata della retina consente un'analisi dettagliata dei processi delle cellule di Müller e dei gangliari, come i cambiamenti di larghezza e continuità. Sebbene i dati presentati riguardino la coltura retinica suina, il sistema è applicabile a più specie. Pertanto, il modello fornisce uno strumento affidabile per studiare gli effetti precoci della compromissione dell'integrità dei vasi retinici su diversi tipi di cellule e anche per valutare potenziali farmaci candidati per il trattamento.

Vi presentiamo un basso costo, sistema di time-efficiente e facile da usare per valutare i potenziali trattamenti che potrebbero proteggere contro la violazione BRB indotta da istamina. IgG è vincolato all&#39;interno dei vasi in retina di controllo (Figura 1A), ma le perdite fuori dei vasi sanguigni su esposizione istamina (Figura 1B), a conferma che il modello è stata stabilita. LXA4 è stato...

A basso costo, il sistema facile da usare e potente è stabilito per valutare i potenziali trattamenti che potrebbero migliorare barriera emato-retinica violazione indotta da istamina. perdita dei vasi sanguigni, l&#39;attivazione delle cellule Müller e la continuità dei processi neuronali sono utilizzati per valutare la risposta al danno e la sua inversione con un potenziale farmaco, Lipoxin A4.

Un modello acuta della retina per la valutazione sanguigni della retina barriera breccia e potenziali farmaci per il trattamento

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

L'obiettivo generale di questo sistema modello es vivo della retina è quello di eseguire lo screening di farmaci in grado di migliorare la compromissione della barriera emato-neurale. Questo metodo può rispondere a diverse domande fondamentali nel campo delle malattie neurodegenerative, ad esempio quali siano gli eventi iniziali e come possiamo effettuare lo screening di farmaci utili per il trattamento di tali pazienti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è a basso costo, di facile utilizzo, rapida e adattabile.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà poiché l'ottenimento di dati affidabili e riproducibili dipende dalle competenze tecniche necessarie per generare campioni di buona qualità. In questo caso si utilizzano retine di suino ottenute da una fonte commerciale. Dopo l'acquisto, i bulbi oculari devono essere mantenuti a quattro gradi, o sul ghiaccio, e processati il più rapidamente possibile.Iniziare la dissezione in una cappa per colture cellulari tagliando attorno al cristallino per aprire la cupola oculare. Quindi, utilizzando un pennello, rimuovere delicatamente l'umor vitreo senza tirare sulla retina. Usare un pennello per staccare delicatamente la retina dal margine tagliato, esponendo così il disco ottico.Recidere il nervo ottico con una lametta e liberare la retina. Trasferire la retina in una piastra di Petri e risciacquare delicatamente la retina una volta utilizzando HBSS freddo. Collocare il campione in HBSS su ghiaccio.Successivamente, utilizzare un rasoio per tagliare simmetricamente la retina in due metà. Quando sono necessari trattamenti, una metà della retina viene trattata, mentre l'altra metà della stessa retina deve essere processata per stabilire la linea di base e correggere le variazioni individuali tra gli animali. Trasferire delicatamente i campioni in una piastra a sei pozzetti contenente tre millilitri di mezzo di stabilizzazione per ogni pozzetto.Equilibrare le retine per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore con atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, aspirare con attenzione il mezzo di stabilizzazione e aggiungere tre millilitri di mezzo contenente istamina e LXA4 in ogni pozzetto. Incubare i campioni per un'ulteriore ora.Dopo aver lavato con PBS sterile tiepido, aggiungere tre millilitri di PFA al 4% in ogni pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Trascorso il tempo di incubazione, aspirare rapidamente il PFA e lavare i campioni una volta con PBS. Aggiungere saccarosio al 10% nei pozzetti e incubare per due-quattro ore a quattro gradi Celsius.Successivamente, sostituire il saccarosio al 10% con saccarosio al 30% e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Poi mescolare una parte di mezzo di congelamento commerciale con due parti di saccarosio al 20% per ottenere il mezzo di congelamento lavorativo. Lasciare a quattro gradi Celsius tutta la notte o più a lungo, fino a quando le bolle d'aria scompaiono.Il giorno successivo, sostituire la soluzione al 30% di saccarosio con il mezzo di congelamento lavorativo e lasciare equilibrare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'equilibrazione, tagliare ogni retina in rettangoli di tre millimetri per cinque millimetri, quindi congelare le fette di retina immergendole nel mezzo di congelamento contenuto in un cilindro di alluminio. Assicurarsi che le fette retiniche siano posizionate in verticale per ottenere una sezione trasversale della retina durante il taglio, e congelarle in azoto liquido.Tagliare ciascun blocco al criostato in sezioni da 14 micron e montarle su vetrini in vetro. Conservare i vetrini a meno 80 gradi Celsius fino all'uso. Iniziare la marcatura immunoistochimica lavando le sezioni con tampone fosfato di saccarosio al 5%, o SPB.Quindi bloccare i siti di legame non specifici, incubando le sezioni nel buffer di blocco per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, incubare le sezioni con l'anticorpo primario appropriato per un'ora. Trascorsa l'ora, aspirare la soluzione e lavare le sezioni tre volte in SPB al 5%.Quindi incubare i preparati con le corrispondenti immunoglobuline secondarie per un'ora, proteggendoli dalla luce. Dopo aver lavato i preparati tre volte con SPB al 5%, preparare i campioni per la microscopia montandoli in un mezzo contenente DAPI e coprendoli con coprioggetti. Infine, acquisire le immagini utilizzando un microscopio confocale.Per misurare la larghezza del processo, utilizzare lo strumento lente d'ingrandimento per selezionare un'area della sezione in cui i processi sono più evidenti, come ad esempio il layer nucleare esterno. Quindi scegliere un campo ottico in cui tali processi risultino visibili e continui. Fare clic sullo strumento analisi nel menu principale e successivamente su imposta scala nel sottomenu, per impostare la barra della scala in base all'impostazione microscopica.Selezionare la funzione linea nel menu principale e tracciare una linea attraverso il processo. Fare clic su analizza nel menu principale, quindi fare clic su misura nel sottomenu, per eseguire la misurazione. Per analizzare la continuità del processo, tornare al menu principale e utilizzare la funzione poligono per selezionare il livello plessiforme interno come area di interesse.Misurare l'area facendo clic su analizza e quindi su misura. Fare clic su elabora, filtro e quindi su varianti, per migliorare i bordi nell'immagine sostituendo ciascun pixel con la variante del suo intorno. Quindi regolare automaticamente contrasto e luminosità facendo clic su immagine, regola, luminosità e contrasto, e infine su auto nel sottomenu.Quindi conta le linee. In queste immagini, l'immunoreattività di IGG appare in rosso. Nei gruppi di controllo, l'IGG è limitata ai vasi sanguigni.Nel gruppo trattato con istamina, l'IGG viene rilevata all'esterno dei vasi sanguigni, dove forma nuvole di fuoriuscita indicate da cerchi tratteggiati. Nei gruppi trattati con LXA4, l'IGG è nuovamente confinata all'interno dei vasi sanguigni. L'ulteriore aggiunta di LXA4 ripristina la funzione dei vasi compromessa dall'istamina.Questo istogramma mostra la percentuale di vasi sanguigni permeabili nei diversi gruppi testati. In queste immagini è presentata la colorazione immunologica per GFAP, che evidenzia le cellule di Müller. La colorazione positiva è osservata nei prolungamenti delle cellule di Müller, attraverso la retina e intorno ai vasi sanguigni.Viene presentata la larghezza dei processi delle cellule di Muller, provenienti da tutti i gruppi. Il trattamento con istamina o con LXA4 da solo ha ridotto la larghezza dei processi. Tuttavia, quando entrambi i reagenti sono stati applicati insieme, la larghezza dei processi è stata ripristinata.In queste immagini viene presentata la colorazione immunoistochimica per MAP2. Si osserva una colorazione positiva nei prolungamenti e nei corpi cellulari delle cellule gangliari. Viene mostrata la densità dei prolungamenti continui delle cellule gangliari positivi per MAP2 di tutti i gruppi.Il trattamento con istamina riduce la continuit&agrave; dei processi dendritici, mentre l'LXA4 non ha effetti significativi. Una volta acquisita padronanza, questo esperimento pu&ograve; essere eseguito in tre-cinque giorni, se svolto correttamente, con cinque minuti per retina per la dissezione, sei minuti per il trattamento, seguiti da sezionamento, immunomarcatura e analisi. Durante il tentativo di questa procedura, &egrave; importante utilizzare tessuti freschi e controlli adeguati.Al termine di questa procedura, possono essere aggiunti altri metodi come l'immagine in tempo reale, per monitorare in tempo reale i cambiamenti nei livelli di calcio e nelle proprietà mitocondriali. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come utilizzare questo modello di coltura retinica acuta ex vivo, per indurre una disfunzione della barriera emato-retinica, valutare i danni e selezionare potenziali farmaci. Grazie mille per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Un modello acuta della retina per la valutazione sanguigni della retina barriera breccia e potenziali farmaci per il trattamento (Video) | JoVE Journal

Un modello acuta della retina per la valutazione sanguigni della retina barriera breccia e potenziali farmaci per il trattamento

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