Un test CFSE-based per studiare la migrazione delle cellule dendritiche murini della pelle in drenanti linfonodi durante l'infezione con

L'obiettivo generale di questo saggio basato su un marcatore fluorescente cellulare è monitorare e caratterizzare specifiche popolazioni cellulari di interesse mentre migrano dalla cute al linfonodo drenante dopo un'infezione del pad plantare con Bacillo di Calmette-Guérin, o BCG. Abbiamo utilizzato questa tecnica per identificare la popolazione di cellule dendritiche che raggiunge il linfonodo drenante dopo l'infezione cutanea da BCG. Questa tecnica ha permesso di studiare la migrazione cellulare iniettando i tumori entro una finestra temporale definita di 24 ore.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di iniezione nel cuscinetto plantare e di isolamento del linfonodo sono difficili da apprendere solo tramite testo. Per l'iniezione di microbatterio Bovus BCG, dopo aver verificato il livello appropriato di sedazione mediante pizzicamento del dito del piede, utilizzare una siringa dotata di un ago da 29 gauge e 1/2 pollice per inoculare il cuscinetto plantare posteriore di un topo di otto-dodici settimane con uno per dieci alla sesta unità formanti colonie del batterio in 30 microlitri di PBS. Iniettare nei cuscinetti plantari di controllo solo PBS.

Quindi monitorare gli animali fino a quando non sono completamente distesi e in grado di appoggiare il peso sul cuscinetto plantare iniettato. Per l'iniezione di CFSE, al tempo appropriato dopo l'iniezione di BCG, diluire dieci volte in PBS un'ampolla di CFSE a temperatura ambiente e a concentrazione di cinque millimolari, avendo cura di risospendere completamente la soluzione. Successivamente, caricare la siringa con il CFSE diluito ed iniettare 20 microlitri nello stesso cuscinetto plantare posteriore che ha ricevuto la prima iniezione.

24 ore dopo l'iniezione di CFSE, effettuare con attenzione un'incisione verticale nella coscia posteriore ed eliminare il grasso muscolare. Successivamente, utilizzare forbici e pinzette per esporre ed escindere il linfonodo popliteo, situato in profondità all'interno della borsa adiposa nella piega del ginocchio. Trasferire il linfonodo in 0,5 millilitri di PBS sterile su ghiaccio ed omogeneizzare il linfonodo attraverso un filtro cellulare da 70 micron all'interno di un pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente cinque millilitri di PBS, usando la parte posteriore di una siringa da tre millilitri.

Lavare il filtro con altri 5 millilitri di tampone e trasferire la soluzione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Successivamente, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in un volume sufficiente di tampone. Per etichettare le cellule per la citometria a flusso, dividere da uno a dieci milioni di cellule in tubi rotondi in polistirene da 5 millilitri e lavare le cellule con tampone FACS fresco.

Risospendere i pellet in 50-100 microlitri di un cocktail di anticorpi appropriato contenente anti-mouse CD16 CD32 per bloccare le interazioni non specifiche mediate da FC nel buffer FACS su ghiaccio, protetto dalla luce. Dopo 30-45 minuti, lavare le cellule in buffer FACS e risospendere i pellet in 50-100 microlitri di buffer FACS fresco. La maggior parte della marcatura con CFSE nel linfonodo popliteo si osserva in cellule MHC-II alta e CD11c positiva bassa, coerentemente con cellule dendritiche della cute che migrano verso linfonodi drenanti la cute.

Sia la frequenza che il numero totale di queste cellule marcate risultano aumentati nei linfonodi poplitei di topi infettati con BCG, rispetto ai controlli inoculati con PBS, suggerendo che il BCG potenzia il reindirizzamento di queste cellule verso il linfonodo drenante. Le cellule dendritiche della cute continuano a entrare nel linfonodo drenante fino a cinque giorni dopo l'infezione, estendendo la migrazione delle cellule dendritiche nel modello attuale ben oltre la tempistica dell'attivazione iniziale dei linfociti T CD4 positivi specifici per l'antigene nel linfonodo popliteo. Inoltre, le cellule dendritiche migratorie della cute esprimono livelli elevati di molecole co-stimolatorie, sostenendo l'ipotesi che queste cellule dendritiche migratorie siano attivate.

È importante notare che sia le cellule dendritiche monocitoidi che plasmacitoidi resistenti nei linfonodi, che entrano nei linfonodi infiammati attraverso venule ad endotelio alto e non attraverso linfatici afferenti, sono negative per CFSE, confermando ulteriormente che la marcatura con CFSE avviene principalmente nella pianta del piede. Inoltre, ulteriori analisi mediante citometria a flusso rivelano che una sottopopolazione di cellule EpCAM bassa CD11b alta rappresenta il principale sottoinsieme di cellule dendritiche cutanee migratorie che drena al linfonodo popliteo in risposta all'infezione da BCG. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque minuti se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questo processo, è importante prestare attenzione al sito di iniezione e al volume iniettato; si deve fare molta attenzione a non danneggiare il linfonodo drenante durante la dissezione. Dopo la procedura, altri metodi come la citometria a flusso o la microscopia confocale possono essere eseguiti per un'ulteriore analisi dell'espressione microscopica cellulare specifica per sottopopolazioni. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per tracciare le cellule dalla cute al linfonodo drenante entro un periodo di 24 ore in risposta a un'infezione o a una vaccinazione.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire iniezioni nel cuscinetto plantare e di come localizzare e isolare i linfonodi drenanti per il tracciamento e la caratterizzazione delle popolazioni di cellule dendritiche migratorie di interesse.