Name: Trasduzione-trapianto modello murino di neoplasia mieloproliferativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Scopri il metodo di trasduzione-trapianto per generare modelli murini con espressione genica nelle cellule ematopoietiche. Questa tecnica consente di studiare le neoplasie mieloproliferative e testare terapie in vivo.

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Questo lavoro è supportato dalla V Foundation Scholar (AGF) e dalla MPN Research Foundation (AGF).

Questo studio è stato approvato e realizzato in conformità con le raccomandazioni del Comitato Istituzionale Animal cura e l&#39;uso presso l&#39;Università della California, Irvine. Tutte le procedure sono state eseguite in anestesia isoflurano e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo le sofferenze. 1. Generazione di Ecotropic Retrovirus <ol><li> Preparare plasmidi di alta qualità, con una concentrazione di almeno 1 mg / mL utilizzando un kit di maxi-prep commerciale o purificazione di cloruro di cesio. NOTA: Queste includono un vettore backbone MSCV codificante il gene di interesse (in questo caso CALR 7,8) e marker di scelta (GFP, Neo, ecc) così come un plasmide di confezionamento ecotropic, codifica gag-pol-env (denominato qui come plasmide). </li><li> Scongelare ed espandere cellule 293T bassa di passaggio in DMEM supplementato con 10% FBS e L-glutammina con la penicillina / streptomicina (D10). Piastra 5 x 10 6 cellule in un 10 centimetri di tessuto piatto di coltura trattata in un umidificatacoltura tissutale incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Espandere le cellule 293T in coltura. Il giorno prima trasfezione, lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml di PBS e aspirare il surnatante in un pallone a vuoto. </li><li> Per trypsinize cellule, aggiungere 2 ml 0,05% tripsina e incubare piatti in umidificato coltura tissutale incubatore per 2 - 3 min a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Per interrompere tripsinizzazione, aggiungere 3 ml D10 a piatto e le cellule di trasferimento ad un tubo da 15 ml. Spin cellule a 400 xg per 10 min. </li><li> Aspirare il surnatante in una boccetta di vuoto e risospendere pellet di cellule in 2 ml D10. </li><li> Contare le cellule di esclusione trypan blu utilizzando un emocitometro. </li><li> Seed 2 x 10 6 cellule per piatto in tre 10 cm di tessuto piatti della cultura trattati per virus generati. NOTA: Per ottenere risultati ottimali, non consentono alle cellule di superano il 30 - 50% confluenza al momento della trasfezione o di una cattiva resa virus può essere ottenuto. </li><li> Immediatamente prima trasfezione,mezzi aspirato in un pallone a vuoto e sostituirli con 5 ml D10 fresco. </li><li> Per ogni 10 cm Petri da transfettate preparare un individuo sterile provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Pipettare 760 ml di mezzi siero ridotto in ciascuna provetta, quindi aggiungere con cautela 40 ml di reagente di trasfezione direttamente nel supporto. Incubare le provette nella cappa coltura tissutale a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere 30 mg di MSCV vettore con il gene di interesse (15 mcg se si utilizza vettore vuoto) e 5 mg di plasmide per ogni rispettivo tubo e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Incubare a temperatura ambiente nella cappa coltura tissutale per altri 15 min. NOTA: i vettori più piccoli tendono ad avere rendimenti più elevati virali. </li><li> Aggiungere con cautela il volume totale di ogni reazione (circa 800 ml) goccia a goccia nel rispettivo 10 centimetri Petri e inclinare leggermente il piatto da un lato all&#39;altro per mescolare. Rientro cellule per il cu tessuti umidificataincubatore lture. </li><li> A seguito di una 8 ore o l&#39;incubazione durante la notte in coltura tissutale incubatore, i media aspirato in una boccetta di vuoto e delicatamente sostituire con 10 ml di D10 fresco. </li><li> A 48 ore dopo la trasfezione raccogliere surnatante in una siringa da 35 ml e filtrare attraverso una membrana da 0,45 micron per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> OPTIONAL: 10 ml D10 fresca torna sulle cellule 293T e virus supplementare può essere raccolto in 72 ore dopo la trasfezione. </li><li> Smaltire cellule 293T in rifiuti biologici in assenza di virus vengono raccolte. </li><li> surnatante virale Aliquota in volumi monouso (ad esempio 1 ml per titolo virale o 6.5 ml per l&#39;infezione da BM). virus Flash-congelamento con azoto liquido e virus conservare a -80 ° C. NOTA: Evitare ripetuti cicli di congelamento / scongelamento in quanto riducono notevolmente titolo virale. </li></ol> 2. Determinare relativo titolo virale mediante citometria di flusso <ol><li> Scongelare 3T3 e mantenere in D10. Coltivare le cellule in un cm 10tessuto-coltura trattata piatto in un incubatore umidificato coltura tissutale a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Eseguire titolo virale in triplice copia. Per preparare le cellule, lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml di PBS e aspirare il surnatante in un pallone a vuoto. </li><li> Per trypsinize cellule, aggiungere 2 ml 0,05% tripsina e incubare piatti in un incubatore umidificato coltura tissutale a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Per interrompere tripsinizzazione, aggiungere 3 ml D10 a piatto e le cellule di trasferimento ad un tubo da 15 ml. Spin cellule a 400 xg per 10 min. </li><li> Aspirare il surnatante in una boccetta di vuoto e risospendere pellet di cellule in 2 ml D10. </li><li> Contare le cellule di esclusione trypan blu utilizzando un emocitometro. </li><li> Seme 3T3 con una densità di 1 x 10 5 cellule in quindici tessuti piatti 60 mm coltura trattata e incubare durante la notte. </li><li> Rendere 1: 3, 1:10, 1:30 e 1: 100 diluizioni del surnatante virale scongelato utilizzando D10 in un totale di 1 ml. Anche un controllo privo di virus. </li><li> mi aspiraredia da 3T3 in una beuta da vuoto e sostituirlo con 4 ml di D10. </li><li> Sovrapponete le cellule 3T3 con le diluizioni di surnatante virale e aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 8 mg / ml per ogni piatto. Incubare per 48 ore in coltura tissutale incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Determinare titolo virale relativa mediante citometria di flusso: <ol><li> Per lavare le cellule, aspirare i media in un pallone vuoto e aggiungere 5 ml di PBS. </li><li> Aspirare il PBS in un pallone a vuoto. Aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina e incubare a 37 ° C per 2 - 5 minuti per staccare le cellule dal piatto. </li><li> Aggiungere 3 ml D10 e pipetta su e giù per staccare i restanti cellule dalla piastra. Trasferire le cellule in una provetta FACS e centrifugare a 400 xg per 10 min. </li><li> Decantare il surnatante e lavare le cellule con 3 ml di PBS. Centrifugare a 400 xg per 10 minuti e il surnatante decantare. Risospendere in 200 l di PBS. </li><li> Cellule eseguito su un citofluorimetro 9. Raccogliere tra 20.000 - 30.000 eventi all&#39;interno tegli vive porta cellulare (determinata dalla FSC e SSC) e calcolare la percentuale di GFP + e GFP - cellule. NOTA: Il titolo virale è considerato accettabile 1:30 diluizione virale rendimenti surnatante almeno 50% GFP + cellule 3T3. Se poi i risultati non ottimali di trasduzione possono ottenere questo risultato diluizione nelle cellule meno del 50% GFP +. Il calcolo per determinare titolo virale è stato adattato da Limon et al. , Sangue (1997) 9. </li><li> Per determinare relativo titolo del virus, utilizzare l&#39;equazione: titolo del virus = unità formanti di particelle (PFU) / ml = [(Numero di 3T3 × Frequenza di GFP + cellule) / volume del surnatante (ml)] × Fattore di diluizione. </li></ol></li></ol> 3. trasdurre donatori cellule del midollo osseo <ol><li> Per preparare topi donatori per il midollo osseo (BM) raccolto, prima anestetizzare topi di vaporizzatore isoflurano con una portata di 5% supplementare combinatoossigeno a 1 L / min. Pinch piede per valutare la reattività. NOTA: i topi donatori (meno di 8 settimane di età) devono essere preparati 5 giorni prima della raccolta di midollo osseo (8 giorni prima del trapianto). Uno topi donatori forniranno abbastanza cellule per almeno 2 destinatari. </li><li> Iniettare 150 mg / kg 5-fluorouracile (5-FU) tramite iniezione retro-orbitale nei topi anestetizzati con un 27 G × ½ &quot;ago. ATTENZIONE! 5-FU un agente chemioterapico antitumorale. Maneggiare sempre 5-FU all&#39;interno di una cappa certificata o un armadio biosicurezza canalizzata. Consultare il comitato di sicurezza di laboratorio e degli animali dell&#39;istituzione per determinare un&#39;adeguata etichettatura dei topi trattati con 5-FU. <ol><li> Posizionare il mouse anestetizzato su un lato e frenare utilizzando sia il pollice e l&#39;indice tale che l&#39;occhio sporge leggermente dalla testa. </li><li> Partendo laterale ago al canto mediale e con lo smusso rivolto verso l&#39;alto, inserire l&#39;ago con un 45° l&#39;angolo in direzione mediale e fermarsi quando è a metà strada inserito l&#39;ago. Lentamente iniettare le cellule e rimuovere rimuovere con attenzione l&#39;ago. NOTA: Se questa tecnica viene eseguita correttamente, l&#39;occhio deve rientrare un po &#39;e nessuna resistenza deve essere sentito al momento dell&#39;inserimento dell&#39;ago. </li><li> Esaminare il mouse per eventuali segni di lesioni, come gonfiore o sanguinamento. </li></ol></li><li> Harvest midollo osseo 5 giorni dopo il 5-FU trattamento (3 giorni prima del trapianto). <ol><li> Anestetizzare topi di vaporizzatore isoflurano con una portata di 5% ossigeno supplementare combinata 1 L / min. Pinch piede per valutare la reattività. </li><li> Sacrifice mouse dislocazione cervicale. Sterilizzare il mouse a spruzzo generosamente con il 70% EtOH fino pelliccia si bagna. </li><li> Utilizzando dissezione forbici, fare una incisione nella pelle e sezionare la fascia lontano dai muscoli delle gambe. Successivamente, sezionare la gamba dal mouse recidere il femore a livello dell&#39;anca e la tibia alla caviglia. </li><li> piegarela gamba in una forma a &quot;L&quot; e separare ogni osso della gamba tagliando al ginocchio con le forbici dissezione. </li><li> Per rimuovere la cartilagine alle estremità distali di ciascun osso della gamba, utilizzare le forbici dissezione per raschiare delicatamente muscolare verso una estremità della gamba ossa fino cartilagine è disimpegnato. </li><li> Usando una siringa con un ago 27 G x ½ pollici, flush ogni osso gamba con PBS integrato con il 2% FBS su una membrana di nylon 100 mM in una provetta conica da 50 ml. osso a filo fino a quando l&#39;osso diventa bianco per massimizzare il numero di cellule raccolte. </li><li> Utilizzare lo stantuffo di una siringa per schiacciare cellule attraverso la membrana di nylon nel tubo conico 50 ml per ottenere una sospensione di cellule singole. Ripetere con l&#39;altra gamba del mouse. </li></ol></li><li> cellule centrifugare a 4 ° C per 10 min a 400 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere BM in 5 ml di cloruro di ammonio di potassio (ACK) buffer per lisare i globuli rossi. Incubare le cellule in ghiaccio per 10 min. </li><li> Riempire il tubo con PBS per fermare la lisi cellulare. Centricellule Fuge a 4 ° C per 10 min a 400 xg ed eliminare il surnatante. Ripetere il passaggio lisi se il pellet BM ha colore rosso. </li><li> Risospendere in 5 ml di PBS e contare le cellule di esclusione trypan blu utilizzando un emocitometro. </li><li> Risospendere le cellule a 2 x 10 6 cellule per m con 2x cocktail pre-stimolazione contenente DMEM integrato con 20% FBS, L-glutammina, penicillina / streptomicina, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) e SCF (112 ng / ml). Piastra 2 ml per pozzetto in 6 pozzetti. </li><li> Incubare le cellule per una notte a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Aggiungere 2 ml di surnatante virale ad ogni pozzetto contenenti cellule BM e aggiungere polibrene (8 mg / ml). piastre Spin a 30 ° C per 90 min a 1500 xg per poi tornare piastra per coltura tissutale incubatore overnight. </li><li> sospensione cellulare Pipettare in tubi conici e centrifugare a 4 ° C per 10 min a 400 xg, non gettare la piastra. Risospendere le cellule in 2 ml fresca 2x cocktail pre-Stim per bene e tornare ai pozzi originali. </li&gt; <li> Eseguire un spinoculation 2 ° ripetendo i passaggi 3.7-3.9. </li></ol> 4. Cellule trapianti in topi riceventi <ol><li> Preparare topi riceventi singenici per il trapianto con dose letale irradiazione corporea totale &lt;24 ore prima dell&#39;iniezione di cellule BM. NOTA: irradiazione dose letale per / c topi BALB è tipicamente 800-900 cGy e 1000-1200 cGy per C57B / 6 10. La dose è di solito divisa in due sessioni di irradiazione distanziati di almeno 3-4 ore di distanza. </li><li> Continua da punto 3.11, le cellule del donatore raccolto trasdotte dai 6 pozzetti pipettando delicatamente surnatante in tubi conici. Lavare ogni pozzetto con 1 ml di PBS per raccogliere le cellule residue e aggiungere a 50 ml provette coniche. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di 0,05% tripsina ai pozzetti e incubare a 37 ° C in incubatore cultura tissutale per 5 min. </li><li> Aggiungere 1 ml D10 di pozzi e staccare eventuali cellule rimanenti delicatamente pipettando. Aggiungere cellule al rispettivo tubos dal punto 4.2 e pellet per centrifugazione a 4 ° C per 10 min a 400 x g. </li><li> Lavare le cellule con PBS e centrifugare a 4 ° C per 10 min a 400 x g. Risospendere in 5 ml di PBS e contare le cellule utilizzando un emocitometro da trypan blu. NOTA: Se il vettore ha un tag GFP quindi di quantificare la percentuale di cellule GFP-positive con un citofluorimetro. </li><li> Risospendere 5 x 10 5 - 2 x 10 6 cellule in 50 - 100 microlitri di PBS per iniezione in topi. </li><li> Iniettare cellule tramite iniezione retro-orbitale in topi anestetizzati con una sterile 27 G x ½ &quot;ago. NOTA: Altre tecniche di iniezione includono coda vena splenica o femorale. <ol><li> Anestetizzare il mouse con isoflurano e un pizzico piedi per valutare la reattività. </li><li> Posizionare il mouse su un lato e frenare utilizzando sia il pollice e l&#39;indice tale che l&#39;occhio sporge leggermente dalla testa. </li><li> Con lo smusso rivolto verso l&#39;alto, inserire il nEedle lateralmente al canto mediale a 45 °. NOTA: Se questa tecnica viene eseguita correttamente, l&#39;occhio deve rientrare un po &#39;e nessuna resistenza deve essere sentito al momento dell&#39;inserimento dell&#39;ago. </li><li> Esaminare il mouse per eventuali segni di lesioni, come gonfiore o sanguinamento. NOTA: i topi trapianto seguito dovranno emocromo bassi per un certo numero di settimane e quindi sono suscettibili alle infezioni. Profilassi con antibiotici o uso di acqua acidificata può essere utilizzato. </li></ol></li><li> Un mese dopo il trapianto, misurare la GFP% nel sangue periferico come un indicatore per le cellule del donatore trapiantate mediante citometria di flusso. NOTA: GFP da sola non può determinare il successo di attecchimento delle cellule. La trasduzione virale potrebbe non essere riuscito ancora attecchimento potrebbe essersi verificato. In questo caso, non le cellule GFP + sarebbero rilevati, ma l&#39;attecchimento delle cellule trapiantate ha avuto successo. <ol><li> Prendere 10 ml di sangue periferico By la puntura della vena safena della gamba con un 21 G x 1 ½ &quot;siringa e aggiungerlo a 100 mm EDTA in PBS per prevenire la coagulazione. </li><li> Aggiungere 1 ml di ACK al sangue e lisare in ghiaccio per 10 min. Cellule pellet per centrifugazione a 400 xg per 10 min. </li><li> Aspirare il surnatante in un pallone vuoto e aggiungere 1 ml di PBS integrato con il 2% FBS per fermare lisi. Cellule pellet per centrifugazione a 400 xg per 10 min. </li><li> Aspirare il surnatante in un pallone vuoto e risospendere pellet in 100 ml di PBS integrato con il 2% FBS. </li><li> Esegui campioni su un citofluorimetro e raccogliere 300.000 eventi all&#39;interno del cancello cellule vive (determinata dalla FSC e SSC) e calcolare la percentuale di GFP + e GFP - cellule 9. </li></ol></li><li> Inoltre a 1 mese post-trapianto, effettuare emocromo completo (CBC) utilizzando un processo automatizzato analizzatore ematologico veterinaria 18 per monitorare la progressione della malattia. NOTA: Continuare a monitorare la malattia da%GFP nel sangue periferico e CBC mensile. </li><li> Per terminare l&#39;esperimento, anestetizzare il mouse con isoflurano e un pizzico piedi per valutare la reattività. Sacrifice mouse dislocazione cervicale e la raccolta della milza e del midollo osseo per istopatologia. NOTA: La durata dell&#39;esperimento è personale e la data di scadenza dovrebbe essere valutata sulla base della malattia fenotipo atteso. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come eseguire trapianti di midollo osseo in topi ricapitolare una malattia essenziale trombocitemia simile con la progressione di mielofibrosi con CALRdel52 mutazione come il conducente della malattia. il trapianto di successo di cellule che esprimono i risultati CALRdel52 un aumento delle piastrine, l&#39;espansione dei megacariociti, e fibrosi del midollo osseo. Come trapianto di midollo osseo è un processo a più fasi, è importante riconoscere passaggi dove err...

Trasduzione-trapianto è un metodo utile per modellare neoplasie ematologiche nei topi. Questa tecnica è stata particolarmente utile per lo studio di neoplasie mieloidi risalenti alla prima dimostrazione che l&#39;espressione ectopica di BCR-ABL1 potrebbe fedelmente ricapitolare leucemia mieloide cronica nei topi 1. Questa tecnica ha successivamente facilitato l&#39;ampio studio di JAK2 V617F e MPL W515K / L mutato neoplasia mieloproliferativa (MPN). MPN sono un gruppo di neoplasie ematologiche caratterizzate dalla sovrapproduzione di cellule mieloidi mature e fibrosi del midollo osseo. Queste malattie in genere derivano dall&#39;espansione clonale di una cellula staminale emopoietica che ha acquisito una mutazione somatica in entrambe le Jak2, MPL, o CALR. Trasduzione-trapianto di JAK2 V617F e MPL W515K / modelli L mostra le caratteristiche cliniche della policitemia vera e mielofibrosi 2-5 &lt;/ Sup&gt;. Di recente, un modello murino di calreticulin-mutato MPN è stato anche generato con il metodo di trasduzione-trapianto 6. Questi topi sviluppano una malattia trombocitemia essenziale simile ad un aumento delle piastrine, aumento del numero di megacariociti, e fibrosi del midollo osseo. Insieme, questi modelli non solo hanno fornito l&#39;occasione al fine di conoscere la patogenesi molecolare di MPN, ma anche la capacità di sviluppare e studiare terapie in un ambiente pre-clinica. Questo manoscritto fornisce una descrizione dettagliata della metodologia di trasduzione-trapianto con una particolare attenzione per la mutazione CALRdel52. Questa tecnica prevede il trapianto di cellule del midollo osseo retrovirally trasdotte che esprimono il mutante costrutto in topi riceventi singenici irradiati.

<table><tbody><tr><td>Cell Lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>3T3 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Plasmidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoPak, noto anche come pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>12371</td><td>Le linee cellulari di imballaggio retrovirale, come EcoPack 2-293, possono essere utilizzate al posto del plasmide EcoPak e delle cellule 293T standard. Ulteriori plasmidi per l'involucro e l'imballaggio del &gamma;-retrovirus sono disponibili da Addgene e altri.</td></tr><tr><td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td><td>Addgene</td><td>20672</td><td>Ulteriori plasmidi di trasferimento &gamma;-retrovirale sono disponibili da Addgene e altri.</td></tr><tr><td>Materiali di consumo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2" aghi</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Corning</td><td>MT-35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina/L-glutammina</td><td>Corning</td><td>MT-30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Corning</td><td>MT-25-052-CI</td><td>Può essere fatto in casa</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Piastre da 10 cm</td><td>Fisher</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici da 15 ml</td><td>Fisher</td><td>12565268</td><td></td></tr><tr><td>Piastre da 60 mm</td><td>Fisher</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td></td></tr><tr><td>5-FU</td><td>Fisher</td><td>A13456-06</td><td></td></tr><tr><td>100 &#181; filtri per cellule m</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>provette coniche da 50 ml</td><td>Fisher</td><td>12565270</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>Fisher</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>Provette FACS</td><td>Fisher</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtri per siringhe</td><td>Fisher</td><td>0974061B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>tampone ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Può essere fatto in casa</td></tr><tr><td>Vaccino ricombinante IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Vaccino ricombinante IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>Vaccino ricombinante SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365809001</td><td>Reagente per trasfezione</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr>BD <tr><td>Irradiatore</td><td></td><td></td><td></td> a raggi X</tr> <tr><td>Accuri C6</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

trasduzione-trapianto modello murino di neoplasia mieloproliferativa

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

La trasduzione-trapianto è un modo rapido ed efficiente per modellare le neoplasie ematologiche umane nei topi. Questa tecnica determina l'espressione del gene di interesse nelle cellule ematopoietiche e può essere utilizzata per studiare il ruolo del gene nell'emopoiesi normale e/o maligna. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata su come eseguire la trasduzione-trapianto utilizzando come esempio le mutazioni della calreticulina (CALR) recentemente identificate nella neoplasia mieloproliferativa (MPN). In questo protocollo, le cellule intere del midollo osseo provenienti da topi donatori trattati con 5-flurouracil (5-FU) vengono trasdotte con un CALR mutante codificante un retrovirus e trapiantate in ospiti singegenici irradiati letalmente. Le cellule del donatore che esprimono CALR mutante sono marcate con la proteina fluorescente verde (GFP). I topi trapiantati sviluppano un fenotipo MPN che include piastrine elevate nel sangue periferico, espansione dei megacariociti nel midollo osseo e fibrosi del midollo osseo. Forniamo un resoconto passo dopo passo di come generare retrovirus, calcolare il titolo virale, trasdurre intere cellule del midollo osseo e trapiantare in topi riceventi irradiati.

La tecnica trasduzione-trapianto comporta ricostituzione ematopoietica dei topi riceventi con cellule esprimenti il ​​gene di interesse. La Figura 1 mostra una panoramica del modello di topo trasduzione-trapianto di calreticulin mutato MPN. In breve, retrovirus che esprimono CALRwt o CALRdel52 viene utilizzato per infettare le cellule BM da un topo donatore C57B / 6. cellule trasdotte vengono trapiantate in irradiato C57B / 6 del mouse ricevente e donatore di attecchimen...

Questo manoscritto fornisce una descrizione della metodologia utilizzata per stabilire modelli murini di trasduzione-trapianto. Viene fornito un resoconto dettagliato degli errori tecnici da evitare durante l'esecuzione dei trapianti di midollo osseo. Dovrebbe essere acquisita una chiara comprensione dell'importanza dell'alto titolo virale, della trasfezione/trasduzione e dell'irradiazione.

Trasduzione-trapianto modello murino di neoplasia mieloproliferativa

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare topi che esprimono il gene di interesse nelle cellule ematopoietiche utilizzando il metodo di trasduzione-trapianto. In un breve lasso di tempo, questo metodo può aiutare a determinare se il gene di interesse induce una malignità ematologica. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi delle malignità ematologiche, grazie allo sviluppo accelerato di modelli murini in grado di testare potenziali terapie.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle malattie ematologiche, può anche essere utilizzato per studiare il ruolo di un gene di interesse nell'ematopoiesi normale. In generale, le persone nuove a questo esperimento potrebbero incontrare difficoltà, poiché richiede diverse fasi. Inoltre, la generazione di un virus ad alto titolo è fondamentale per il successo di questo esperimento.La dimostrazione visiva di questa procedura è importante, poiché lavorare con i topi può essere difficile e richiede pratica. Dopo aver anestetizzato un topo e verificato la profondità dell'anestesia secondo il protocollo descritto nel testo, posizionare l'animale su un fianco e, utilizzando pollice e indice, immobilizzarlo in modo che l'occhio sporga leggermente dalla testa. Per iniettare 150 milligrammi per chilogrammo di 5-fluorouracile, o 5-FU, mediante iniezione retro-orbitaria, inserire un ago da 27 gauge e mezzo pollice con un angolo di 45 gradi, con il bevel rivolto verso l'alto in direzione mediale, e fermarsi quando l'ago è inserito per metà.Iniettare lentamente la soluzione, quindi rimuovere con attenzione l'ago. Esaminare il topo alla ricerca di segni di lesioni, come gonfiore o sanguinamento, e assicurarsi che il topo si riprenda e inizi a camminare. Cinque giorni dopo, a seguito dell'eutanasia dell'animale secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare il topo spruzzandolo abbondantemente finché il pelo non diventa bagnato.Con forbici da dissezione, praticare un'incisione nella pelle e dissezionare la fascia dai muscoli della gamba. Successivamente, staccare la gamba dal topo recidendo il femore a livello dell'anca e la tibia alla caviglia. Piegate la gamba a forma di L e utilizzate le forbici da dissezione per separare ciascun osso della gamba tagliando all'articolazione del ginocchio.Quindi, staccare delicatamente il muscolo verso un'estremità dell'osso della gamba finché la cartilagine non si stacca. Successivamente, utilizzando una siringa con un ago da 27 gauge di mezzo pollice, lavare ogni osso della gamba in PBS integrato con FBS al 2% su una membrana in nylon da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri, fino a quando l'osso diventa bianco, per massimizzare il numero di cellule raccolte. Con lo stantuffo di una siringa, spingere le cellule attraverso la membrana in nylon nel tubo conico da 50 millilitri per ottenere una sospensione di cellule singole.Ripetere con l'altra zampa del topo. Centrifugare le cellule raccolte a 400 × g a quattro gradi Celsius per 10 minuti e scartare il soprannatante. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di cloruro di ammonio e potassio, o ACK, per risospendere il midollo osseo.Incubare la sospensione cellulare sul ghiaccio per 10 minuti per lisare i globuli rossi. Per arrestare la lisi, riempire il tubo con PBS. Successivamente, centrifugare nuovamente le cellule e scartare il soprannatante.Ri-sospendere le cellule con cinque millilitri di PBS e contare le cellule mediante emocitometro utilizzando l'esclusione al blu di tripano. Successivamente, aggiungere il cocktail pre-staminale 2x per ri-sospendere le cellule a due volte 10 alla sesta cellule per millilitro. Quindi, piastrare due millilitri nei pozzetti di piastre a sei pozzetti.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica durante la notte. Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di supernatante virale in ogni pozzetto, seguiti da otto microgrammi per millilitro di polibrenina. Centrifugare le piastre a 1500 ×g a 30 gradi Celsius per 90 minuti.Quindi rimettere le piastre nell'incubatore per tutta la notte. Pipettare la sospensione cellulare in provette coniche e centrifugare a 400 × g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Utilizzare 2x il cocktail pre-staminali per pozzetto per risospendere le cellule e ripiastrarle nei pozzetti originali.Dopo aver preparato i topi riceventi per il trapianto secondo il protocollo descritto nel testo, raccogliere le cellule donatrici transdotte dalle piastre a sei pozzetti pipettando delicatamente il sopranatante in provette coniche. Utilizzare un millilitro di PBS per lavare ogni pozzetto e raccogliere le cellule residue nelle provette. Aggiungere 0,5 millilitri di tripsina al 0,05% nei pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Successivamente, aggiungere un millilitro di D-10 nei pozzetti ed eliminare le cellule residue pipettando delicatamente. Quindi, trasferire le cellule nei rispettivi tubi e centrifugare a 400 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Lavare nuovamente le cellule con PBS.Successivamente, dopo la centrifugazione, utilizzare cinque millilitri di PBS per risospendere le cellule e contarle mediante esclusione al blu di tripano e un emocitometro. Per l'iniezione nei topi, risospendere da cinque volte 10 alla quinta a due volte 10 alla sesta cellule in 50-100 microlitri di PBS. Posizionare il topo su un fianco e immobilizzarlo utilizzando pollice e indice, in modo che l'occhio sporga leggermente dalla testa.Con il bisellino rivolto verso l'alto, inserire l'ago lateralmente al canto mediale con un angolo di 45 gradi ed effettuare l'iniezione. Dopo l'iniezione, esaminare il topo alla ricerca di eventuali segni di lesione, come gonfiore o sanguinamento, nel sito di iniezione, e fare riferimento al protocollo scritto per le ulteriori cure post-iniezione. Infine, analizzare l'espressione di GFP nel sangue, secondo quanto indicato nel protocollo scritto.Questa figura illustra come calcolare il titolo virale relativo, in cui la percentuale di GFP viene calcolata a partire dagli eventi raccolti dal gate delle cellule vitali. Qui viene mostrato un titolo con più di una particella virale per cellula, e questi campioni rappresentano titoli con una singola particella virale per cellula. Idealmente, almeno il 50% delle cellule GFP-positive verrebbe rilevato con una diluizione da uno a 30 del supernatante virale.In questo esperimento, viene presentato un ricevente trapiantato con successo in cui i topi CALRdel52 mostrano un fenotipo di MPN con piastrine aumentate, megacariociti aumentati nel midollo osseo e fibrosi del midollo osseo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto giorni, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante seguire ogni passaggio del protocollo.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare gli effetti di geni specifici nell'ematopoiesi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre topi che esprimono il tuo gene di interesse nelle cellule ematopoietiche.

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Questo video dimostra l'induzione della malattia intestinale del trapianto contro l'ospite, GvHD, in un topo ricevente irradiato letalmente utilizzando cellule staminali ematopoietiche allogeniche e linfociti T alloreattivi splenici che inducono GvHD. Questo protocollo aiuta a stabilire un modello di GvHD intestinale acuta grave per comprendere il meccanismo della malattia e sviluppare opzioni terapeutiche innovative.

Induzione della malattia del trapianto contro l'ospite in modelli murini tramite trapianto allogenico di midollo osseo e cellule spleniche

Presentiamo un protocollo rapido e flessibile per un sistema di espressione in vivo basato su un singolo recettore delle cellule T (TCR) basato su retrovirus.  I vettori retrovirali sono utilizzati per trasdurre le cellule progenitrici del midollo osseo per studiare lo sviluppo delle cellule T e la funzione di un singolo TCR in vivo come alternativa ai topi transgenici TCR.

Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

Qui usiamo bioluminescenti, raggi x ed emissione di positroni tomografia/computato tomografia imaging per studiare l'attività come inibitore di mTOR urta i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in un modello dello xenotrapianto. Questo permette analisi fisiologicamente pertinenti, non invasivo e multimodale dell'effetto anti-mieloma di terapie designando i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in vivo.

Formazione immagine di tomografia multimodale bioluminescenti ed emissione positronica tomografia/computazionale di mieloma multiplo del midollo osseo xenotrapianti in topi NOG

Descriviamo l'uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) per valutare il potenziale maligno delle cellule emopoietiche geneticamente. HSCT è utile per valutare varie cellule ematopoietiche maligne in vivo , nonché generando un'ampia coorte di topi con sindromi mielodisplastiche (MDS) o leucemia per valutare nuove terapie.

Uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare l'origine della sindrome Myelodysplastic

La malattia da innesto contro ospite è una complicazione importante dopo il trapianto di midollo osseo allogenico. Le cellule dendritiche svolgono un ruolo critico nella patogenesi della malattia da trapianto contro ospite. L'articolo attuale descrive una nuova piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nello sviluppo della malattia da trapianto contro ospite e l'effetto innesto contro leucemia.

Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host

Descriviamo il trapianto intraparenchimale di cellule progenitrici neurali umane trasdotte con un doppio vettore reporter che esprime la proteina fluorescente verde luciferasi (GFP) nel cervello del topo. Dopo il trapianto, il segnale della luciferasi viene ripetutamente misurato utilizzando bioluminescenza in vivo e cellule innestate che esprimono GFP identificate in sezioni cerebrali utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Trapianto intracerebrale e monitoraggio della bioluminescenza in vivo delle cellule progenitrici neurali umane nel cervello del topo

Questo protocollo descrive l'isolamento dei timociti doppi negativi dal timo di topo seguito da trasduzione retrovirale e co-coltura sul sistema di co-coltura della linea cellulare stromale del midollo osseo a 4 esprimenti delta (OP9-DL4) per ulteriori analisi funzionali.

Co-coltura e trasduzione di timociti murini su cellule stromali esprimenti delta-like 4 per studiare oncogeni nella leucemia a cellule T

Qui, l'iniezione intra-peritoneale delle cellule leucemiche viene utilizzata per stabilire e propagare la leucemia mieloide acuta (LMA) nei topi. Questo nuovo metodo è efficace nel trapianto seriale di cellule LMA e può servire come alternativa per coloro che possono sperimentare difficoltà e incongruenze con l'iniezione endovenosa nei topi.

Trapianto intra-peritoneale per la generazione di leucemia mieloide acuta nei topi

Il presente protocollo descrive lo sviluppo di un modello murino riproducibile di glioma del midollo spinale mediante l'iniezione di cellule tumorali nello spazio intervertebrale, offrendo un approccio più efficace e meno invasivo per la ricerca e lo sviluppo terapeutico.

Trapianto chirurgico di cellule tumorali nel midollo spinale di topi

Il protocollo ha l'obiettivo di descrivere un modello murino per la generazione di recidive di leucemia linfoblastica acuta, basato sulla dinamica della risposta alla chemioterapia di induzione.

Modello murino di recidiva della leucemia alla chemioterapia di induzione per la leucemia linfoblastica acuta

Scopri il metodo di trasduzione-trapianto per generare modelli murini con espressione genica nelle cellule ematopoietiche. Questa tecnica consente di studiare le neoplasie mieloproliferative e testare terapie in vivo.

Trasduzione-trapianto modello murino di neoplasia mieloproliferativa

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