Trasduzione-trapianto modello murino di neoplasia mieloproliferativa

L'obiettivo generale di questa procedura è generare topi che esprimono il gene di interesse nelle cellule ematopoietiche utilizzando il metodo di trasduzione-trapianto. In un breve lasso di tempo, questo metodo può aiutare a determinare se il gene di interesse induce una malignità ematologica. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi delle malignità ematologiche, grazie allo sviluppo accelerato di modelli murini in grado di testare potenziali terapie.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle malattie ematologiche, può anche essere utilizzato per studiare il ruolo di un gene di interesse nell'ematopoiesi normale. In generale, le persone nuove a questo esperimento potrebbero incontrare difficoltà, poiché richiede diverse fasi. Inoltre, la generazione di un virus ad alto titolo è fondamentale per il successo di questo esperimento.

La dimostrazione visiva di questa procedura è importante, poiché lavorare con i topi può essere difficile e richiede pratica. Dopo aver anestetizzato un topo e verificato la profondità dell'anestesia secondo il protocollo descritto nel testo, posizionare l'animale su un fianco e, utilizzando pollice e indice, immobilizzarlo in modo che l'occhio sporga leggermente dalla testa. Per iniettare 150 milligrammi per chilogrammo di 5-fluorouracile, o 5-FU, mediante iniezione retro-orbitaria, inserire un ago da 27 gauge e mezzo pollice con un angolo di 45 gradi, con il bevel rivolto verso l'alto in direzione mediale, e fermarsi quando l'ago è inserito per metà.

Iniettare lentamente la soluzione, quindi rimuovere con attenzione l'ago. Esaminare il topo alla ricerca di segni di lesioni, come gonfiore o sanguinamento, e assicurarsi che il topo si riprenda e inizi a camminare. Cinque giorni dopo, a seguito dell'eutanasia dell'animale secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare il topo spruzzandolo abbondantemente finché il pelo non diventa bagnato.

Con forbici da dissezione, praticare un'incisione nella pelle e dissezionare la fascia dai muscoli della gamba. Successivamente, staccare la gamba dal topo recidendo il femore a livello dell'anca e la tibia alla caviglia. Piegate la gamba a forma di L e utilizzate le forbici da dissezione per separare ciascun osso della gamba tagliando all'articolazione del ginocchio.

Quindi, staccare delicatamente il muscolo verso un'estremità dell'osso della gamba finché la cartilagine non si stacca. Successivamente, utilizzando una siringa con un ago da 27 gauge di mezzo pollice, lavare ogni osso della gamba in PBS integrato con FBS al 2% su una membrana in nylon da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri, fino a quando l'osso diventa bianco, per massimizzare il numero di cellule raccolte. Con lo stantuffo di una siringa, spingere le cellule attraverso la membrana in nylon nel tubo conico da 50 millilitri per ottenere una sospensione di cellule singole.

Ripetere con l'altra zampa del topo. Centrifugare le cellule raccolte a 400 × g a quattro gradi Celsius per 10 minuti e scartare il soprannatante. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di cloruro di ammonio e potassio, o ACK, per risospendere il midollo osseo.

Incubare la sospensione cellulare sul ghiaccio per 10 minuti per lisare i globuli rossi. Per arrestare la lisi, riempire il tubo con PBS. Successivamente, centrifugare nuovamente le cellule e scartare il soprannatante.

Ri-sospendere le cellule con cinque millilitri di PBS e contare le cellule mediante emocitometro utilizzando l'esclusione al blu di tripano. Successivamente, aggiungere il cocktail pre-staminale 2x per ri-sospendere le cellule a due volte 10 alla sesta cellule per millilitro. Quindi, piastrare due millilitri nei pozzetti di piastre a sei pozzetti.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica durante la notte. Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di supernatante virale in ogni pozzetto, seguiti da otto microgrammi per millilitro di polibrenina. Centrifugare le piastre a 1500 ×g a 30 gradi Celsius per 90 minuti.

Quindi rimettere le piastre nell'incubatore per tutta la notte. Pipettare la sospensione cellulare in provette coniche e centrifugare a 400 × g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Utilizzare 2x il cocktail pre-staminali per pozzetto per risospendere le cellule e ripiastrarle nei pozzetti originali.

Dopo aver preparato i topi riceventi per il trapianto secondo il protocollo descritto nel testo, raccogliere le cellule donatrici transdotte dalle piastre a sei pozzetti pipettando delicatamente il sopranatante in provette coniche. Utilizzare un millilitro di PBS per lavare ogni pozzetto e raccogliere le cellule residue nelle provette. Aggiungere 0,5 millilitri di tripsina al 0,05% nei pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Successivamente, aggiungere un millilitro di D-10 nei pozzetti ed eliminare le cellule residue pipettando delicatamente. Quindi, trasferire le cellule nei rispettivi tubi e centrifugare a 400 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Lavare nuovamente le cellule con PBS.

Successivamente, dopo la centrifugazione, utilizzare cinque millilitri di PBS per risospendere le cellule e contarle mediante esclusione al blu di tripano e un emocitometro. Per l'iniezione nei topi, risospendere da cinque volte 10 alla quinta a due volte 10 alla sesta cellule in 50-100 microlitri di PBS. Posizionare il topo su un fianco e immobilizzarlo utilizzando pollice e indice, in modo che l'occhio sporga leggermente dalla testa.

Con il bisellino rivolto verso l'alto, inserire l'ago lateralmente al canto mediale con un angolo di 45 gradi ed effettuare l'iniezione. Dopo l'iniezione, esaminare il topo alla ricerca di eventuali segni di lesione, come gonfiore o sanguinamento, nel sito di iniezione, e fare riferimento al protocollo scritto per le ulteriori cure post-iniezione. Infine, analizzare l'espressione di GFP nel sangue, secondo quanto indicato nel protocollo scritto.

Questa figura illustra come calcolare il titolo virale relativo, in cui la percentuale di GFP viene calcolata a partire dagli eventi raccolti dal gate delle cellule vitali. Qui viene mostrato un titolo con più di una particella virale per cellula, e questi campioni rappresentano titoli con una singola particella virale per cellula. Idealmente, almeno il 50% delle cellule GFP-positive verrebbe rilevato con una diluizione da uno a 30 del supernatante virale.

In questo esperimento, viene presentato un ricevente trapiantato con successo in cui i topi CALRdel52 mostrano un fenotipo di MPN con piastrine aumentate, megacariociti aumentati nel midollo osseo e fibrosi del midollo osseo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto giorni, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante seguire ogni passaggio del protocollo.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare gli effetti di geni specifici nell'ematopoiesi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre topi che esprimono il tuo gene di interesse nelle cellule ematopoietiche.