Misurare la rigidità Ex Vivo Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere le procedure per l'utilizzo della microscopia a forza atomica per misurare il modulo elastico Ex Vivo delle aorte di topo. Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave nel campo della biomeccanica vascolare e delle malattie come le malattie cardiovascolari e l'invecchiamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'AFM caratterizzato dalle proprietà biomeccaniche di campioni biologici morbidi come arterie e cellule con un grande grado di accuratezza a livelli di Danoscale.

Presenterò le procedure AFM e il dottor Shu-lin Liu, un ricercatore associato del nostro laboratorio, mostrerà come isolare le aorte di topo. Per iniziare, sopprimere un topo e sezionarlo fino all'aorta come descritto nel protocollo di testo allegato. Usando un paio di piccole pinze, afferra il grasso che circonda l'aorta e usa un piccolo paio di forbici per tagliare via con cura il grasso che si trova intorno all'aorta.

Quindi, afferra delicatamente l'aorta con una pinza e fai un taglio attraverso il vaso all'inizio dell'aorta ascendente e un altro taglio alla fine dell'aorta discendente, appena sopra l'aorta addominale. Trasferire l'aorta sezionata in un piatto da 60 millimetri contenente PBS senza calcio o magnesio. Nel piatto, continuare a sezionare il tessuto adiposo rimanente dall'aorta e quindi aprire l'aorta longitudinalmente.

Quindi, tagliare un pezzo di 2 millimetri per 4 millimetri dall'aorta discendente e un pezzo della stessa dimensione dall'arco aortico, per l'analisi con il microscopio a forza atomica. Metti questi pezzi di tessuto in un piatto di plastica fresco da 60 millimetri e mantienili umidi in una goccia di PBS. Rimuovere con cautela il PBS intorno al tessuto utilizzando una salvietta da laboratorio senza toccare l'aorta.

Assicurati che il lato luminale del tessuto sia rivolto verso l'alto e usa da cinque a 10 microlitri di adesivo cianoacrilato per incollare delicatamente ciascuna estremità dell'aorta aperta alla piastra. È fondamentale che l'aorta non venga allungata durante questo processo. Al termine, controllare che l'aorta incollata non sia piegata o galleggiante.

Dopo aver asciugato all'aria la colla sull'aorta per 30-60 secondi, aggiungere delicatamente PBS e immergere il campione. Utilizzando una pinzetta, far scorrere una sonda AFM in nitrato di silicone con una punta sferica sul supporto della sonda. Quindi, fissare saldamente il supporto della sonda al supporto ZScanner della testa AFM.

Quindi, apri il software AFM. Scegli il tipo di esperimento andando alla categoria Esperimento e selezionando Modalità contatto. Quindi, vai su Gruppo di esperimenti e seleziona Modalità contatto in Fluido, quindi vai su Esperimento e seleziona Modalità contatto in Fluido.

Una volta selezionati, fai clic su Carica esperimento. Questo accenderà il laser. Successivamente, preparare un campione utilizzato per allineare il laser come descritto nel protocollo di testo allegato.

Posizionare il campione sull'AFM. Posizionare il punto laser sulla punta della sonda AFM, regolando le manopole di posizionamento del laser. Quindi, utilizzare le manopole di posizionamento del rivelatore per regolare la posizione del fotodiodo fino a quando i valori della deflessione verticale sono compresi tra zero e un volt negativo e la deflessione orizzontale è vicina a zero volt.

Quindi, controlla che il segnale di somma del laser sia massimizzato. Se necessario, regolare nuovamente la posizione del raggio laser sulla punta dell'AFM e la posizione del fotodiodo per ottenere il segnale di somma massima. Per iniziare la calibrazione, selezionare i parametri di controllo e impostare il parametro per Dimensione scansione su zero.

Impostare la velocità di scansione su un hertz. Impostare il campione/linea su 256 e il setpoint di deflessione su 20 nanometri. Quindi seleziona Impegna.

Una volta che la sonda entra in contatto con la superficie della piastra, fare clic su Rampa. Quindi, selezionare la modalità espansa nel menu della barra degli strumenti di scansione e impostare i parametri come mostrato qui. Nella barra degli strumenti della rampa, selezionare rampa continua e ottenere una curva di forza sulla piastra.

In questa curva di forza, impostare il canale 1 su Errore di deflessione per consentire al software di rappresentare graficamente i risultati come deflessione verticale rispetto alla posizione Z. Fare clic sulle estremità sinistra o destra della curva di forza e trascinare il cursore per comprendere una regione lineare della curva di forza che si adatterà alla linea retta. Quindi, seleziona Rampa nella barra degli strumenti e fai clic su Aggiorna sensibilità.

Registrare il valore corrente. Quindi, seleziona Calibra e fai clic su Rilevatore. Input e valore medio delle cinque misurazioni nella casella Sensibilità deflessione.

Fare clic su Ritira due o tre volte, per sollevare la testa AFM e prevenire l'interazione tra la punta AFM e la piastra durante il processo di regolazione termica. Quindi, fai clic su Thermal Tune nella barra degli strumenti. Impostare l'intervallo di regolazione termica su un valore compreso tra uno e 100 kilohertz e impostare la correzione della sensibilità di deflessione su 1,144 per i cantilever a forma di V e 1,166 per i cantilever rettangolari.

Nel menu Regolazione termica, fare clic su Acquisisci dati per ottenere una curva di regolazione termica. Quindi, posiziona il trattino rosso sulle linee su entrambi i lati della curva e seleziona il modello lorentziano o l'oscillatore armonico semplice a seconda di quale si adatta meglio ai dati. Quindi, fare clic su Adatta dati e selezionare Calcola molla K per salvare questo valore.

Posizionare una piastra di coltura da 60 millimetri contenente il tessuto aortico sul tavolino del microscopio e fissare la piastra con il supporto magnetico per piastre. Una volta che l'aorta è impegnata con il cantilever, assicurarsi che il centro piezoelettrico sia stabile e fare clic su Rampa. Impostare la dimensione della rampa su tre micrometri, la modalità di trigger su relativa e la soglia di trigger su 100 nanometri.

Quindi selezionare rampa continua. Osservare che il punto di contatto tra la sonda e il campione si trova approssimativamente al centro dei tre quarti inferiori del ciclo della rampa Z. Se ciò non viene rispettato, sganciarsi dal campione, regolare la dimensione della rampa secondo necessità e riagganciare il campione.

Quindi, fai clic su Microscopio nella barra dei menu e seleziona Impostazioni di attivazione. Modificare l'SPM di prelievo a 30 micrometri, quindi fare clic su OK. Dopo aver osservato la curva di forza, fare clic su Cattura nella barra dei menu e selezionare Acquisisci nome file. Inserisci il nome del file desiderato che termina con OOO, seleziona una cartella designata e salva i dati.

Per iniziare l'analisi, aprire il software di analisi della curva di forza, caricare il file da analizzare e modificare e uniformare i dati come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi, seleziona Correzione linea di base nella barra dei menu e imposta gli input come mostrato qui. Quindi, regolare la linea blu tratteggiata verticale sul grafico in modo che includa la parte piatta della curva di forza e fare clic su Esegui.

Quindi, fai clic su Rientro nel menu della barra degli strumenti e imposta gli input come mostrato qui. Salva questi valori e analizza il modulo di Young di ciascuna delle aree di interesse misurando cinque curve di forza per area che vengono prese entro una piccola distanza l'una dall'altra. Per determinare la rigidità complessiva del campione di tessuto, è necessario effettuare fino a 25 misurazioni su cinque diverse regioni dell'area del campione all'interno del tessuto.

Queste aree possono essere utilizzate per confrontare i tessuti in diverse posizioni, come l'arco aortico e l'aorta discendente. In questi grafici, le curve di forza rappresentative dell'aorta discendente e dell'arco aortico sono mostrate dallo stesso campione di aorta di topo. Sulla base di questi dati, il modulo elastico può essere calcolato per ciascun gruppo e utilizzato per confrontare diverse regioni o condizioni.

Dopo aver visto questo video avrai una buona comprensione di come isolare correttamente l'aorta del topo e misurare il modulo elastico mediante microscopia a forza atomica. Dopo aver tentato questa procedura, è importante ricordarsi di eseguire la misurazione dell'AFM immediatamente dopo l'isolamento dei tessuti. Una volta padroneggiato, l'isolamento delle aorte può essere completato in circa 45 minuti per topo e la misurazione e l'analisi dell'AFM possono essere completate in un'ora e mezza, se eseguite correttamente.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunofluorescenza o i saggi di proliferazione per rispondere a ulteriori domande relative al rimodellamento vascolare o alla proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari.