Empirica, metagenomica e tecniche computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali salute delle API di fungicidi compromesso

L'obiettivo generale di questo progetto multidisciplinare è quello di isolare i meccanismi specifici attraverso i quali i residui di fungicidi sul polline possono causare il declino delle colonie nei bombi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative all'elevata mortalità tra i bombi larvali colpiti dalla distruzione mediata da fungicidi delle simbiosi dei microbi delle api. Il vantaggio principale di questa tecnica è che studia l'effetto indiretto dei fungicidi sulle api monitorando i dati demografici delle api insieme ai cambiamenti nelle comunità microbiche all'interno del polline d'api.

Sebbene questi metodi forniscano informazioni sulla salute delle api autoctone, possono essere applicati anche ad altri impollinatori come le api mellifere, che svolgono un ruolo fondamentale nell'impollinazione delle colture a livello globale, sottolineando così la saggia applicazione di fungicidi alle colture da fiore. A dimostrare le procedure in questo studio collaborativo saranno Prarthana Dharampal, Luis Diaz-Garcia e Caitlin Carlson. Per iniziare, installa gabbie a rete in un campo coltivato ad avena.

Prepararne uno per ogni replica. Pianifica di farne almeno 10 per un singolo esperimento di trattamento. Per prima cosa scava una trincea attorno a ogni gabbia e scava tutti e quattro i bordi della gabbia a rete nel terreno per assicurarti che le api non possano scappare.

Quindi rifornisci le gabbie con piante da fiore in vaso note per essere attraenti per le api, come il grano saraceno, la borragine, l'alisso, il cosmo e i girasoli. Integra anche ogni gabbia con un singolo vassoio di trifoglio in fiore. Raggruppa tutte le risorse floreali all'interno di un angolo della gabbia, che occupa circa 2,5 metri quadrati.

Vegetare la superficie rimanente della gabbia con l'avena. Prima di caricare le colonie nelle gabbie da campo, assicurati che ognuna contenga operaie e una singola regina. Quindi caricare una colonia per gabbia per un periodo di 29 giorni.

Nella gabbia, orientare le scatole della colonia in modo tale che le aperture della colonia puntino a sud per fornire alle api condizioni di navigazione ottimali. Quindi applicare il trattamento sperimentale a metà delle gabbie. In questo caso, utilizzare uno spruzzatore di pesticidi portatile per applicare un fungicida a base di clorotalonil a un livello pertinente sul campo alle piante da fiore.

Questo trattamento viene applicato al giorno zero e di nuovo il giorno 13. Rivestire i fiori in modo uniforme in modo che nessun liquido aggiuntivo aderisca alle superfici floreali. Al termine del periodo di studio, rimuovere le colonie dalle gabbie e anestetizzare le api ponendo le colonie in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti.

Una volta anestetizzate, rimuovere le api utilizzando una pinza sterile e registrare il numero di larve, pupe, femmine adulte e maschi adulti e la Madre Regina. Quindi utilizzare una bilancia analitica e registrare il peso secco della Regina Madre e di altre classi di api. Per iniziare, polverizzare il polline acquistato in commercio in una polvere fine utilizzando un normale mulino a sfere da laboratorio.

Quindi, per sterilizzare il polline in polvere, immergerlo in etanolo al 70%. Lasciare evaporare l'etanolo per una notte sotto la luce UV in una cabina di biosicurezza. Il giorno successivo, verificare la sterilità del polline impiattando una piccola quantità su un terreno di agar generico utilizzando uno stuzzicadenti sterile.

Incubare la piastra a 28 gradi Celsius per 48 ore e utilizzarla solo se non c'è crescita. Successivamente, utilizzando pipette sterili, aggiungere una dose di fungicida rilevante per il campo al polline sterilizzato e mescolare accuratamente i due insieme utilizzando bastoncini di legno sterili. Utilizzare acqua sterile per un controllo.

Ora prepara gli alveari per l'esperimento in campioni di almeno tre. Su base giornaliera, preparare assiepticamente le aliquote di polline per ogni alveare. Quindi, attraverso la botola nella scatola che racchiude ogni alveare, introdurre il polline.

Oltre al polline, settimanalmente fornire ad ogni alveare una soluzione zuccherina sterilizzata. Esegui questo regime di alimentazione per quattro settimane. Come prima, anestetizzare l'orticaria alla fine del periodo di prova.

Quindi apri molto delicatamente ed riesuma il contenuto della tana senza lasciare che il polline o le api larvali cadano più in profondità nel nido. Esegui le stesse metriche di conteggio e pesatura per l'alveare di prima, ma raschia anche le riserve di polline contenute all'interno delle camere di covata usando una pinza sterilizzata. Raccogli il polline in provette sterili, quindi conservalo a meno 80 gradi Celsius per un'analisi successiva.

I dati ottenuti dagli esperimenti in gabbia hanno mostrato che le colonie di bombi avevano una risposta significativa all'esposizione ai fungicidi. Gli alveari trattati con fungicida hanno prodotto un numero significativamente inferiore di operaie rispetto agli alveari di controllo. La biomassa complessiva è stata ridotta anche negli alveari trattati con fungicidi, compresa la massa della Madre Regina.

Quindi il numero e la massa di larve, pupe e maschi adulti non sono stati influenzati. Gli esperimenti di laboratorio hanno rispecchiato i risultati sul campo. Presi insieme, questi risultati sono coerenti con i risultati precedentemente pubblicati e indicano che l'esposizione ai fungicidi influisce sulla fitness delle colonie.

I nostri dati mostrano che la diversità microbica e l'uniformità sono state ridotte negli alveari trattati con fungicida. L'analisi metagenomica delle riserve di polline è stata utilizzata per analizzare i cambiamenti nelle comunità microbiche degli alveari trattati con fungicidi. C'è stata un'enorme diminuzione dell'abbondanza di Streptomycetales ed Enterobacteriales comunemente isolati negli alveari trattati con fungicidi, mentre i membri batterici dell'ordine Rickettsiales, che include i patogeni comuni degli artropodi, erano in abbondanza molto maggiore negli alveari trattati con fungicidi.

Gli alveari trattati con fungicidi avevano anche una minore abbondanza di funghi appartenenti agli ordini Eurotiales, Sordariales e Saccharomycetales, mentre in realtà aumentavano l'abbondanza di funghi negli ordini Capnodiales e Ascosphaerales. Questi risultati indicano che i fungicidi possono alterare il microbioma delle forniture di polline, interrompendo efficacemente la simbiosi dei microbi delle api e compromettendo la salute delle api. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come allevare i bombi sul campo, sezionare i nidi d'api e identificare le comunità microbiche delle riserve di polline d'api, valutando così il ruolo dei fungicidi sulla salute delle colonie di api.

Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere utilizzate per dimostrare l'interruzione mediata da fungicidi del microbioma pollinico e il suo effetto indiretto sulla salute generale delle colonie di bombi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere condizioni asettiche durante la preparazione dei pasti a base di polline per evitare infezioni e infestazioni. Seguendo questa procedura, la descrizione della struttura della comunità microbica può essere ulteriormente migliorata allentando la frazione delle differenze totali tra le sequenze e riducendo il numero di taxa fondendo quelli con bassa abbondanza relativa.