Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Descriviamo un test basato sulla fluorescenza per misurare lo scrambling dei fosfolipidi in grandi liposomi unilamellari ricostituiti con opsina.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ricostituire un tipico recettore accoppiato a proteine G in grandi vescicole unilamellari e di misurare la sua capacità di effettuare una traslocazione indipendente di fosfolipidi a 80p attraverso un doppio strato lipidico utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del trasporto lipidico intercellulare, come ad esempio qual è l'identità molecolare delle proteine che possono strapazzare i lipidi e qual è il loro meccanismo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto affidabile e robusta.

Una volta stabilita la procedura di ricostituzione, per una determinata composizione lipidica e un detergente preferito. Per iniziare questa procedura, utilizzare una siringa di vetro per aggiungere 1435 microlitri di una soluzione di 25 milligrammi per millilitro di POPC e cloroformio a un pallone a fondo rotondo. Aggiungere 160 microlitri di una soluzione da 25 milligrammi per millilitro di POPG e cloroformio per ottenere 52,5 micro-malipidi in un rapporto molare di nove a uno di POPC e POPG.

Quindi, asciugare i lipidi per 30 minuti utilizzando un evaporatore rotante impostato a 145 giri/min. Una volta completata l'asciugatura, trasferire il pallone in un essiccatore sottovuoto per tre ore a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 10 millilitri di tampone A per idratare il film lipidico morto.

Agitare delicatamente il pallone fino a formare una sospensione torbida omogenea. Sonicare la sospensione a una frequenza di 40 kilohertz in un bagno d'acqua a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, utilizzando un estrusore, far passare il campione attraverso una membrana con una dimensione dei pori di 400 nanometri, 10 volte.

Seguire questo con un secondo ciclo di estrusione, facendo passare il campione attraverso una membrana con una dimensione dei pori di 200 nanometri, quattro volte. Mettere da parte la sospensione risultante, visibilmente più chiara, che contiene grandi vescicole unilamellari di fospolipidi di circa 175 nanometri di diametro. Al termine dell'estrusione, preparare gli standard in tubi di vetro da 13 x 100 millimetri come indicato nel protocollo di testo.

Quindi, aggiungere 10 microlitri di ciascun campione di LUV e proteoliposoma in un'unica provetta di vetro e diluire con 40 microlitri di acqua distillata deionizzata. Aggiungere 300 microlitri di acido perclorico a ciascun tubo e riscaldare per un'ora a 145 gradi Celsius in un blocco riscaldante. Metti una biglia su ogni tubo per evitare l'evaporazione.

Quindi lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente e aggiungere a ciascuno un millilitro di acqua distillata deionizzata. Aggiungere a ciascuno 400 microlitri di una soluzione appena preparata contenente 12 grammi per litro di molibdato di ammonio e 50 grammi per litro di ascorbato di sodio e mescolare a vortice. Scaldare i tubi per 10 minuti a 100 gradi Celsius usando delle biglie per evitare l'evaporazione.

Quindi rimuovere i tubi dal blocco riscaldante e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. Utilizzando uno spettrometro impostato a 797 nanometri, ottenere una curva di calibrazione utilizzando gli standard. Quindi, misurare l'assorbanza dei campioni rispetto al bianco e determinare il contenuto di fosfato.

Iniziate pipettando 800 microlitri di ciascuna sospensione LUV estrusa in un'unica provetta microfusibile da due millilitri. Aggiungere 5,3 microlitri di tampone A e 34,7 microlitri di DDM al 10% in massa per volume, disciolto nel tampone A, in ciascuna provetta. Quindi, incubare i campioni per tre ore a temperatura ambiente con miscelazione end-over-end.

Durante l'incubazione dei campioni, pesare 400 milligrammi per campione di perle in un becher di vetro. Lavare le perle con cinque millilitri per campione di metanolo, mescolando lentamente per 10 minuti. Ripetere questo lavaggio una volta per il metanolo, tre volte con acqua e una volta con il tampone A.Durante gli ultimi 30 minuti di incubazione del campione, asciugare 9,5 microlitri per campione di fosfolipide marcato con NBD in una provetta di vetro con tappo a vite sotto un flusso di azoto.

Quindi, aggiungere 45 microlitri per campione di DDM allo 0,1% in massa per volume nel tampone A per sciogliere il fosfolipide essiccato. Al termine dell'incubazione, aggiungere la soluzione fosfolipidica disciolta marcata con MBD a ciascun campione. Quindi, aggiungere lo 0,1% di DDM, il tampone A e l'opsina solubilizzata in DDM nella quantità desiderata, in quest'ordine, per ottenere un volume finale di un millilitro con una concentrazione di sette millimolari di DDM.

La ricostituzione di una proteina di membrana si ottiene trattando le vescicole con un detergente sufficiente in modo che il rigonfiamento non si dissolva. E che queste condizioni, che devono essere trovate empiricamente per ogni composizione lipidica e detergente, la proteina si integrerà nei liposomi. Mescolare i campioni per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungere 80 milligrammi delle perle di polistirene preparate a ciascuna provetta e incubare nuovamente per un'ora a temperatura ambiente con miscelazione end-over-end. Aggiungere altri 160 milligrammi di perle di polistirene a ciascun campione e incubare per due ore a temperatura ambiente con miscelazione end-over-end. Al termine dell'incubazione, trasferire i campioni, lasciando le perle, in provette di vetro pulite, ciascuna contenente 160 milligrammi di perle fresche.

Mescolare end-over-end per una notte a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce. Quindi, trasferire i campioni, senza le perline, in provette microfuse uniche. Posizionare le provette sul ghiaccio in preparazione del test di attività scramblase.

Inizia aggiungendo 1950 microlitri di tampone A a una cubetta di plastica, contenente un'ancoretta di plastica. Quindi, aggiungere 50 microlitri del campione di protealiposoma preparato. Lasciare equilibrare il campione nello spettrometro fluorescente mescolando costantemente per cinque secondi.

Mentre il campione è in equilibrio, preparare una soluzione di un ditionito molare in tris non tamponato 0,5 molari. Avvia il monitoraggio della fluorescenza con un'eccitazione di 470 nanometri, un'emissione di 530 nanometri e una larghezza di fenditura di 0,5 nanometri. Registra per 50 secondi per ottenere un segnale stabile.

Quindi, aggiungere 40 microlitri di una soluzione di ditionito molare alla cubetta. Registrare la fluorescenza per almeno 500 secondi. Infine, analizza i dati come descritto nel protocollo di testo.

Per un'analisi completa dei dati di fluorescenza, quando si tratta di determinare la frazione di vescicole che non possono essere ricostituite. Il recupero di proteine e lipidi nelle vescicole ricostituite e anche la distribuzione dimensionale delle vescicole. In questo studio, l'opsina viene ricostituita in grandi vescicole unilamellari per caratterizzare la sua attività scramblase utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza.

Le vescicole vengono ricostituite con NBD-PC, che si distribuisce equamente tra i lembi esterni e interni. Il ditionito riduce il gruppo nitro dell'NBD all'esterno della vescicola in gruppi amminici non fluorescenti, con conseguente riduzione del 50% della fluorescenza nei liposomi privi di proteine. Tuttavia, quando l'opsina facilita il movimento dell'NBD tra il lembo interno ed esterno, si verifica una perdita completa della fluorescenza.

I risultati rappresentativi di questo approccio a diversi rapporti proteina-fosfolipide possono essere visti qui. L'estensione della riduzione della fluorescenza aumenta con la quantità di opsina ricostituita in vescicole, che varia da zero a 4,95 microgrammi. La ditionite è stata aggiunta all'ora indicata e la fluorescenza NBD è stata monitorata per 400 secondi.

La riduzione della fluorescenza è più significativa a rapporti proteina-fosfolipide più elevati, con la riduzione maggiore dell'85%La riduzione della fluorescenza dell'endpoint viene quindi utilizzata per determinare la probabilità di attività della scramblase, la probabilità che le vescicole abbiano almeno una scramblase utilizzando le statistiche di Polson. La curva rossa rappresenta un adattamento monoesponenziale per l'opsina. Mentre le linee grigie tratteggiate rappresentano adattamenti monoesponenziali per la ricostituzione dell'opsina in vescicole come monomeri, dimeri preformati o tetrameri preformati.

Il metodo che descriviamo può essere facilmente adattato alle diverse esigenze. Le procedure sono versatili e possono essere utilizzate per identificare e caratterizzare l'attività fosfolipidica scramblase di altre proteine di membrana in futuro. La procedura di ricostituzione può essere applicata a qualsiasi proteina di membrana.

Questa tecnica ci ha permesso di identificare l'opsina come la prima scramblasi fosfolipidica verificata biochimicamente e ci ha permesso, quindi, di caratterizzare l'attività di diversi stati di conferma della proteina e la sua capacità di trasportare diversi lipidi.