Name: Misurare la rigidità Ex Vivo Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Impara a misurare il modulo elastico di aorte di topo ex vivo mediante microscopia a forza atomica. Questo metodo consente di caratterizzare con precisione nanometrica le proprietà biomeccaniche dei tessuti vascolari per studiare malattie cardiovascolari e invecchiamento.

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L'analisi AFM è stata eseguita su strumentazione supportata dal Pennsylvania Muscle Institute e dall'Institute for Translational Medicine and Therapeutics, Perelman School of Medicine, l'Università della Pennsylvania. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH HL62250 e AG047373. YHB è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato dell'American Heart Association.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

AFM indentazione può essere utilizzato per caratterizzare la rigidità (modulo elastico) di cellule e tessuti. In questo lavoro, forniamo dettagliate protocolli passo-passo per isolare l&#39;aorta discendente e arco aortico nel topo e determinare il modulo elastico di queste regioni arteriosi ex vivo. Ora riassumere e discutere le questioni tecniche e le limitazioni del metodo descritto in questo articolo. Diversi problemi tecnici possono sorgere in isolamento e l&#39;analisi di topo...

Le proprietà biomeccaniche delle arterie sono un fattore determinante nelle malattie cardiovascolari (CVD) e nell'invecchiamento. La rigidità arteriosa, un importante fattore di rischio indipendente dal colesterolo e un indicatore della progressione delle CVD, aumenta con il danno vascolare, l'aterosclerosi, l'età e il diabeteda 1 a 8. L'irrigidimento della parete arteriosa è associato a un aumento della dedifferenziazione, della migrazione e della proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari9-12. Inoltre, l'aumento della rigidità arteriosa è stato collegato a una maggiore adesione dei macrofagi1, alla permeabilità endoteliale e alla trasmigrazione leucocitaria13 e al rimodellamento della parete dei vasi14,15. Pertanto, le terapie che potrebbero prevenire l'irrigidimento arterioso nelle CVD o nell'invecchiamento potrebbero integrare gli interventi farmacologici attualmente disponibili che trattano le CVD riducendo il colesterolo alto nel sangue. 
AFM è un potente strumento analitico utilizzato per varie applicazioni fisiche e biologiche. L'AFM è sempre più utilizzato per ottenere le immagini ad alta risoluzione e caratterizzare le proprietà biomeccaniche di campioni biologici molli come tessuti e cellule1,2,10,16,17 con un grande grado di accuratezza a livelli su scala nanometrica. Uno dei principali vantaggi dell'AFM è il fatto che può essere utilizzato con cellule viventi.
Questo articolo descrive il nostro metodo per misurare il modulo elastico delle arterie di topo ex vivo utilizzando l'AFM. Il metodo descritto mostra come 1) isoliamo correttamente le arterie di topo (aorta discendente e arco aortico) e 2) misuriamo il modulo elastico di questi tessuti mediante AFM. Le misurazioni dei moduli elastici scaricati nelle arterie possono aiutare a chiarire i cambiamenti nella matrice extracellulare (ECM) che si verificano in risposta a lesioni vascolari, CVD e invecchiamento.

<table><tbody><tr><td>BioScope Catalyst AFM system</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE 200 microscopio invertito</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda AFM in nitruro di silicio</td><td>Novascan Technologies</td><td>PT. SI02. SN.1</td><td>0,06 N/m a sbalzo; 1 &micro; m SiO2</td></tr><tr><td>particella Dumont #5 pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Vedere la sezione 1.4</td></tr><tr><td>Dumont #5SF pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Vedere la sezione 1.8</td></tr><tr><td>Forbici fini-ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Vedere la sezione 1.4 (di medie dimensioni)</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Forbici a molla</td><td>Bingen Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td>Vedere la sezione 1.6 (di piccole dimensioni)</td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari da 60 mm trattato con TC</td> Corning <td>353004</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>Senza calcio e magnesio</td></tr><tr><td>Krazy Glue liquido istantaneo per tutti gli usi</td><td>Krazy</td><td>Glue KG58548R</td><td>Vedere la sezione 2.2</td></tr><tr><td>Punte con caricamento gel, 1 - 200 & micro; l</td><td>Fisher</td><td>02-707-139</td><td>Vedere la sezione 2.2</td></tr><tr><td>Pinzette a punta</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Sciences 78092-CP</td><td>Vedere la sezione 3.2</td></tr><tr><td>Piatti con fondo in vetro trasparente da 50 mm</td><td>TED PELLA</td><td>14027-20</td><td>Vedere la sezione 4.4</td></tr></tbody></table>

misurare la rigidità<em&gt; ex vivo</em&gt; mouse aorte utilizzando microscopia a forza atomica

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

irrigidimento arteriosa è un fattore di rischio significativo e biomarker per malattie cardiovascolari e un segno distintivo di invecchiamento. Microscopia a forza atomica (AFM) è uno strumento analitico versatile per la caratterizzazione viscoelastiche proprietà meccaniche per una varietà di materiali che vanno dal disco (plastica, vetro, metallo, ecc) le superfici di celle su qualsiasi substrato. È stato ampiamente utilizzato per misurare la rigidità delle cellule, ma usato meno frequentemente per misurare la rigidità di aorte. In questo articolo, descriveremo le procedure per l&#39;utilizzo in modalità AFM contatto per misurare la ex vivo modulo elastico delle arterie scaricati mouse. Descriviamo la nostra procedura per l&#39;isolamento di aorte del mouse, e quindi fornendo informazioni dettagliate per l&#39;analisi AFM. Questo include le istruzioni passo-passo per l&#39;allineamento del raggio laser, la taratura della costante della molla e la sensibilità deflessione della sonda AFM, e l&#39;acquisizione di curve di forza. Forniamo anche un protocollo dettagliato per analy datisis delle curve di forza.

<html> La figura 5A mostra un&#39;immagine a contrasto di fase dell&#39;aorta discendente (toracica) da un 6 mesi di età, di sesso maschile C57BL / 6 del mouse. Il cantilever AFM è posto direttamente sopra il tessuto e pronto per il rientro. Figure 5B e 5C mostrano curve rappresentative forza ottenuti mediante AFM rientranza in modalità contatto. Linee verdi mostrate nelle figure 5B e 5C rappresentano le migliori curve di adattamento ott...

Presentiamo protocolli dettagliati per l'isolamento delle aorte dal topo e la misurazione del loro modulo elastico utilizzando la microscopia a forza atomica.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere le procedure per l'utilizzo della microscopia a forza atomica (Atomic Force Microscopy) per misurare il modulo elastico ex vivo delle aorte di topo. Questo metodo aiuta a rispondere a domande fondamentali nel campo della biomeccanica vascolare e delle malattie, come le malattie cardiovascolari e l'invecchiamento. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità dell'AFM di caratterizzare le proprietà biomeccaniche di campioni biologici molli, come arterie e cellule, con un elevato grado di accuratezza a livello nanometrico.Presenterò le procedure di AFM e il dottor Shu-lin Liu, ricercatore associato del nostro laboratorio, mostrerà come isolare le aorte di topo. Per iniziare, si proceda all'eutanasia di un topo e alla dissezione fino all'aorta, come descritto nel protocollo testuale allegato. Utilizzando una coppia di pinzette piccole, afferrare il tessuto adiposo che circonda l'aorta e con un paio di forbici piccole tagliare con cura il grasso presente intorno all'aorta.Successivamente, afferrare delicatamente l'aorta con una pinzetta ed eseguire un taglio nel vaso all'inizio dell'aorta ascendente e un altro taglio alla fine dell'aorta discendente, appena sopra l'aorta addominale. Trasferire l'aorta dissezionata in una piastra da 60 millimetri contenente PBS privo di calcio o magnesio. All'interno della piastra, continuare a dissezionare qualsiasi tessuto adiposo residuo dall'aorta, quindi aprire longitudinalmente l'aorta.Successivamente, tagliare un pezzo di 2 millimetri per 4 millimetri dall'aorta discendente e un pezzo della stessa dimensione dall'arco aortico, per l'analisi mediante microscopio a forza atomica. Posizionare questi frammenti di tessuto in una nuova piastra di plastica da 60 millimetri e mantenerli umidi in una goccia di PBS. Rimuovere con attenzione il PBS intorno al tessuto utilizzando un fazzoletto da laboratorio senza toccare l'aorta.Assicurarsi che il lato luminale del tessuto sia rivolto verso l'alto e utilizzare da cinque a dieci microlitri di adesivo a base di cianoacrilato per incollare delicatamente ciascuna estremità dell'aorta aperta alla piastra. È fondamentale che l'aorta non venga stirata durante questa operazione. Al termine, verificare che l'aorta incollata non sia piegata o galleggiante.Dopo aver lasciato asciugare all'aria la colla sull'aorta per 30-60 secondi, aggiungere delicatamente PBS ed immergere il campione. Utilizzando pinzette, inserire un ago AFM in nitrato di silicone con punta sferica nel supporto dell'ago. Successivamente, fissare saldamente il supporto dell'ago al montaggio ZScanner della testa AFM.Successivamente, aprire il software dell'AFM. Scegliere il tipo di esperimento andando su Categoria dell'esperimento e selezionando Modalità a contatto. Quindi, passare a Gruppo dell'esperimento e selezionare Modalità a contatto in fluido, e infine andare su Esperimento e selezionare Modalità a contatto in fluido.Dopo aver effettuato la selezione, fare clic su Carica Esperimento. Questo attiverà il laser. Successivamente, preparare un campione da utilizzare per allineare il laser come descritto nel protocollo di testo allegato.Posizionare il campione sull'AFM. Regolare la posizione del fascio laser sulla punta della sonda AFM mediante le manopole di posizionamento del laser. Successivamente, utilizzare le manopole di posizionamento del rilevatore per regolare la posizione del fotodiodo finché i valori di Deflessione Verticale risultano compresi tra zero e meno un volt, e la Deflessione Orizzontale è prossima a zero volt.Successivamente, verificare che il segnale somma del laser sia massimizzato. Se necessario, riregolare la posizione del fascio laser sulla punta del microscopio a forza atomica (AFM) e la posizione del fotodiodo per ottenere il segnale somma massimo. Per iniziare la calibrazione, selezionare verifica parametri e impostare il parametro di Dimensione di scansione a zero.Impostare la velocità di scansione a un hertz. Impostare il numero di campioni per linea a 256 e il valore di riferimento della deflessione a 20 nanometri. Quindi selezionare Avvio.Una volta che la sonda entra in contatto con la superficie della piastra, fare clic su Ramp. Successivamente, selezionare la modalità espansa nel menu della barra degli strumenti di scansione e impostare i parametri come mostrato qui. Nella barra degli strumenti di rampa, selezionare ramp continuus ed acquisire una curva di forza sulla piastra.In questo grafico di forza, impostare il Canale 1 sull'Errore di Deflessione in modo che il software possa rappresentare i risultati come deflessione verticale rispetto alla posizione Z. Fare clic alle estremità sinistra o destra della curva di forza e trascinare il cursore per includere una regione lineare della curva di forza che verrà approssimata con una retta. Successivamente, selezionare Rampe nella barra degli strumenti e fare clic su Aggiorna Sensibilità.Registrare il valore attuale. Successivamente, selezionare Calibra e fare clic su Rilevatore. Inserire e fare la media dei valori delle cinque misurazioni nel campo Sensibilità di Deflessione.Fare clic su Ritira due o tre volte, per sollevare la testa del microscopio a forza atomica (AFM) ed evitare interazioni tra la punta AFM e la piastra durante il processo di taratura termica. Successivamente, fare clic su Taratura Termica nella barra degli strumenti. Impostare l'intervallo di Taratura Termica tra 1 e 100 chilohertz e impostare la Correzione della Sensibilità alla Deflessione a 1,144 per levette a forma di V e a 1,166 per levette rettangolari.Nel menu Impostazione Termica, fare clic su Acquisisci Dati per ottenere una curva di taratura termica. Successivamente, posizionare le linee tratteggiate rosse su entrambi i lati della curva e selezionare il modello di Lorentziano o di oscillatore armonico semplice, a seconda di quale si adatti meglio ai dati. Quindi, fare clic su Adatta Dati e selezionare Calcola K della Molla per salvare questo valore.Posizionare una piastra da coltura da 60 millimetri contenente il tessuto aortico sullo stadio del microscopio e fissare la piastra con il supporto magnetico. Una volta che l'aorta è agganciata al cantilever, assicurarsi che il centro del piezoelettrico sia stabile e fare clic su Ramp. Impostare la dimensione del Ramp a tre micrometri, la modalità Trigger su Relativa e la soglia del Trigger a 100 nanometri.Quindi selezionare rampa continua. Osservare che il punto di contatto tra la sonda e il campione si verifica approssimativamente al centro fino ai tre quarti inferiori del ciclo di rampa in Z. Se ciò non viene osservato, disimpegnare dal campione, regolare la dimensione della rampa secondo necessità e reimpegnare il campione.Successivamente, fare clic su Microscopio nella barra del menu e selezionare Impostazioni di ingaggio. Modificare il valore di ritiro SPM a 30 micrometri, quindi fare clic su OK. Dopo aver osservato la curva di forza, fare clic su Acquisisci nella barra del menu e selezionare Acquisisci nome file. Inserire un nome file desiderato che termini con OOO, selezionare una cartella designata e salvare i dati.Per iniziare l'analisi, aprire il software di analisi delle curve di forza, caricare il file da analizzare e modificare e lisciare i dati come descritto nel protocollo di testo allegato. Successivamente, selezionare Correzione della Linea di Base nella barra del menu e impostare gli ingressi come mostrato qui. Quindi, regolare la linea verticale tratteggiata blu sul grafico in modo da includere la parte piatta della curva di forza e fare clic su Esegui.Successivamente, fare clic su Rientro nel menu della barra degli strumenti e impostare gli input come mostrato qui. Salvare questi valori ed analizzare il modulo di Young di ciascuna delle aree di interesse misurando cinque curve di forza per area, acquisite a breve distanza l'una dall'altra. Per determinare la rigidità complessiva del campione di tessuto, si dovrebbero effettuare fino a 25 misurazioni su cinque diverse regioni dell'area del campione all'interno del tessuto.Queste aree possono essere utilizzate per confrontare il tessuto in diverse posizioni, come l'arco aortico e l'aorta discendente. In questi grafici, vengono mostrate curve di forza rappresentative dell'aorta discendente e dell'arco aortico ottenute dallo stesso campione di aorta di topo. Sulla base di questi dati, è possibile calcolare il modulo elastico per ciascun gruppo e utilizzarlo per effettuare confronti tra diverse regioni o condizioni.Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come isolare correttamente l'aorta del topo e misurare il modulo elastico mediante microscopia a forza atomica. Dopo aver eseguito questa procedura, è importante ricordare di effettuare la misurazione con AFM immediatamente dopo l'isolamento del tessuto. Una volta acquisita padronanza, l'isolamento delle aorte può essere completato in circa 45 minuti per topo, e la misurazione e l'analisi con AFM possono essere portate a termine in un'ora e mezza, se eseguite correttamente.Dopo questa procedura, altri metodi come l'immunofluorescenza o i saggi di proliferazione possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande relative al rimodellamento vascolare o alla proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari.

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