Name: Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Impara a misurare l'attività scramblasi dei fosfolipidi con un saggio a fluorescenza utilizzando liposomi unilamellari grandi ricostituiti con opsina. Questo metodo robusto permette di studiare il trasporto lipidico intercellulare.

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Questo studio è stato supportato dalla Velux Stiftung (A.K.M.), dalla sovvenzione NIH EY024207 (A.K.M.) e dal progetto J3686 (B.P.) del Fondo austriaco per la scienza (FWF).

1. Preparazione di liposomi e proteoliposomi <ol><li> Formazione liposomi <ol><li> Usando una siringa di vetro, aggiungere 1.435 microlitri POPC (25 mg / ml, in cloroformio) e 160 microlitri POPG (25 mg / ml, in cloroformio) in un pallone a fondo rotondo da ottenere 52,5 mmol lipidi in un rapporto molare di POPC: POPG = 9: 1. </li><li> Essiccare i lipidi per 30 minuti usando un evaporatore rotante ad una velocità di rotazione di 145 rpm (senza bagno d&#39;acqua è necessaria per questo volume di solvente), quindi trasferire il pallone in un essiccatore sotto vuoto per almeno 3 ore, o durante la notte, a temperatura ambiente (RT). </li><li> Idratare il film lipidico essiccato con 10 ml di 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl (di seguito indicato come tampone A) agitando delicatamente il pallone fino a omogenei, risultati sospensione torbida; NOTA: La concentrazione di lipidi in questa fase dovrebbe essere 5,25 mM come perdite dovrebbero sono verificate finora. </li><li> Sonicare la sospensione a bagnomaria per 10 minuti a temperatura ambiente con una frequenza of 40 kHz. La soluzione sarà un po &#39;più chiara. </li><li> Utilizzando un estrusore, passare la sospensione per 10 volte attraverso una membrana con dimensione dei pori di 400 nm, seguito da un secondo ciclo di estrusione con 4 passa attraverso una membrana con dimensione dei pori di 200 nm. NOTA: Il diametro medio delle luvs risultante è ~ 175 nm. Se necessario, le dimensioni e l&#39;omogeneità delle luvs possono essere controllati da Dynamic Light Scattering secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Quantificare la concentrazione di fosfolipidi della sospensione LUV come descritto nel paragrafo 1.2). NOTA: A causa delle perdite durante l&#39;estrusione, la concentrazione è di solito circa 3,6 mm. </li><li> Conservare i luvs a 4 ° C per circa 2 settimane, se non utilizzato immediatamente. </li></ol></li><li> Quantificazione fosfolipide NOTA: Per determinare la concentrazione di fosfolipidi della sospensione LUV usato per la ricostituzione, così come quella dei proteoliposomi che vengono eventualmente generati, una aliquota del campione è subjeCTED all&#39;ossidazione da acido perclorico. Questa procedura si rompe fosfolipidi per rilasciare fosfato inorganico che viene poi quantificato mediante un saggio colorimetrico in confronto con standard 23. <ol><li> Preparare una soluzione 40 mM magazzino di fosfato di sodio (Na 2 HPO 4) in acqua distillata deionizzata. </li><li> Diluire la soluzione madre con acqua distillata deionizzata per ottenere 4 mm e 0,4 mm di soluzioni che serviranno come standard di calibrazione di lavoro. </li><li> Utilizzando le soluzioni di lavoro, preparare standard in 13 provette x 100 mm 2 di vetro che vanno da 0 a 80 nmol fosfato di sodio in un volume finale di 50 pl. </li><li> Prendere 10 ml ciascuno dei campioni Luv e proteoliposome da quantificare e diluire con 40 ml di DDH 2 O in 13 tubi x 100 mm 2 di vetro. NOTA: Poiché la concentrazione di lipidi delle luvs e proteoliposomi è nell&#39;intervallo 2.5-5 mM, 10 microlitri del campione dovrebbe contenere 25-50 nmol lipidi fosforo.</li><li> Aggiungere 300 pl di acido perclorico a ciascuno degli standard e campioni e calore per 1 ora a 145 ° C su una piastra riscaldante. Mettere marmi sui tubi per evitare l&#39;evaporazione. </li><li> Lasciate che i tubi raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere 1 ml di DDH 2 O. </li><li> Aggiungere 400 ml ciascuna di appena preparato 12 g / L molibdato di ammonio e 50 g / L di ascorbato di sodio e vortex per miscelare. </li><li> Calore per 10 min a 100 ° C con marmi sopra dei tubi. Rimuovere i tubi dal blocco di riscaldamento e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza dei campioni contro il (campione standard contenente 0 nmol sodio fosfato) in bianco con uno spettrometro ad una lunghezza d&#39;onda di 797 nm. </li><li> Determinare il contenuto di fosfati di campioni contro la curva standard di calibrazione. </li></ol></li><li> Ricostituzione di opsin NOTA: È necessario determinare le condizioni ottimali per la ricostituzione gonfiore quanto questi dipendono dalla natura del detergente, nonchéla composizione lipidica e la concentrazione dei luvs. Come luvs cambiano le loro proprietà di scattering di luce sul gonfiore del processo possono essere monitorati misurando l&#39;assorbanza (figura 2), come recensito da Rigaud e Levy 24 e Geertsma et al. 25. <ol><li> Pipettare 800 ml di luvs (dal punto 1.1, come il recupero dei lipidi dopo l&#39;estrusione è del 70%, la concentrazione prevista di luvs è da 3.6 mm fosfolipidi) in una provetta per microcentrifuga da 2 ml. </li><li> Aggiungere 5,3 ml di tampone A e 34,7 ml di 10% (w / v) DDM disciolto in tampone A. </li><li> Incubare per 3 ore a temperatura ambiente con miscelazione end-over-end. </li><li> Nel frattempo preparare le perle di polistirene: <ol><li> Utilizzare 400 mg di perline per campione e pesare in un bicchiere di vetro. </li><li> Lavare due volte con metanolo, tre volte con acqua e una volta con tampone A. Per ogni utilizzo fase di lavaggio 5 ml di liquido e mescolare lentamente per 10 minuti. NOTA: Si consiglia di preparare il polistireneperline per diversi campioni alla volta, ad esempio, pesano in 6 g di perline e lavare con 75 ml di liquido. perline in eccesso possono essere conservate in frigorifero per diversi giorni. </li></ol></li><li> Durante gli ultimi 30 min di vescicole destabilizzazione asciugare il fosfolipide NBD marcato in un tubo di vetro con tappo a vite ( &#39;la ricostituzione tubo di vetro&#39;): Per esempio, 9,5 ml di NBD-PC (1 mg / ml in cloroformio, ottenendo 0,4 moli% dei fosfolipidi totali) sono a secco sotto flusso di azoto in un tubo di vetro e successivamente disciolto in 45 ml di 0,1% (w / v) DDM in tampone A. </li><li> Dopo 3 h di vescicole destabilizzazione aggiungere il fosfolipide sciolto-NBD-marcato, la proteina DDM-solubilizzato e tampone A tale che il volume finale di 1 ml contiene 0,36% (w / v), cioè, 7 mM, DDM. <ol><li> Così, per generare liposomi privi di proteine ​​(usato come campione di controllo) aggiungere 45 ml di NBD-PC (sciolti in 0,1% DDM), 60 ml di 0,1% DDM e 55 ml di tampone A; per proteoliposomi aggiungere, per l&#39;esamepio, 40 ml di proteine ​​(da una tipica soluzione stock di ~ 110 ng / ml) nel 0,1% DDM, 45 ml di NBD-PC (disciolti in 0,1% DDM), 20 ml di 0,1% DDM e 55 ml di tampone A . NOTA: L&#39;ordine delle aggiunte deve essere come indicato. </li></ol></li><li> Mescolare il campione per un fine hr supplementare rispetto all&#39;estremità a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 80 mg delle perle di polistirene preparato e incubare il campione con end-over-end miscelazione per 1 ora a RT. </li><li> Successivo aggiungere un ulteriore 160 mg di perle di polistirene e incubare con end-over-end miscelazione per ulteriori 2 ore a RT. </li><li> Trasferire il campione (lasciando le sferette di polistirene spesi dietro) in una provetta di vetro con tappo a vite contenenti 160 mg di perle di polistirene freschi e mescolare notte a 4 ° C. NOTA: Il modo più semplice per trasferire il campione ed evitare risucchiando perline è usare una pipetta Pasteur che viene spinto verso il fondo del tubo di vetro con una leggera pressione positiva. Una volta che la punta della pipetta è saldamente alfondo del tubo, il campione può essere estratto facilmente senza interferenze dalle perline. </li><li> La mattina seguente, trasferire il campione in una provetta da microcentrifuga senza riporto di perline e posto sul ghiaccio in preparazione per il saggio di attività scramblase. </li></ol></li></ol> 2. Scramblase Activity Assay NOTA: L&#39;intensità di fluorescenza di liposomi o proteoliposomi diluiti con tampone A è monitorata nel tempo dopo l&#39;aggiunta di ditionito in uno spettrometro a fluorescenza. Per ottenere un&#39;intensità partire stabile, la fluorescenza viene registrato per almeno 50 secondi (o fino a quando si ottiene un segnale stabile) prima di aggiungere ditionito ad un campione costantemente agitata e viene poi seguito per almeno 500 secondi dopo l&#39;aggiunta ditionito. <ol><li> Aggiungere 1.950 ml di tampone A ad una cuvetta di plastica contenente un mini stir-bar. </li><li> Aggiungere 50 ml di Proteo preparata (liposomi) e lasciare che il campione di equilibrare in Spectro a fluorescenzameter con agitazione costante per diversi secondi. </li><li> Nel frattempo preparare una soluzione di 1 M ditionito in 0,5 M buffer Tris (ad esempio, per due campioni pesare 20 mg di ditionito in una provetta per microcentrifuga e dissolvono in 114 microlitri ghiacciata 0,5 M Tris direttamente prima dell&#39;uso e mantenere in ghiaccio per il prossimo campione). NOTA: La soluzione ditionito deve essere preparata al momento e non deve essere utilizzato più di 20 minuti dopo la preparazione; se molte misurazioni devono essere effettuate, aliquote di ditionito possono essere pesati in anticipo e sciolti destra prima dell&#39;uso. </li><li> Avviare il monitoraggio a fluorescenza (eccitazione 470 nm, emissione di 530 nm, fessura di larghezza 0,5 nm). </li><li> Aggiungere 40 ml di soluzione di ditionito 1 M alla cuvetta 50 sec dopo aver iniziato la fluorescenza registrazione (utilizzare il setto nel coperchio della camera cuvetta se possibile) e continuare a registrare la fluorescenza per un ulteriore 400-600 sec. </li><li> Analizzare i dati come descritto nella sezione 3. </li></ol> 3.Analisi dei dati <ol><li> Cinetica di Scrambling <ol><li> Caratterizzare la traccia fluorescenza di ciascun campione ottenuto dal saggio di attività scramblase definendo fluorescenza iniziale, F i, prima di aggiungere ditionito, e la fluorescenza end-point, F, raggiunta dopo&gt; 400 sec. F i è determinato per ogni campione come il valore medio della fluorescenza per il periodo di 30 sec prima dell&#39;aggiunta ditionito. </li><li> Determinare i dati end-point corrispondente alla misura della riduzione di fluorescenza, R = 100 • F / F i. Usiamo i termini R L per liposomi senza proteine ​​e R P per proteoliposomi opsin contenenti. </li></ol></li><li> Determinare il peso molecolare del Funzionalmente ricostituito Scramblase <ol><li> Convertire i dati di riduzione di fluorescenza secondo la seguente equazione: p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (Equazione 1) NOTA: Dove R max è la massima riduzione che si ottiene quando la proteina sufficiente ricostituito tale che tutti vescicole nel campione possiedono almeno un scramblase funzionali, e p è la probabilità che una particolare vescicole in un campione ricostituito viene &#39;scramblase-active&#39;, cioè, possiede almeno un scramblase funzionale. Il valore di R L è tipicamente 45% 3 mentre R max è tipicamente 82,5% 3, anziché il previsto 100% (R può essere determinata sperimentalmente per proteoliposomi opsin con PPR&gt; 1 mg / mmol max). Come R max &lt;100% si assume che una sotto-popolazione di vescicole refrattaria alla ricostituzione. Per R max = 82,5%, la frazione di vescicole che è in grado di accettare proteina è 0.35. </li><li> Descrivere la relazione tra p (≥1 scramblase) e PPR (mg di proteina / mmol fosfolipidi) dalle statistiche Poisson come segue: p (≥1 scramblase) = 1 - e <sup&gt; -m = 1 - exp (-PPR / α) (Equazione 2) NOTA: Dove m = numero di scramblases per vescicole e α = mono-esponenziale costante adattamento in unità di mg fosfolipidi proteine ​​/ mmol. </li><li> Come una frazione delle vescicole non contribuisce a scrambling anche ad alte PPR (vedi la discussione), modificare l&#39;equazione: p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Equazione 3) NOTA: Dove PPR * = PPR / (1- f), dove f è la popolazione refrattaria di vescicole o, in questo caso, PPR * = PPR / 0.65 (Equazione 4). NOTA: L&#39;adattamento α costante è determinata inserendo un grafico di p (≥1 scramblase) rispetto PPR * con funzione mono-esponenziale. Se opsina (peso molecolare 41,7 kDa) ricostituisce funzionalmente in vescicole 175-nm di diametro (ogni vescicola ha 280.000 fosfolipidi 26) come monomero, a = 0,187 mg mmol -1. Se opsina dimerizza prima della ricostituzione 3 per produrre vescicole scramblase-attivo, allora α= 0,37 mg mmol -1. Se PPR piuttosto che PPR * dovevano essere utilizzati per l&#39;analisi, quindi i corrispondenti valori alfa sarebbero 0,122 e 0,244 mg mmol -1. Questi valori previsti per α per scontato che tutte le molecole opsin sono funzionalmente competente. Se solo una frazione delle molecole è competente per rimescolare i lipidi, allora i corrispondenti valori di α sarà maggiore. </li></ol></li></ol>

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<li>Marek, M., Günther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li>
<li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+purification%2C+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2%2C+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li>
<li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li>
<li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li>
<li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p%2C+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio di attività scramblase ci ha permesso inizialmente di determinare che opsin ha fosfolipidi attività scramblase 2. Il test ha anche permesso di caratterizzare l&#39;attività scramblase di opsin testando specificità (abbiamo usato una varietà di lipidi giornalista NBD-etichettati come NBD-fosfatidiletanolamina, marcato con NBD su una catena acilica come mostrato ad NBD-PC in Figura 1A, o headgroup, NBD-sfingomielina o NBD- fosfatidilserina 2), l&#39;effetto di vescicole com...

La rodopsina fotorecettore, un G protein-coupled receptor prototipo (recensito ad esempio in riferimento 1), è il primo scramblasi essere identificati e biochimicamente verificato 2,3. Scramblases sono trasportatori fosfolipidi che aumentano il tasso intrinsecamente lento movimento transbilayer fosfolipide a fisiologicamente livelli appropriati in un bidirezionale, modalità ATP-indipendenti 4-6. Esempi di loro azioni possono essere trovati nel reticolo endoplasmatico e batterica membrana citoplasmatica dove è necessaria scrambling costitutivo per l&#39;omeostasi di membrana e la crescita, così come per una varietà di percorsi di glicosilazione 5. Scrambling fosfolipide regolamentata è necessaria per esporre fosfatidilserina (PS) sulla superficie delle cellule apoptotiche dove agisce come un &quot;mangia-me&quot; -signal per macrofagi 7 e fornisce una superficie procoagulante sulle piastrine attivate per catalizzare la produzione di fattore proteicos necessaria per la coagulazione del sangue. In membrane disco fotorecettori, l&#39;attività scrambling di rodopsina è stato suggerito di contrastare lo squilibrio fosfolipidi tra i due volantini membrana del doppio strato che viene generato dalla ATP-dipendente, lipidi unidirezionale flippase ABCA4 4,8,9 10-12. Nonostante l&#39;importanza fisiologica di scramblases, la loro identità è rimasta inafferrabile fino rodopsina è stato segnalato come un scramblase nei dischi dei fotorecettori 2, i membri della famiglia di proteine ​​TMEM16 sono stati identificati come Ca 2+ scramblases -dipendenti necessari per l&#39;esposizione di PS a livello della membrana plasmatica (recensione in riferimento 13), e la proteina batterica FTSW stato proposto come scramblase richiesto un lipide II per la sintesi del peptidoglicano 14. Queste scoperte sono state basate sulla ricostituzione delle proteine ​​purificate in liposomi e dimostrazione di attività scramblase nelle proteoliposomi risultanti mediante la metodologia describcato qui. Altri potenziali scramblases 15-21 - Le proteine ​​MurJ e AMJ implicati nella biosintesi peptidoglicano, WzxE e proteine ​​correlate implicati in rimescolando precursori O-antigene, le proteine ​​MPRF bisogno di traslocare phosphatidylglycerol aminoacylated attraverso la membrana citoplasmatica batterica, e membri della famiglia Xkr8 che sono stati proposti esporre PS sulla superficie delle cellule apoptotiche - restano da testare biochimicamente. Questo mette in evidenza l&#39;importanza di un saggio robusto per identificare e caratterizzare l&#39;attività scramblase. Qui, descriviamo la ricostituzione di opsin purificata, la apoprotein della rodopsina fotorecettore, in grandi vescicole unilamellari (luvs), e la successiva analisi dell&#39;attività scramblase nelle proteoliposomi risultante utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza. Ci sono diversi protocolli ben descritto in letteratura per l&#39;espressione eterologa e purificazione di opsin, quindi non ci saràdescriverlo in questo protocollo; usiamo i protocolli descritti nelle Goren et al. 3, che i rendimenti FLAG-tag, opsina termostabile a circa 100 ng / ml a 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM). Ricostituzione si ottiene trattando luvs con detersivo sufficiente in modo che si gonfiano, ma non si sciolgono. In queste condizioni, una proteina di membrana - fornita in forma di micelle proteina-detergente - integrerà nei liposomi e diventare ricostituito nella membrana del liposoma alla rimozione del detersivo, causando proteoliposomi. Per ricostituire opsin (ottenuto come proteina purificata nello 0,1% (w / v) DDM), luvs sono preparati da una miscela di POPC (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine) e POPG (1- palmitoil-2-oleoyl- SN -glycero-3- [fosfo-rac- (1-glicerolo)]) e satura di DDM prima di aggiungere opsina e NBD-PC. Il detergente viene poi rimosso mediante trattamento del campione con perle di polistirene. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; Il principio alla base del saggio basato sulla fluorescenza è mostrato nella Figura 1B. Luvs sono simmetricamente ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC o un altro giornalista di fosfolipidi fluorescente NBD marcato (Figura 1A). In aggiunta ditionito, un non fluorescente dianione membrana impermeant, molecole NBD-PC nel foglietto esterno delle luvs sono resi come nitro-gruppo di NBD è ridotta ad un ammino-gruppo non fluorescente. Poiché né molecole NBD-PC né ditionito sono in grado di attraversare la membrana sulla scala temporale dell&#39;esperimento (&lt;10 min), questo si traduce in una riduzione del 50% del segnale fluorescente. Tuttavia, se i liposomi sono ricostituiti con una scramblase, molecole NBD-PC nel foglietto interno possono rimescolare rapidamente all&#39;esterno dove vengono ridotti. Ciò comporta la perdita totale della fluorescenza nel caso ideale (Figura 1C). es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di attività scramblase Il saggio utilizza una fluorescenza NBD marcato reporter di lipidi; NBD-PC è mostrato (A). Le grandi vescicole unilamellari sono ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC. Ricostituzione produce vescicole simmetriche, con NBD-PC distribuito equamente negli opuscoli esterne ed interne. Ditionito (S 2 O 4 2-) riduce chimicamente il nitro-gruppo di NBD ad un ammino-gruppo non fluorescente. Trattamento di liposomi privi di proteine ​​con ditionito (B, top) causa una riduzione del 50% della fluorescenza poiché solo le molecole NBD-PC nel foglietto esterno vengono ridotti: ditionito è caricato negativamente e non possono attraversare la membrana per reagire con molecole NBD-PC nel foglietto interno. Trattamento dithionite di proteoliposomi opsin contenenti (B, in basso), vale a dire, proteoliposomi scramblase-attiva, si traduce in perdita di 100% di fluorescence come opsina facilita il movimento di NBD-PC tra l&#39;interno e il foglietto esterno. (C) mostra le tracce di fluorescenza idealizzate ottenuti sul trattamento liposomi senza proteine ​​e proteoliposomi opsin contenenti con ditionito. Il tasso di perdita di fluorescenza è la stessa in entrambi i casi che indicano che la riduzione chimica dei NBD da ditionito è limitante, e che scrambling avviene ad una velocità uguale o superiore alla velocità della reazione chimica. Tracce ottenuti da un esperimento reale sono mostrati in figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> I metodi che descriviamo possono essere utilizzati per ricostituire e saggiare altre proteine ​​purificate, nonché miscele di proteine ​​di membrana ottenute, ad esempio, estraendo microsomi con detergente 22.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-Palmitoil-2-oleyl-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerolo) (sale sodico</td>)<td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzossadiazol-4-il)ammino]esanoil}-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfofonico</td><td>acido VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl Sigma</td><td></td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Fluorimetro cuvette</td><td>sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>cuvette</td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>fluorimetro</td><td></td></tr><tr><td>Idrosolfito di sodio grado tecnico, 85%</td><td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>ditionite</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 software</td><td></td><td></td><td>Prism</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml estrusore&nbsp;</td><td>Lipidi settentrionali, Inc.</td><td></td><td>Estrusore</td></tr><tr><td>Whatman, Disco di drenaggio, PE, 25 mm</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>Supporto disco</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched membrane, 0,4 & micro; m, diametro 25 mm</td><td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>membrana 400 nm</td></tr><tr><td>Membrane Whatman Nucleopore Track-Etched, 0,2 & micro; m, diametro 25 mm</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td>membrana 200 nm</td></tr><tr><td>fosfato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>Provette per colture VWR, monouso, vetro borosilicato, 13 x 100 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>provette in vetro</td></tr><tr><td>Acido perclorico</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato di ammonio Tetraidrato</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>Molibdato di ammonio</td></tr><tr><td>(+)-L-ascorbato di sodio</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>ascorbato di sodio</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 adsorbenti</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>perle di polistirene</td></tr><tr><td>&nbsp; Microprovette da 2,0 ml trasparenti</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>Provette</td></tr> per <tr><td>ricostituzione Tubo in vetro per ricostituzione</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Provette per ricostituzione</td></tr><tr><td>in vetro Zetasizer&nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td>Dls</td></tr></tbody></table>

un test fluorescenza a base di fosfolipidi scramblase activity

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases traslocano fosfolipidi attraverso il doppio strato di membrana bidirezionale in modo ATP-indipendente. Il primo scramblase per essere identificati e biochimicamente verificato è stato opsin, la apoprotein della rodopsina fotorecettori. Rhodopsin è un recettore accoppiato alla proteina G localizzato in rod fotorecettori membrane a disco della retina dove è responsabile per la percezione della luce. Attività scramblase di Rhodopsin non dipende dal suo ligando 11- cis -retinal, cioè, il opsin apoprotein è anche attivo come scramblase. Sebbene fosfolipidi costitutiva e regolato scrambling svolgono un ruolo importante nella fisiologia cellulare, solo pochi scramblases fosfolipidi sono stati identificati finora oltre opsin. Qui si descrive un saggio di fluorescenza a base di attività di scramblase opsin. Opsina viene ricostituito in grandi liposomi unilamellari composti di fosfatidilcolina, phosphatidylglycerol e una quantità traccia di fluorescenza NBD marcato PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-il) ammino] esanoile} - sn -glycero-3-phosphocholine). attività Scramblase è determinata misurando la misura in cui le molecole NBD-PC situati nel foglietto interno della vescicola sono in grado di accedere al foglietto esterno dove la loro fluorescenza viene eliminata chimicamente da un agente riducente che non può attraversare la membrana. I metodi che descriviamo hanno applicabilità generale e può essere utilizzato per identificare e caratterizzare le attività scramblase di altre proteine ​​di membrana.

Descriviamo la ricostituzione di opsin in luvs per caratterizzare la propria attività scramblase usando un test basato sulla fluorescenza. Analizziamo i risultati di porre un limite inferiore del tasso di fosfolipidi opsin mediata scomposizione e per determinare lo stato oligomerico in cui opsin ricostituisce funzionalmente nelle vescicole. Per identificare le condizioni ottimali di ricostituzione, è necessario determinare emp...

Descriviamo un test basato sulla fluorescenza per misurare lo scrambling dei fosfolipidi in grandi liposomi unilamellari ricostituiti con opsina.

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di reconstituire un tipico recettore accoppiato a proteina G in vescicole unilamellari grandi e misurare la sua capacità di effettuare il trasloco indipendente da 80p di fosfolipidi attraverso un doppio strato lipidico, utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del trasporto lipidico intercellulare, come ad esempio qual è l'identità molecolare delle proteine in grado di riordinare i lipidi e quale sia il loro meccanismo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto affidabile e robusta.Una volta stabilita la procedura di ricostituzione per una determinata composizione lipidica e un detergente preferito, iniziare aggiungendo con una siringa di vetro 1435 microlitri di una soluzione di POPC in cloroformio alla concentrazione di 25 milligrammi per millilitro in un pallone a fondo rotondo. Aggiungere 160 microlitri di una soluzione di POPG in cloroformio alla concentrazione di 25 milligrammi per millilitro per ottenere 52,5 micromoli di lipidi in un rapporto molare di nove a uno tra POPC e POPG.Successivamente, asciugare i lipidi per 30 minuti utilizzando un evaporatore rotante impostato a 145 giri al minuto. Al termine dell'essiccazione, trasferire il pallone in un essiccatore sotto vuoto per tre ore a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 10 millilitri di tampone A per idratare il film lipidico essiccato.Ruotare delicatamente il matraccio fino a quando si forma una sospensione torbida omogenea. Sottoporre la sospensione a sonificazione a una frequenza di 40 kilohertz in un bagno d'acqua a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, utilizzando un estrusore, far passare il campione attraverso una membrana con dimensione dei pori di 400 nanometri, per 10 volte.Proseguire con un secondo ciclo di estrusione, facendo passare il campione attraverso una membrana con dimensione dei pori di 200 nanometri, quattro volte. Mettere da parte la sospensione risultante, visibilmente più chiara, che contiene vescicole unilamellari di fosfolipidi con un diametro di circa 175 nanometri. Al termine dell'estrusione, preparare gli standard in provette di vetro da 13 per 100 millimetri come indicato nel protocollo testuale.Quindi, aggiungere 10 microlitri di ciascun campione di LUV e proteoliposoma in un tubo di vetro distinto e diluire con 40 microlitri di acqua distillata deionizzata. Aggiungere 300 microlitri di acido perclorico a ciascun tubo e riscaldare per un'ora a 145 gradi Celsius in un blocco riscaldante. Posizionare un pallino di vetro su ciascun tubo per prevenire l'evaporazione.Quindi lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente e aggiungere un millilitro di acqua distillata deionizzata a ciascuno. Aggiungere 400 microlitri di una soluzione appena preparata contenente 12 grammi per litro di molibdato di ammonio e 50 grammi per litro di sodio ascorbato a ciascun tubo, quindi vortexare per mescolare. Riscaldare i tubi per 10 minuti a 100 gradi Celsius utilizzando palline di vetro per prevenire l'evaporazione.Quindi rimuovere i tubi dal blocco riscaldante e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. Utilizzando uno spettrometro impostato a 797 nanometri, ottenere una curva di calibrazione mediante gli standard. Successivamente, misurare l'assorbanza dei campioni rispetto al bianco e determinare il contenuto di fosfato.Iniziare prelevando con pipetta 800 microlitri di ciascuna sospensione di LUV estrusi in un tubo microfuse da due millilitri distinto. Aggiungere 5,3 microlitri di buffer A e 34,7 microlitri di DDM al 10% massa su volume, disciolto in buffer A, a ciascun tubo. Successivamente, incubare i campioni per tre ore a temperatura ambiente con miscelazione end-over-end.Mentre i campioni sono in incubazione, pesare 400 milligrammi per campione di perline in un becher di vetro. Lavare le perline con cinque millilitri per campione di metanolo, mescolando lentamente per 10 minuti. Ripetere questo lavaggio una volta con metanolo, tre volte con acqua e una volta con buffer A. Durante gli ultimi 30 minuti di incubazione del campione, essiccare 9,5 microlitri per campione di fosfolipide marcato con NBD in un tubo di vetro con tappo a vite sotto un flusso di azoto.Quindi, aggiungere 45 microlitri per campione di DDM allo 0,1% massa su volume nel buffer A per sciogliere il fosfolipide essiccato. Al termine dell'incubazione, aggiungere la soluzione di fosfolipide marcata con MBD disciolta a ciascun campione. Successivamente, aggiungere lo 0,1% di DDM, il buffer A e l'opsina solubilizzata con DDM nella quantità desiderata, in quest'ordine, per ottenere un volume finale di un millilitro con una concentrazione di sette millimoli di DDM.La ricostituzione di una proteina di membrana si ottiene trattando le vescicole con un detergente in quantità sufficiente affinché il rigonfiamento non si dissolva. In queste condizioni, che devono essere determinate empiricamente per ogni composizione lipidica e detergente, la proteina si integrerà nei liposomi. Mescolare i campioni per un'ora a temperatura ambiente.Quindi, aggiungere 80 milligrammi delle microsfere di polistirene preparate in ciascuna provetta e incubare nuovamente per un'ora a temperatura ambiente con mescolamento end-over-end. Aggiungere ulteriori 160 milligrammi di microsfere di polistirene a ciascun campione e incubare per due ore a temperatura ambiente con mescolamento end-over-end. Al termine dell'incubazione, trasferire i campioni, lasciando le microsfere residue, in provette pulite di vetro, ciascuna contenente 160 milligrammi di microsfere fresche.Mescolare da un'estremità all'altra durante la notte a quattro gradi Celsius, protetto dalla luce. Successivamente, trasferire i campioni, senza le perle, in provette microfuse distinte. Posizionare le provette sul ghiaccio in preparazione per il saggio di attività della scramblasio.Aggiungere all'inizio 1950 microlitri di tampone A in un cubetto di plastica contenente un’asta magnetica. Successivamente, aggiungere 50 microlitri del campione di proteoliposomi preparato. Lasciare equilibrare il campione nello spettrometro fluorescente con agitazione costante per cinque secondi.Mentre il campione è in equilibrio, preparare una soluzione di ditionite uno molare in tris non tamponato 0,5 molare. Avviare il monitoraggio della fluorescenza con un'eccitazione a 470 nanometri, un'emissione a 530 nanometri e una larghezza di fenditura di 0,5 nanometri. Registrare per 50 secondi per ottenere un segnale stabile.Quindi, aggiungere 40 microlitri di soluzione di ditionite uno molare alla cuvetta. Registrare la fluorescenza per almeno 500 secondi. Infine, analizzare i dati come indicato nel protocollo del testo.Per un'analisi completa dei dati di fluorescenza, quando si deve determinare la frazione di vescicole che non possono essere reintrodotte. Il recupero di proteine e lipidi nelle vescicole reintrodotte e anche la distribuzione dimensionale delle vescicole. In questo studio, l'opsina viene reintrodotto in vescicole unilamellari grandi per caratterizzarne l'attività scramblasi mediante un saggio basato sulla fluorescenza.I vescicoli vengono ricostruiti con NBD-PC, che si distribuisce equamente tra i foglietti esterno e interno. Il ditionite riduce il gruppo nitro dell’NBD all’esterno del vescicolo a gruppi amminici non fluorescenti, determinando una riduzione del 50% della fluorescenza nei liposomi privi di proteine. Tuttavia, quando l’opsina favorisce il movimento dell’NBD tra il foglietto interno ed esterno, si verifica una completa perdita di fluorescenza.I risultati rappresentativi di questo approccio a diversi rapporti proteina-fosfolipido sono visibili qui. Il grado di riduzione della fluorescenza aumenta con la quantità di opsina ricostruita nelle vescicole, che varia da zero a 4,95 microgrammi. Il ditionite è stato aggiunto al tempo indicato, e la fluorescenza di NBD è stata monitorata per 400 secondi.La riduzione della fluorescenza è più significativa a rapporti proteina-fosfolipide più elevati, con una riduzione massima del 85%. La riduzione della fluorescenza a regime è quindi utilizzata per determinare la probabilità di attività scramblasica, ovvero la probabilità che le vescicole contengano almeno una scramblasi, mediante la statistica di Polson. La curva rossa rappresenta un andamento mono-esponenziale per l'opsina. Le linee grigie tratteggiate rappresentano invece andamenti mono-esponenziali per il reimpacchettamento dell'opsina nelle vescicole come monomeri, dimeri preformati o tetrameri preformati.Il metodo che descriviamo può essere facilmente adattato a diverse esigenze. Le procedure sono versatili e potranno essere utilizzate in futuro per identificare e caratterizzare l'attività di scramblasi dei fosfolipidi di altre proteine di membrana. La procedura di reistituzione può essere applicata a qualsiasi proteina di membrana.Questa tecnica ci ha permesso di identificare l'opsina come la prima scramblasi di fosfolipidi verificata biochimicamente e di caratterizzare, successivamente, l'attività di diversi stati conformazionali della proteina e la sua capacità di trasportare diversi lipidi.

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