Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare Vectensis Nematostella

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare la serie prevedibile di cambiamenti morfologici che si sono verificati durante la rigenerazione di un polipo completo da una minuscola sezione di tessuto rimosso dalla punta aborale di nematostella vectensis Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia della rigenerazione, come ad esempio come le cellule nel sito di una ferita si riorganizzano e si dispiegano per rifare le strutture mancanti. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta perché volevo vedere come un polipo relativamente complesso potesse ricomporsi partendo dal minor numero di informazioni morfologiche. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché la progressione dello stadio dopo la ferita iniziale è talvolta oscurata da una membrana mucosa.

Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo faranno fatica a ottenere una completa separazione del tessuto nel sito della ferita, a causa della natura morbida, appiccicosa e gelatinosa del polipo. Iniziare questa procedura con il condizionamento di nematostella vectensis come descritto nel protocollo di testo. È particolarmente importante quando si utilizza questa tecnica che gli animali selezionati abbiano le stesse dimensioni e abbiano la stessa storia culturale, come l'alimentazione identica e altri parametri di condizione.

Rimuovere il piatto degli animali selezionati dall'incubatrice alla luce della stanza almeno un'ora prima dell'amputazione. Utilizzare una pipetta di plastica a foro largo per trasferire i cinque animali dalla piscina da amputare sul fondo di un piatto di vetro sterile di 100 millimetri di diametro contenente acqua di mare artificiale ad una salinità di 12 parti per mille. Posizionare il piatto sul tavolino di uno stereomicroscopio con ingrandimento variabile da 10 a 40x.

Seleziona polipi di dimensioni uguali di circa la stessa lunghezza e mettili in una ciotola separata dalla colonia per tre giorni prima dell'amputazione. Usando un bisturi sterile, amputa i fisi aborali da ciascun polipo per ottenere una sezione dei corpi che sia lunga all'incirca quanto larga e non contenga mesentere. Per ottenere ciò, posizionare la lama del bisturi a contatto con l'animale nel sito di amputazione desiderato.

Fallo senza assistenza o afferrando delicatamente il corpo dell'animale con una pinza numero cinque. Taglia il tessuto facendo leva sulla lama curva del bisturi con un movimento a dondolo su tutto il corpo. Rimuovere ogni polipo del donatore amputato dal piatto e rimetterlo in una ciotola separata etichettata come amputati in pool.

Dopo aver datato la ciotola, riportala alla cultura di riserva. Sciacquare i physa asportati che rimangono nella piastra di taglio in acqua di mare artificiale ad una salinità di 12 parti per 1.000. Quindi, trasferire ogni physa in un pozzetto sterile separato in una piastra di coltura cellulare multi-pozzetto che contiene 10 millilitri di acqua di mare artificiale a una salinità di 12 parti per 1.000 in ciascun pozzetto.

Ripetere questi passaggi per raccogliere almeno cinque physa in ogni pozzetto da riservare per ogni trattamento sperimentale. Collocare la piastra contenente i physa in un'incubatrice a temperatura regolata a una temperatura fissa determinata dalla velocità di rigenerazione desiderata. Incidere i fisici utilizzando un microscopio composto stereo con ingrandimento variabile.

Assegna un punteggio alla nematostella physa appena tagliata come stadio zero e continua a segnare alla stessa ora ogni giorno dopo l'amputazione, o DPA, utilizzando l'NRSS. Segna il physa come stadio zero se un physa appena tagliato appare come una massa a forma di coppa simile a un pallone flaccido con un sito di ferita aperto che è probabilmente visibile. Segna un physa come stadio uno se la ferita da amputazione sembra chiusa.

Segna un physa come stadio due se la superficie del polo uditivo appare gonfiata, rivelando otto archi rialzati disposti in uno schema radialmente simmetrico e separati da scanalature. Nella seconda fase, osservare piccole bolle emisferiche all'apice degli archi che sono alte quanto larghe, probabilmente transitorie e inizialmente costituite da un singolo strato di cellule ectodermiche. Con l'avanzare dell'età, il physa può essere racchiuso nel muco, che deve essere accuratamente rimosso con una pinza.

Segna un physa come stadio tre se le gemme dei tentacoli contenenti strati di tessuto endodermico ed ectodermico si formano stabilmente all'estremità uditiva di almeno alcuni archi radiali. Classificare un physa come stadio quattro se il physa contiene otto distinti mesenteri visibili che si estendono in un celenterone da inserzioni nella parete corporea con lunghezze aborali uditive che sono più del doppio della loro larghezza radiale misurata da dove sembrano connettersi alla faringe alla sua estremità aborale, o enterostoma. Infine, segna un physa come stadio cinque se il physa ha più di quattro mesenteri con pieghe e la plissettatura è più piena e sinuosa rispetto allo stadio quattro.

Al quinto stadio, l'animale ha un aspetto adulto quasi normale, ma non ci sono cellule gonadiche visibili. Questo gruppo di nematostella physa di controllo trattati con DMSO allo 0,1% si è rigenerato completamente al quinto stadio. I physa trattati con clorochina, tuttavia, non riuscirono a formare completamente i mesenteri completi.

Un primo piano mostra sia la presenza che la mancanza di pieghe nei mesenteri in una physa che è stata incubata nella clorochina. Questo grafico illustra i risultati aggregati del trattamento con clorochina. Qualsiasi trattamento tra 10 e 50 micromolari ha causato difetti simili, per lo più la mancanza di una completa riformazione dei mesenteri in quanto i mesenteri mancano di pieghettatura.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora per ogni piastra a sei pozzetti contenente 30 physa tagliati. Il punteggio è rapido, forse richiede mezz'ora per ogni piatto replicato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come amputare il fisico per visualizzare i cambiamenti morfologici che si verificano durante la rigenerazione di un polipo completo da una minuscola sezione di tessuto aborale.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce stadi morfologici in cui individuare gli eventi molecolari alla base della rigenerazione di un polipo completo da una coppa di tessuto visivamente uniforme. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di precondizionare gli animali rispetto alla storia nutrizionale, di dividere in due per escludere il mesentere adulto e di standardizzare le dimensioni del physa rigenerante per ridurre la variazione all'interno dei trattamenti. Seguendo questa procedura, è stato possibile valutare, ad esempio, gli effetti di mutazioni genetiche o perturbazioni della via di segnalazione con piccole molecole.

Oppure i cambiamenti morfogenetici potrebbero essere correlati con l'analisi microscopica dell'autoproliferazione, del tracciamento del lignaggio o dell'espressione genica del secondo sito. Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della biologia della rigenerazione per esplorare la biologia cellulare, le vie di segnalazione e i processi morfogenetici che sono alla base della notevole capacità rigenerativa di questo organismo modello.