Name: Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Impara a misurare l'attività scramblasi dei fosfolipidi con un saggio a fluorescenza utilizzando liposomi unilamellari grandi ricostituiti con opsina. Questo metodo robusto permette di studiare il trasporto lipidico intercellulare.

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Questo studio è stato supportato dalla Velux Stiftung (A.K.M.), dalla sovvenzione NIH EY024207 (A.K.M.) e dal progetto J3686 (B.P.) del Fondo austriaco per la scienza (FWF).

1. Preparazione di liposomi e proteoliposomi <ol><li> Formazione liposomi <ol><li> Usando una siringa di vetro, aggiungere 1.435 microlitri POPC (25 mg / ml, in cloroformio) e 160 microlitri POPG (25 mg / ml, in cloroformio) in un pallone a fondo rotondo da ottenere 52,5 mmol lipidi in un rapporto molare di POPC: POPG = 9: 1. </li><li> Essiccare i lipidi per 30 minuti usando un evaporatore rotante ad una velocità di rotazione di 145 rpm (senza bagno d&#39;acqua è necessaria per questo volume di solvente), quindi trasferire il pallone in un essiccatore sotto vuoto per almeno 3 ore, o durante la notte, a temperatura ambiente (RT). </li><li> Idratare il film lipidico essiccato con 10 ml di 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl (di seguito indicato come tampone A) agitando delicatamente il pallone fino a omogenei, risultati sospensione torbida; NOTA: La concentrazione di lipidi in questa fase dovrebbe essere 5,25 mM come perdite dovrebbero sono verificate finora. </li><li> Sonicare la sospensione a bagnomaria per 10 minuti a temperatura ambiente con una frequenza of 40 kHz. La soluzione sarà un po &#39;più chiara. </li><li> Utilizzando un estrusore, passare la sospensione per 10 volte attraverso una membrana con dimensione dei pori di 400 nm, seguito da un secondo ciclo di estrusione con 4 passa attraverso una membrana con dimensione dei pori di 200 nm. NOTA: Il diametro medio delle luvs risultante è ~ 175 nm. Se necessario, le dimensioni e l&#39;omogeneità delle luvs possono essere controllati da Dynamic Light Scattering secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Quantificare la concentrazione di fosfolipidi della sospensione LUV come descritto nel paragrafo 1.2). NOTA: A causa delle perdite durante l&#39;estrusione, la concentrazione è di solito circa 3,6 mm. </li><li> Conservare i luvs a 4 ° C per circa 2 settimane, se non utilizzato immediatamente. </li></ol></li><li> Quantificazione fosfolipide NOTA: Per determinare la concentrazione di fosfolipidi della sospensione LUV usato per la ricostituzione, così come quella dei proteoliposomi che vengono eventualmente generati, una aliquota del campione è subjeCTED all&#39;ossidazione da acido perclorico. Questa procedura si rompe fosfolipidi per rilasciare fosfato inorganico che viene poi quantificato mediante un saggio colorimetrico in confronto con standard 23. <ol><li> Preparare una soluzione 40 mM magazzino di fosfato di sodio (Na 2 HPO 4) in acqua distillata deionizzata. </li><li> Diluire la soluzione madre con acqua distillata deionizzata per ottenere 4 mm e 0,4 mm di soluzioni che serviranno come standard di calibrazione di lavoro. </li><li> Utilizzando le soluzioni di lavoro, preparare standard in 13 provette x 100 mm 2 di vetro che vanno da 0 a 80 nmol fosfato di sodio in un volume finale di 50 pl. </li><li> Prendere 10 ml ciascuno dei campioni Luv e proteoliposome da quantificare e diluire con 40 ml di DDH 2 O in 13 tubi x 100 mm 2 di vetro. NOTA: Poiché la concentrazione di lipidi delle luvs e proteoliposomi è nell&#39;intervallo 2.5-5 mM, 10 microlitri del campione dovrebbe contenere 25-50 nmol lipidi fosforo.</li><li> Aggiungere 300 pl di acido perclorico a ciascuno degli standard e campioni e calore per 1 ora a 145 ° C su una piastra riscaldante. Mettere marmi sui tubi per evitare l&#39;evaporazione. </li><li> Lasciate che i tubi raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere 1 ml di DDH 2 O. </li><li> Aggiungere 400 ml ciascuna di appena preparato 12 g / L molibdato di ammonio e 50 g / L di ascorbato di sodio e vortex per miscelare. </li><li> Calore per 10 min a 100 ° C con marmi sopra dei tubi. Rimuovere i tubi dal blocco di riscaldamento e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza dei campioni contro il (campione standard contenente 0 nmol sodio fosfato) in bianco con uno spettrometro ad una lunghezza d&#39;onda di 797 nm. </li><li> Determinare il contenuto di fosfati di campioni contro la curva standard di calibrazione. </li></ol></li><li> Ricostituzione di opsin NOTA: È necessario determinare le condizioni ottimali per la ricostituzione gonfiore quanto questi dipendono dalla natura del detergente, nonchéla composizione lipidica e la concentrazione dei luvs. Come luvs cambiano le loro proprietà di scattering di luce sul gonfiore del processo possono essere monitorati misurando l&#39;assorbanza (figura 2), come recensito da Rigaud e Levy 24 e Geertsma et al. 25. <ol><li> Pipettare 800 ml di luvs (dal punto 1.1, come il recupero dei lipidi dopo l&#39;estrusione è del 70%, la concentrazione prevista di luvs è da 3.6 mm fosfolipidi) in una provetta per microcentrifuga da 2 ml. </li><li> Aggiungere 5,3 ml di tampone A e 34,7 ml di 10% (w / v) DDM disciolto in tampone A. </li><li> Incubare per 3 ore a temperatura ambiente con miscelazione end-over-end. </li><li> Nel frattempo preparare le perle di polistirene: <ol><li> Utilizzare 400 mg di perline per campione e pesare in un bicchiere di vetro. </li><li> Lavare due volte con metanolo, tre volte con acqua e una volta con tampone A. Per ogni utilizzo fase di lavaggio 5 ml di liquido e mescolare lentamente per 10 minuti. NOTA: Si consiglia di preparare il polistireneperline per diversi campioni alla volta, ad esempio, pesano in 6 g di perline e lavare con 75 ml di liquido. perline in eccesso possono essere conservate in frigorifero per diversi giorni. </li></ol></li><li> Durante gli ultimi 30 min di vescicole destabilizzazione asciugare il fosfolipide NBD marcato in un tubo di vetro con tappo a vite ( &#39;la ricostituzione tubo di vetro&#39;): Per esempio, 9,5 ml di NBD-PC (1 mg / ml in cloroformio, ottenendo 0,4 moli% dei fosfolipidi totali) sono a secco sotto flusso di azoto in un tubo di vetro e successivamente disciolto in 45 ml di 0,1% (w / v) DDM in tampone A. </li><li> Dopo 3 h di vescicole destabilizzazione aggiungere il fosfolipide sciolto-NBD-marcato, la proteina DDM-solubilizzato e tampone A tale che il volume finale di 1 ml contiene 0,36% (w / v), cioè, 7 mM, DDM. <ol><li> Così, per generare liposomi privi di proteine ​​(usato come campione di controllo) aggiungere 45 ml di NBD-PC (sciolti in 0,1% DDM), 60 ml di 0,1% DDM e 55 ml di tampone A; per proteoliposomi aggiungere, per l&#39;esamepio, 40 ml di proteine ​​(da una tipica soluzione stock di ~ 110 ng / ml) nel 0,1% DDM, 45 ml di NBD-PC (disciolti in 0,1% DDM), 20 ml di 0,1% DDM e 55 ml di tampone A . NOTA: L&#39;ordine delle aggiunte deve essere come indicato. </li></ol></li><li> Mescolare il campione per un fine hr supplementare rispetto all&#39;estremità a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 80 mg delle perle di polistirene preparato e incubare il campione con end-over-end miscelazione per 1 ora a RT. </li><li> Successivo aggiungere un ulteriore 160 mg di perle di polistirene e incubare con end-over-end miscelazione per ulteriori 2 ore a RT. </li><li> Trasferire il campione (lasciando le sferette di polistirene spesi dietro) in una provetta di vetro con tappo a vite contenenti 160 mg di perle di polistirene freschi e mescolare notte a 4 ° C. NOTA: Il modo più semplice per trasferire il campione ed evitare risucchiando perline è usare una pipetta Pasteur che viene spinto verso il fondo del tubo di vetro con una leggera pressione positiva. Una volta che la punta della pipetta è saldamente alfondo del tubo, il campione può essere estratto facilmente senza interferenze dalle perline. </li><li> La mattina seguente, trasferire il campione in una provetta da microcentrifuga senza riporto di perline e posto sul ghiaccio in preparazione per il saggio di attività scramblase. </li></ol></li></ol> 2. Scramblase Activity Assay NOTA: L&#39;intensità di fluorescenza di liposomi o proteoliposomi diluiti con tampone A è monitorata nel tempo dopo l&#39;aggiunta di ditionito in uno spettrometro a fluorescenza. Per ottenere un&#39;intensità partire stabile, la fluorescenza viene registrato per almeno 50 secondi (o fino a quando si ottiene un segnale stabile) prima di aggiungere ditionito ad un campione costantemente agitata e viene poi seguito per almeno 500 secondi dopo l&#39;aggiunta ditionito. <ol><li> Aggiungere 1.950 ml di tampone A ad una cuvetta di plastica contenente un mini stir-bar. </li><li> Aggiungere 50 ml di Proteo preparata (liposomi) e lasciare che il campione di equilibrare in Spectro a fluorescenzameter con agitazione costante per diversi secondi. </li><li> Nel frattempo preparare una soluzione di 1 M ditionito in 0,5 M buffer Tris (ad esempio, per due campioni pesare 20 mg di ditionito in una provetta per microcentrifuga e dissolvono in 114 microlitri ghiacciata 0,5 M Tris direttamente prima dell&#39;uso e mantenere in ghiaccio per il prossimo campione). NOTA: La soluzione ditionito deve essere preparata al momento e non deve essere utilizzato più di 20 minuti dopo la preparazione; se molte misurazioni devono essere effettuate, aliquote di ditionito possono essere pesati in anticipo e sciolti destra prima dell&#39;uso. </li><li> Avviare il monitoraggio a fluorescenza (eccitazione 470 nm, emissione di 530 nm, fessura di larghezza 0,5 nm). </li><li> Aggiungere 40 ml di soluzione di ditionito 1 M alla cuvetta 50 sec dopo aver iniziato la fluorescenza registrazione (utilizzare il setto nel coperchio della camera cuvetta se possibile) e continuare a registrare la fluorescenza per un ulteriore 400-600 sec. </li><li> Analizzare i dati come descritto nella sezione 3. </li></ol> 3.Analisi dei dati <ol><li> Cinetica di Scrambling <ol><li> Caratterizzare la traccia fluorescenza di ciascun campione ottenuto dal saggio di attività scramblase definendo fluorescenza iniziale, F i, prima di aggiungere ditionito, e la fluorescenza end-point, F, raggiunta dopo&gt; 400 sec. F i è determinato per ogni campione come il valore medio della fluorescenza per il periodo di 30 sec prima dell&#39;aggiunta ditionito. </li><li> Determinare i dati end-point corrispondente alla misura della riduzione di fluorescenza, R = 100 • F / F i. Usiamo i termini R L per liposomi senza proteine ​​e R P per proteoliposomi opsin contenenti. </li></ol></li><li> Determinare il peso molecolare del Funzionalmente ricostituito Scramblase <ol><li> Convertire i dati di riduzione di fluorescenza secondo la seguente equazione: p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (Equazione 1) NOTA: Dove R max è la massima riduzione che si ottiene quando la proteina sufficiente ricostituito tale che tutti vescicole nel campione possiedono almeno un scramblase funzionali, e p è la probabilità che una particolare vescicole in un campione ricostituito viene &#39;scramblase-active&#39;, cioè, possiede almeno un scramblase funzionale. Il valore di R L è tipicamente 45% 3 mentre R max è tipicamente 82,5% 3, anziché il previsto 100% (R può essere determinata sperimentalmente per proteoliposomi opsin con PPR&gt; 1 mg / mmol max). Come R max &lt;100% si assume che una sotto-popolazione di vescicole refrattaria alla ricostituzione. Per R max = 82,5%, la frazione di vescicole che è in grado di accettare proteina è 0.35. </li><li> Descrivere la relazione tra p (≥1 scramblase) e PPR (mg di proteina / mmol fosfolipidi) dalle statistiche Poisson come segue: p (≥1 scramblase) = 1 - e <sup&gt; -m = 1 - exp (-PPR / α) (Equazione 2) NOTA: Dove m = numero di scramblases per vescicole e α = mono-esponenziale costante adattamento in unità di mg fosfolipidi proteine ​​/ mmol. </li><li> Come una frazione delle vescicole non contribuisce a scrambling anche ad alte PPR (vedi la discussione), modificare l&#39;equazione: p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Equazione 3) NOTA: Dove PPR * = PPR / (1- f), dove f è la popolazione refrattaria di vescicole o, in questo caso, PPR * = PPR / 0.65 (Equazione 4). NOTA: L&#39;adattamento α costante è determinata inserendo un grafico di p (≥1 scramblase) rispetto PPR * con funzione mono-esponenziale. Se opsina (peso molecolare 41,7 kDa) ricostituisce funzionalmente in vescicole 175-nm di diametro (ogni vescicola ha 280.000 fosfolipidi 26) come monomero, a = 0,187 mg mmol -1. Se opsina dimerizza prima della ricostituzione 3 per produrre vescicole scramblase-attivo, allora α= 0,37 mg mmol -1. Se PPR piuttosto che PPR * dovevano essere utilizzati per l&#39;analisi, quindi i corrispondenti valori alfa sarebbero 0,122 e 0,244 mg mmol -1. Questi valori previsti per α per scontato che tutte le molecole opsin sono funzionalmente competente. Se solo una frazione delle molecole è competente per rimescolare i lipidi, allora i corrispondenti valori di α sarà maggiore. </li></ol></li></ol>

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<li>Marek, M., Günther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li>
<li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+purification%2C+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2%2C+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li>
<li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li>
<li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li>
<li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p%2C+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio di attività scramblase ci ha permesso inizialmente di determinare che opsin ha fosfolipidi attività scramblase 2. Il test ha anche permesso di caratterizzare l&#39;attività scramblase di opsin testando specificità (abbiamo usato una varietà di lipidi giornalista NBD-etichettati come NBD-fosfatidiletanolamina, marcato con NBD su una catena acilica come mostrato ad NBD-PC in Figura 1A, o headgroup, NBD-sfingomielina o NBD- fosfatidilserina 2), l&#39;effetto di vescicole com...

La rodopsina fotorecettore, un G protein-coupled receptor prototipo (recensito ad esempio in riferimento 1), è il primo scramblasi essere identificati e biochimicamente verificato 2,3. Scramblases sono trasportatori fosfolipidi che aumentano il tasso intrinsecamente lento movimento transbilayer fosfolipide a fisiologicamente livelli appropriati in un bidirezionale, modalità ATP-indipendenti 4-6. Esempi di loro azioni possono essere trovati nel reticolo endoplasmatico e batterica membrana citoplasmatica dove è necessaria scrambling costitutivo per l&#39;omeostasi di membrana e la crescita, così come per una varietà di percorsi di glicosilazione 5. Scrambling fosfolipide regolamentata è necessaria per esporre fosfatidilserina (PS) sulla superficie delle cellule apoptotiche dove agisce come un &quot;mangia-me&quot; -signal per macrofagi 7 e fornisce una superficie procoagulante sulle piastrine attivate per catalizzare la produzione di fattore proteicos necessaria per la coagulazione del sangue. In membrane disco fotorecettori, l&#39;attività scrambling di rodopsina è stato suggerito di contrastare lo squilibrio fosfolipidi tra i due volantini membrana del doppio strato che viene generato dalla ATP-dipendente, lipidi unidirezionale flippase ABCA4 4,8,9 10-12. Nonostante l&#39;importanza fisiologica di scramblases, la loro identità è rimasta inafferrabile fino rodopsina è stato segnalato come un scramblase nei dischi dei fotorecettori 2, i membri della famiglia di proteine ​​TMEM16 sono stati identificati come Ca 2+ scramblases -dipendenti necessari per l&#39;esposizione di PS a livello della membrana plasmatica (recensione in riferimento 13), e la proteina batterica FTSW stato proposto come scramblase richiesto un lipide II per la sintesi del peptidoglicano 14. Queste scoperte sono state basate sulla ricostituzione delle proteine ​​purificate in liposomi e dimostrazione di attività scramblase nelle proteoliposomi risultanti mediante la metodologia describcato qui. Altri potenziali scramblases 15-21 - Le proteine ​​MurJ e AMJ implicati nella biosintesi peptidoglicano, WzxE e proteine ​​correlate implicati in rimescolando precursori O-antigene, le proteine ​​MPRF bisogno di traslocare phosphatidylglycerol aminoacylated attraverso la membrana citoplasmatica batterica, e membri della famiglia Xkr8 che sono stati proposti esporre PS sulla superficie delle cellule apoptotiche - restano da testare biochimicamente. Questo mette in evidenza l&#39;importanza di un saggio robusto per identificare e caratterizzare l&#39;attività scramblase. Qui, descriviamo la ricostituzione di opsin purificata, la apoprotein della rodopsina fotorecettore, in grandi vescicole unilamellari (luvs), e la successiva analisi dell&#39;attività scramblase nelle proteoliposomi risultante utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza. Ci sono diversi protocolli ben descritto in letteratura per l&#39;espressione eterologa e purificazione di opsin, quindi non ci saràdescriverlo in questo protocollo; usiamo i protocolli descritti nelle Goren et al. 3, che i rendimenti FLAG-tag, opsina termostabile a circa 100 ng / ml a 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM). Ricostituzione si ottiene trattando luvs con detersivo sufficiente in modo che si gonfiano, ma non si sciolgono. In queste condizioni, una proteina di membrana - fornita in forma di micelle proteina-detergente - integrerà nei liposomi e diventare ricostituito nella membrana del liposoma alla rimozione del detersivo, causando proteoliposomi. Per ricostituire opsin (ottenuto come proteina purificata nello 0,1% (w / v) DDM), luvs sono preparati da una miscela di POPC (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine) e POPG (1- palmitoil-2-oleoyl- SN -glycero-3- [fosfo-rac- (1-glicerolo)]) e satura di DDM prima di aggiungere opsina e NBD-PC. Il detergente viene poi rimosso mediante trattamento del campione con perle di polistirene. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; Il principio alla base del saggio basato sulla fluorescenza è mostrato nella Figura 1B. Luvs sono simmetricamente ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC o un altro giornalista di fosfolipidi fluorescente NBD marcato (Figura 1A). In aggiunta ditionito, un non fluorescente dianione membrana impermeant, molecole NBD-PC nel foglietto esterno delle luvs sono resi come nitro-gruppo di NBD è ridotta ad un ammino-gruppo non fluorescente. Poiché né molecole NBD-PC né ditionito sono in grado di attraversare la membrana sulla scala temporale dell&#39;esperimento (&lt;10 min), questo si traduce in una riduzione del 50% del segnale fluorescente. Tuttavia, se i liposomi sono ricostituiti con una scramblase, molecole NBD-PC nel foglietto interno possono rimescolare rapidamente all&#39;esterno dove vengono ridotti. Ciò comporta la perdita totale della fluorescenza nel caso ideale (Figura 1C). es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di attività scramblase Il saggio utilizza una fluorescenza NBD marcato reporter di lipidi; NBD-PC è mostrato (A). Le grandi vescicole unilamellari sono ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC. Ricostituzione produce vescicole simmetriche, con NBD-PC distribuito equamente negli opuscoli esterne ed interne. Ditionito (S 2 O 4 2-) riduce chimicamente il nitro-gruppo di NBD ad un ammino-gruppo non fluorescente. Trattamento di liposomi privi di proteine ​​con ditionito (B, top) causa una riduzione del 50% della fluorescenza poiché solo le molecole NBD-PC nel foglietto esterno vengono ridotti: ditionito è caricato negativamente e non possono attraversare la membrana per reagire con molecole NBD-PC nel foglietto interno. Trattamento dithionite di proteoliposomi opsin contenenti (B, in basso), vale a dire, proteoliposomi scramblase-attiva, si traduce in perdita di 100% di fluorescence come opsina facilita il movimento di NBD-PC tra l&#39;interno e il foglietto esterno. (C) mostra le tracce di fluorescenza idealizzate ottenuti sul trattamento liposomi senza proteine ​​e proteoliposomi opsin contenenti con ditionito. Il tasso di perdita di fluorescenza è la stessa in entrambi i casi che indicano che la riduzione chimica dei NBD da ditionito è limitante, e che scrambling avviene ad una velocità uguale o superiore alla velocità della reazione chimica. Tracce ottenuti da un esperimento reale sono mostrati in figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> I metodi che descriviamo possono essere utilizzati per ricostituire e saggiare altre proteine ​​purificate, nonché miscele di proteine ​​di membrana ottenute, ad esempio, estraendo microsomi con detergente 22.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-Palmitoil-2-oleyl-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerolo) (sale sodico</td>)<td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzossadiazol-4-il)ammino]esanoil}-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfofonico</td><td>acido VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl Sigma</td><td></td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Fluorimetro cuvette</td><td>sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>cuvette</td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>fluorimetro</td><td></td></tr><tr><td>Idrosolfito di sodio grado tecnico, 85%</td><td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>ditionite</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 software</td><td></td><td></td><td>Prism</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml estrusore&nbsp;</td><td>Lipidi settentrionali, Inc.</td><td></td><td>Estrusore</td></tr><tr><td>Whatman, Disco di drenaggio, PE, 25 mm</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>Supporto disco</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched membrane, 0,4 & micro; m, diametro 25 mm</td><td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>membrana 400 nm</td></tr><tr><td>Membrane Whatman Nucleopore Track-Etched, 0,2 & micro; m, diametro 25 mm</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td>membrana 200 nm</td></tr><tr><td>fosfato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>Provette per colture VWR, monouso, vetro borosilicato, 13 x 100 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>provette in vetro</td></tr><tr><td>Acido perclorico</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato di ammonio Tetraidrato</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>Molibdato di ammonio</td></tr><tr><td>(+)-L-ascorbato di sodio</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>ascorbato di sodio</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 adsorbenti</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>perle di polistirene</td></tr><tr><td>&nbsp; Microprovette da 2,0 ml trasparenti</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>Provette</td></tr> per <tr><td>ricostituzione Tubo in vetro per ricostituzione</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Provette per ricostituzione</td></tr><tr><td>in vetro Zetasizer&nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td>Dls</td></tr></tbody></table>

un test fluorescenza a base di fosfolipidi scramblase activity

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases traslocano fosfolipidi attraverso il doppio strato di membrana bidirezionale in modo ATP-indipendente. Il primo scramblase per essere identificati e biochimicamente verificato è stato opsin, la apoprotein della rodopsina fotorecettori. Rhodopsin è un recettore accoppiato alla proteina G localizzato in rod fotorecettori membrane a disco della retina dove è responsabile per la percezione della luce. Attività scramblase di Rhodopsin non dipende dal suo ligando 11- cis -retinal, cioè, il opsin apoprotein è anche attivo come scramblase. Sebbene fosfolipidi costitutiva e regolato scrambling svolgono un ruolo importante nella fisiologia cellulare, solo pochi scramblases fosfolipidi sono stati identificati finora oltre opsin. Qui si descrive un saggio di fluorescenza a base di attività di scramblase opsin. Opsina viene ricostituito in grandi liposomi unilamellari composti di fosfatidilcolina, phosphatidylglycerol e una quantità traccia di fluorescenza NBD marcato PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-il) ammino] esanoile} - sn -glycero-3-phosphocholine). attività Scramblase è determinata misurando la misura in cui le molecole NBD-PC situati nel foglietto interno della vescicola sono in grado di accedere al foglietto esterno dove la loro fluorescenza viene eliminata chimicamente da un agente riducente che non può attraversare la membrana. I metodi che descriviamo hanno applicabilità generale e può essere utilizzato per identificare e caratterizzare le attività scramblase di altre proteine ​​di membrana.

Descriviamo la ricostituzione di opsin in luvs per caratterizzare la propria attività scramblase usando un test basato sulla fluorescenza. Analizziamo i risultati di porre un limite inferiore del tasso di fosfolipidi opsin mediata scomposizione e per determinare lo stato oligomerico in cui opsin ricostituisce funzionalmente nelle vescicole. Per identificare le condizioni ottimali di ricostituzione, è necessario determinare emp...

Descriviamo un test basato sulla fluorescenza per misurare lo scrambling dei fosfolipidi in grandi liposomi unilamellari ricostituiti con opsina.

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di reconstituire un tipico recettore accoppiato a proteina G in vescicole unilamellari grandi e misurare la sua capacità di effettuare il trasloco indipendente da 80p di fosfolipidi attraverso un doppio strato lipidico, utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del trasporto lipidico intercellulare, come ad esempio qual è l'identità molecolare delle proteine in grado di riordinare i lipidi e quale sia il loro meccanismo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto affidabile e robusta.Una volta stabilita la procedura di ricostituzione per una determinata composizione lipidica e un detergente preferito, iniziare aggiungendo con una siringa di vetro 1435 microlitri di una soluzione di POPC in cloroformio alla concentrazione di 25 milligrammi per millilitro in un pallone a fondo rotondo. Aggiungere 160 microlitri di una soluzione di POPG in cloroformio alla concentrazione di 25 milligrammi per millilitro per ottenere 52,5 micromoli di lipidi in un rapporto molare di nove a uno tra POPC e POPG.Successivamente, asciugare i lipidi per 30 minuti

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Introduciamo un digiuno a base di test a fluorescenza che controlla il tasso di estinzione di fluorescenza come una misura di attività del canale gramicidina. I canali gramicidina sono utilizzati come trasduttori di forza molecolare per monitorare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning.

Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

Per verificare l'interazione di una proteina con la sua lipidi obiettivo abbiamo utilizzato MACS e sfere magnetiche annessina V-coniugati e vescicole lipidiche sintetizzato dal lipidi target e annessina V-binding fosfatidilserina. Le proteine ​​legate alla lipidi target sono co-purificati e analizzati dopo eluizione dal perline.

Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per l&#39;analisi delle interazioni proteina-lipide

Questo video discute il test di perdita di fluorescenza per studiare le interazioni dei peptidi che penetrano nelle cellule con le membrane cellulari utilizzando imitatori della membrana cellulare: grandi vescicole unilamellari, o LUV, incapsulate con un colorante fluorescente e un quencher.

Saggio di perdita di fluorescenza per studiare l'interazione del peptide che penetra nelle cellule con la membrana

In questo video, dimostriamo le interazioni proteina-fosfoinositide in un modello microfluidico utilizzando il saggio di modulazione del pH, utilizzando un colorante fluorescente sensibile al pH etichettato con il lipide fosfatidiletanolammina di un doppio strato lipidico supportato, chiamato piattaforma microfluidica. Le modulazioni del pH dopo il legame delle proteine con i fosfolipidi causano l'estinzione della fluorescenza.

Saggio di modulazione del pH su doppi strati lipidici supportati per rilevare le interazioni proteina-fosfoinositide

Presentiamo una nuova tecnica per misurare la diffusione laterale di una specie attiva di superficie all'interfaccia fluido-fluido fondendo un monostrato di goccioline su un monostrato piatto.

Recupero della fluorescenza dopo Fusione di una Droplet misurare la diffusione bidimensionale di un fosfolipide monostrato

PI (4,5) P2 regola diverse funzioni cellulari, ma la sua organizzazione su scala nanometrica nella membrana plasmatica delle cellule è poco conosciuta. Etichettando PI (4,5) P2 con una sonda fluorescente a due colori fusa al dominio Pleckstrin omologia, si descrive un nuovo approccio per studiare il PI (4,5) P2 distribuzione spaziale nella membrana plasmatica su scala nanometrica .

Singolo-molecola di Super-Resolution Imaging di fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato nella membrana plasmatica con il romanzo fluorescenti Sonde

Qui presentiamo un bilingue lipidico supportato nel contesto di una piattaforma microfluidica per studiare le interazioni proteine-fosfoinositide usando un metodo senza etichetta basato sulla modulazione del pH.

PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell'inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Il test di perdita di fluorescenza è un metodo semplice che consente di studio delle interazioni peptidi/membrana al fine di comprendere il loro coinvolgimento in diversi processi biologici e in particolare la capacità dei peptidi penetranti nelle cellule di disturbare i doppio strati dei fosfolipidi durante un processo di traslocazione cellulare diretta.

Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

Qui, descriviamo protocolli che utilizzano sensori lipidici fluorescenti e liposomi per determinare se una proteina estrae e trasporta fosfatidilserina o fosfatidilinositolo 4-fosfato in vitro.

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Presentiamo un metodo economico per valutare la permeabilità della membrana liposomiale con sensibilità e risoluzione superiori rispetto alle tecniche convenzionali. Utilizzando una nuova reazione di sostituzione del ligando incapsulato, questa tecnica rileva i cambiamenti indotti dalla fosfolipasi A2 nelle membrane del modello. Facilmente integrabile con le analisi standard, questo approccio accessibile migliora la risoluzione per lo studio della biofisica delle membrane e delle interazioni...

Un saggio di permeabilità della membrana liposomica per studiare gli effetti dei gruppi fosfatidilinositolo fosfato sull'azione membranotropica del veleno PLA2

Impara a misurare l'attività scramblasi dei fosfolipidi con un saggio a fluorescenza utilizzando liposomi unilamellari grandi ricostituiti con opsina. Questo metodo robusto permette di studiare il trasporto lipidico intercellulare.

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

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