Name: Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine Ex Ovo Time-lapse imaging di Chick primi embrioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Impara a coltivare embrioni di pollo ex ovo per imaging time-lapse utilizzando il metodo del sandwich di carta da filtro immerso. Questa tecnica consente l'osservazione dettagliata degli eventi morfogenetici durante l'embriogenesi precoce.

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Gli autori riconoscono il sostegno finanziario di una borsa ZonMw-VICI 918.11.635 (Paesi Bassi). Gli autori desiderano ringraziare il negozio strumento della Vrije Universiteit di Amsterdam per i loro suggerimenti pratici e per la produzione di componenti di installazione e Jarno Voortman di Carl Zeiss Paesi Bassi per consigli utili sulla microscopia. Marjolein Blaauboer è stato un grande sostegno nel commentare criticamente sulle diverse bozze del manoscritto.

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con i Paesi Bassi esperimenti sugli animali Act. NOTA: Il metodo del panino carta da filtro sommerso viene modificato da 1. 1. Filtro sommerso Sandwich carta Preparazione <ol><li> Pannett-Compton (PC) -saline 27,28 <ol><li> Preparare soluzioni A (1 L superpuro H 2 O, 121 g di NaCl, 15,5 g di KCl, 10.42 g di CaCl 2 · H 2 O e 12,7 g di MgCl 2 · 6H 2 O) e B (1 L di ultrapura H 2 O, 2.365 g di Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, e 0,188 g di NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) in pulite bottiglie da 1 litro. conservarli a 4 ° C. </li><li> Preparare 1 L di PC-salina mescolando 900 ml di H 2 O ultrapura con 40 ml di soluzione A e 60 ml di soluzione B (in questo ordine per evitare la precipitazione). Preparare PC-salino fr frescoom soluzioni madre A e B ogni settimana. NOTA: Le soluzioni madre possono essere conservati a 4 ° C per diversi mesi. Autoclave e / o l'aggiunta di antibiotici o antimicotici non sono necessari. </li></ol></li><li> L'incubazione delle uova di gallina fecondate <ol><li> In un incubatore umidificato, deporre le uova dalla loro parte e li incubare a 37,5 ° C fino a quando non raggiungono l'età desiderata. NOTA: Conservare le uova non più di due settimane (preferibilmente a 12 - 15 ° C) prima dell'esperimento, come la schiusa si ridurrà in modo significativo </li></ol></li><li> Vettori di carta filtro (adattato da 1) <ol><li> Se disponibile, utilizzare una macchina di taglio laser per tagliare vettori carta da filtro a forma di clessidra dalla carta di filtrazione di spessore (28 mm x 22 mm). Cono la larghezza al centro da 22 mm a 10,4 mm. Tagliare un'apertura centrale ellittico (10.6 mm x 5,5 mm), con l'asse maggiore dell'ellisse orientato parallelamente al lato maggiore del vettore carta da filtro (Figura 1-M). <ol><li> Facoltativamente, preparare un stencil cartone con le dimensioni corrette e trasferire il suo contorno e quella dell'apertura centrale per carta spessa filtrazione con una matita. Tagliare il vettore carta da filtro con le forbici sottili. </li></ol></li><li> Tagliate due vettori di carta filtro identici per ogni embrione deve essere espiantato. Preparare vettori carta da filtro in più come riserva nel caso in cui un embrione si perde durante l'espianto. </li></ol></li><li> Temperatura controllata bagno d'olio (il giorno dell'esperimento) <ol><li> Porre il becher a temperatura controllata nel centro del motorizzata xy fasi del microscopio zoom verticale e collegare il bicchiere al suo controllore di temperatura. </li><li> Mettere quattro anelli di grande acciaio inossidabile (diametro esterno 30 mm, 4 mm, spessore da 1,5 mm) in un 6 centimetri Petri di agire come pesi e posizionare il piatto in mezzo bicchiere temperatura controllata. NOTA: Questo piatto Petri serve solo come segnaposto per regolare la leve oliol. </li><li> Riempire il bicchiere a temperatura controllata con 130 ml di olio minerale leggero. Regolare il livello dell'olio, se necessario, in modo che le estremità di circa 3 mm al di sotto del bordo superiore del 6 centimetri Petri. </li><li> Rimuovere il 6 centimetri Petri dal becher a temperatura controllata e impostare la temperatura a 40 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Filtro sommerso Sandwich produzione di carta <ol><li> Il terreno di coltura (il giorno dell'esperimento) <ol><li> Versare 30 ml di PC-salina (come preparato in passi 1.1.1 a 1.1.2) in una provetta da centrifuga da 50 ml. Preparare tubo una centrifuga da 50 ml riempito con 30 ml di PC-salina per ogni due embrioni per essere espiantati. </li><li> rompere con attenzione un uovo non incubate in un 10 centimetri Petri. </li><li> Raccolto albume sottili spostando una pipetta di trasferimento di plastica lungo le pareti della scatola di Petri e succhiare l'albume sottili. Raccogliere 30 ml albumina sottili in una provetta da centrifuga da 50 ml per ogni due embrioni per essere espiantati. Assicurati di ottenere solo il thin albume. NOTA: Di solito 3 - 4 uova permettono la raccolta di circa 30 ml di albume sottili. </li><li> Versare 20 ml di albume sottili in ogni PC-salino riempito 50 ml provetta da centrifuga (come preparato al punto 2.1.1). </li><li> Mescolare il PC-salina con l'albume sottili invertendo delicatamente i tubi diverse volte. Lasciare riposare per alcuni minuti e verificare se la miscela, chiamato terreno di coltura da qui in poi, è chiaro. Se il terreno di coltura non è chiaro, preparare fresco PC-salina dalla soluzione madre e raccogliere albume fresco sottili. </li></ol></li><li> Inserire due anelli piccoli in acciaio inox (diametro esterno 20 mm, 4 mm di altezza, spessore da 1,5 mm, 6,5 millimetri divario sul ring) il più lontano possibile in un fresco 6 centimetri di plastica Petri e riempirlo con 22 ml di cultura medio (preparato come passaggi 1.4.1 a 1.4.4) utilizzando una pipetta di plastica da 25 ml (Figura 1-H). Assicurarsi che detriti accumulati sopra il terreno rimane nella provetta da centrifuga. </li><li> Rimuovere eventuali detriti or bolle dal supporto con una pipetta di plastica trasferimento. </li><li> Riempire 10 cm capsula di Petri con 75 ml di PC-salino (da utilizzare nel passaggio 2.15). </li><li> Rimuovere un uovo dall'incubatore e lasciare riposare in panchina su un lato per 1 minuti per consentire l'embrione venire all'inizio del tuorlo. </li><li> Rompere con attenzione l'uovo in una capsula di Petri (Figura 1-A). Bagnare il bordo di un pezzo di carta velina bene in l'albume spessi e centrare blastoderma tirando, se necessario. </li><li> Rimuovere la maggior parte delle albume sottili e spessi dalla piastra di Petri con una pipetta di trasferimento di plastica (con la punta tagliata per facilitare l'assorbimento dei albume di spessore). </li><li> Creare una finestra l'albume spessore intorno dell'embrione delicatamente asciugando l'albume di spessore con un pezzo di carta velina, allontanandosi dal centro (Figura 1-B). Evitare che la carta velina di attaccarsi alla membrana vitellina. </li><li> Usando le pinzette, posizionare accuratamente un vettore carta da filtro sulla vitelline membrana intorno dell'embrione, con l'asse maggiore dell'apertura ellittica parallelo all'asse antero-posteriore dell'embrione (Figura 1-C). </li><li> Pinch una punta delle forbici chiodo attraverso la membrana vitellina vicino al vettore carta da filtro e tagliare rapidamente intorno a tutto il carrier carta da filtro (Figura 1-D). </li><li> Usando pinzette, sollevare il vettore carta da filtro dal tuorlo in direzione obliqua parallela all'asse antero-posteriore dell'embrione (Figura 1-E). </li><li> Girare il vettore carta da filtro in giro per avere il lato ventrale dell'embrione sulla parte superiore e immergerlo nel PC-salino. Immergere il carrier carta da filtro lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione in una direzione obliqua. </li><li> Sbarazzarsi di tutto il tuorlo ancora attaccato alla membrana vitellina e la blastoderma da vampate di calore delicatamente con PC-salino da una pipetta di trasferimento di plastica. Mantenere la totalità del vettore carta filtro sommerso in unll volte (Figura 1-F). </li><li> Rimuovere il supporto di carta filtro dal PC-salina lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione in direzione obliqua e liberarsi del liquido in eccesso tamponando il bordo del supporto carta filtro su una carta velina. </li><li> Tenere la carta da filtro in orizzontale, con il lato ventrale dell'embrione rivolta verso l'alto, e posizionare un altro vettore carta da filtro in cima al primo, usando una seconda coppia di pinzette. I loro aperture devono corrispondere esattamente, sandwich così l'embrione tra i due strati di carta filtro (Figura 1-G). </li><li> immergere immediatamente la carta da filtro panino vettore nel mezzo di coltura in una direzione obliqua lungo la antero-posteriore asse dell'embrione. Posizionare nell'area attraversa lo spazio tra i due anelli in acciaio (Figura 1-H). </li><li> Fissare il panino carta filtro posizionando due anelli in acciaio sopra degli altri due, facendo in modo che l'apertura con la embryo rimane completamente scoperto (Figura 1-I). </li><li> Controllare il livello medio e assicurarsi che il distanziatore superiore è appena immerso nel mezzo. Se necessario, aggiungere o rimuovere le piccole quantità di mezzo. </li><li> posizionare accuratamente la piastra di Petri nel centro del bagno d'olio a temperatura controllata e stabilizzare il piatto lateralmente disponendo tre grandi anelli in acciaio inossidabile (diametro di 30 mm esterno, 4 mm in altezza, mm di spessore della parete 1,5) prossimi al piatto nell'olio . Assicurarsi che gli anelli di acciaio tocchino i lati del piatto (Figura 1-J). </li><li> Lentamente pipettare circa 6 ml di olio minerale leggero sulla parte superiore del mezzo con una pipetta di plastica trasferimento, in modo che il mezzo è ricoperto da uno strato continuo di olio minerale (Figura 1-K). </li><li> Impostare l'acquisizione time-lapse. NOTA: Imaging gli embrioni come panorami orizzontali di cinque sotto-immagini sovrapposte (piastrelle) permette immagini dettagliate (obiettivo 5X), con un overvi generaleew della morfologia 29-30. Intervalli Imaging tra 3 e 10 min consentono il tracciamento dettagliata di morfologica cambia 31, e l'acquisizione di piccole z-stack (da cinque a sette piani diversi, con una distanza di 30 micron) compensa gran parte l'ispessimento e tornitura dell'embrione 30 . Z-aerei con il più alto contrasto possono essere selezionati prima di ulteriori trasformazioni 32 di singoli fotogrammi in filmati time-lapse (vedere la sezione Risultati Rappresentante per informazioni dettagliate su acquisizione di immagini). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg"> Figura 1: Impostazione del sommerso Sandwich filtro di carta. (A) Un uovo è incrinato in una capsula di Petri. (B) La maggior parte dell'albume spessi e sottili viene rimosso dalla piastra di Petri con una pipetta di plastica trasferimento (non mostrato). Poi, viene creata una finestra in dell'albume spesse untondo l'embrione delicatamente asciugandosi l'albume di spessore con un fazzolettino di carta. Supporto di carta (C) Un filtro è disposto intorno alla blastoderm in cima al tuorlo. (D) Il vettore carta da filtro viene tagliato sciolto dal circostante membrana vitellina e (E) rimosso dalla parte superiore del tuorlo. (F) Il tuorlo rimanente viene accuratamente lavato via in un bagno di PC-salino. (G) L'embrione viene inserita con un secondo vettore carta da filtro identici. (H) Il panino carta da filtro è sommerso nel mezzo e posizionato su due metallo anelli in acciaio inox (embrione rivolto dorsale o ventrale up). (I) Due anelli stabilizzano il sandwich dall'alto. (J) Il piatto Petri contenente l'embrione viene trasferito al bagno ad olio a temperatura controllata. anelli in acciaio inox stabilizzare la piastra di Petri lateralmente. (K) Il mezzo di coltura è coperto con uno strato di olio minerale.(L) Schema del sandwich filtro sommerso. (M) Dimensioni dei vettori di carta filtro utilizzate per il panino carta da filtro sommerso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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<li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol.+Protoc.+Vol.+I%22%5BJournal%5D)">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come una nuova variante della cultura CE consolidata 1, il panino carta da filtro sommerso facilita l&#39;acquisizione di lungo termine campo chiaro e campo scuro time-lapse film del primo embrione di pollo ex ovo facendo una temperatura e umidità controllata incubatore intorno il microscopio superflua. Piuttosto che essere coltivati ​​su un fondo semi-solido agar-albumina, gli embrioni vengono mantenuti completamente immersi in un mezzo di coltura semplice che consiste di PC-salina e albume sottili. L&#39;evaporazione e la perdita di calore sono minimizzati da uno strato di olio minerale galleggia sopra il terreno di coltura. Gli embrioni possono essere coltivate facilmente, sia dorsale o ventrale rivolta verso l&#39;alto, senza differenze visibili in termini di qualità. Come mostrato qui, gli embrioni in sandwich carta da filtro sommerso sono accessibili agli interventi di microchirurgia, come l&#39;applicazione di perline morphogen-impregnati. Le applicazioni future includono fluorescenza vivo imaging, microiniezioni e elettroporazione, e silenziamento genico a MAnipulate e studiare una vasta gamma di eventi morfogenetici durante ventrale di sviluppo (ad esempio, il cuore presto e somitogenesis) e dorsale (per esempio, in ritardo gastrulazione, chiusura del tubo neurale, e il cervello in anticipo). Un tempo-dipendente trattamento farmacologico è fattibile se la piastra di Petri contenente il sandwich carta da filtro viene sostituito con una camera di perfusione, consentendo lo scambio del terreno di coltura sotto lo strato di olio minerale. Il filtro di carta del panino sommerso svilupperà il suo pieno potenziale di imaging in combinazione con l&#39;imaging basata sul laser (compresa la luce fogli microscopio) e gli obiettivi di immersione. Alcune difficoltà con la preparazione del sandwich carta filtro sommerso saranno affrontati nei paragrafi seguenti. Anche se richiede solo una moderata quantità di formazione per trasferire un embrione dal tuorlo nel panino carta da filtro, diversi passaggi possono ancora influenzare significativamente la qualità dell&#39;embrione in coltura. Prima il vettore carta da filtro ècollocato sul tuorlo, la membrana vitellina intorno l&#39;embrione deve essere liberato da ogni albume di spessore. Solo allora il collegamento tra la carta filtro e la membrana vitellina essere sufficientemente robusto da sopportare il lavaggio in PC-salino. La carta da filtro portando l&#39;embrione dovrebbe attraversare l&#39;interfaccia liquido / aria il meno possibile minimizzare la tensione sulle membrane. Una volta portato in PC-salina per il lavaggio, l&#39;intero vettore carta filtro deve rimanere completamente sommerso in ogni momento. Il tempo nel bagno PC-salina deve essere limitata a circa 30 - 60 a sec, come la membrana vitellina inizierà liberando dalla carta da filtro. Ancora, la pulizia della dell&#39;embrione deve essere eseguito in modo molto approfondito, come resti tuorlo saranno poi oscurare la vista dell&#39;embrione. Durante il lavaggio, non puntare mai il flusso dal pipetta di trasferimento direttamente sulla embrione, ma sempre radialmente lontano da esso. Dopo aver rimosso l&#39;embrione dal PC-salina, assicurarsi di tenere la carta da filtro in senso orizzontale per ridurre al minimotensione sulle membrane embrionali. Poi, stabilizzare l&#39;embrione con il secondo vettore carta da filtro. Una volta che il secondo vettore carta da filtro è posto, non creare alcuna tensione laterale, che potrebbe spostare i vettori di carta filtro rispetto all&#39;altra e strappare le membrane embrionali. Quando il sandwich carta da filtro viene portato nel mezzo di coltura, si deve anche attraversare l&#39;interfaccia aria / liquido sola volta per minimizzare la tensione sulle membrane. La seconda coppia di anelli in acciaio inossidabile utilizzati per stabilizzare il panino carta filtro dalla parte superiore deve essere posizionato molto lentamente e senza alcuna pressione per minimizzare la compressione delle membrane embrionali. Piccole rotture del opaca dell&#39;embrione zona di solito guariscono durante la prima ora di cultura, ma un embrione danneggiati possono e devono sempre essere sostituiti da un nuovo campione prima che lo strato olio è pipettati sulla parte superiore del mezzo di coltura. Per l&#39;immagine di un intero embrione o campioni multipli ad alta risoluzione filmati time-lapse, il microfonoROSCOPE deve essere dotato di una motorizzata xy stadi, controllato dal software microscopio. E &#39;di importanza fondamentale avere movimento xy stadi con una velocità minima per evitare danni agli embrioni e turbolenze nel terreno di coltura e l&#39;olio, che diminuirà la qualità dell&#39;immagine. Per l&#39;acquisizione dei filmati time-lapse qui presentati, il motorizzata xy stadi spostato con una velocità di circa 1,75 mm / sec. In futuro, imaging potrebbe essere ulteriormente migliorata prima spostando la fase nella posizione desiderata e l&#39;acquisizione dell&#39;immagine dopo un breve periodo di riposo per lasciare vibrazioni e turbolenze svaniscono. Come limitazione, i potenziali utenti dovrebbero essere consapevoli della distanza relativamente lunga di lavoro (circa 1 cm) necessario per questo metodo cultura, se viene utilizzato un microscopio in posizione verticale, senza obiettivi di immersione. Questa distanza di lavoro risultati dallo strato di supporto e di olio minerale in cima dell&#39;embrione. Nel 6 centimetri piatto Petri, lo strato di olio ha una thickness di circa 1 - 1,5 mm e l&#39;embrione viene immerso circa 4 mm di profondità nel terreno di coltura. A seconda del diametro dell&#39;obiettivo, il bordo superiore del 6 centimetri Petri potrebbe anche limitare l&#39;accesso per l&#39;embrione. Questo potrebbe essere aggirato utilizzando una parabola più grande. La distanza di lavoro dall&#39;alto potrebbe essere leggermente ridotta minimizzando gli spessori degli strati liquidi. Inoltre, la distanza di lavoro dal basso potrebbe essere minimizzata portando l&#39;embrione ulteriormente fino al fondo del piatto Petri e riducendo lo spessore della lastra di vetro del becher riscaldato. Mentre il protocollo è stato ottimizzato per funzionare con una lunga distanza di lavoro zoom microscopio verticale, potrebbe essere montato su un microscopio invertito pure. Gli utenti futuri dovrebbero tenere a mente che sommergendo l&#39;embrione troppo in profondità nel terreno di coltura potrebbe portare a O 2 -Diffusion problemi, anche se esperimenti preliminari suggeriscono che la limitata diffusione non sembra essere un problem, fintanto che l&#39;embrione è circondato da un sufficientemente-grande serbatoio di terreno di coltura e la carta da filtro sandwich non viene premuto al fondo del piatto Petri. Un altro limite è il controllo della temperatura. Regolando la temperatura del regolatore per il becher riscaldato a 40 ° C, la temperatura nel mezzo equilibra a 37,5 ° C circa gli embrioni quando il mezzo è coperto con olio minerale. Questo dimostra che una parte dell&#39;energia viene persa tra il fondo del bicchiere, in cui si trovano gli elementi riscaldanti e il sensore di temperatura, e la posizione degli embrioni. Il controllo della temperatura potrebbe essere ottimizzato spostando il sensore e ridistribuire gli elementi riscaldanti.

Embriogenesi ha affascinato l&#39;uomo fin dall&#39;inizio della storia. Come la struttura e la morfologia di un embrione sviluppano in modo temporale e spaziale come ben definito? L&#39;embrione di pollo è diventato uno dei classici modelli animali vertebrati per embriogenesi per diversi motivi: è facilmente disponibile, poco costoso, trasparente nelle sue fasi iniziali, e accessibile per le manipolazioni sperimentali, come si sviluppa al di fuori della madre. Inoltre, ha una geometria quasi piatta durante i primi eventi morfogenetici, come il cuore e la formazione del cervello, gastrulazione, neurulazione, e somitogenesis 15. processi morfogenetici possono essere compresi meglio se sono studiati in modo dinamico, come ad esempio attraverso l&#39;acquisizione di immagini time-lapse. L&#39;embrione di pollo può essere visualizzato in ovo 16, ma con scarsa accessibilità per le manipolazioni sperimentali e visibilità limitata per l&#39;imaging trasmissione della luce microscopia. Pertanto, severAl tecniche sono state proposte per embrioni di pulcino cultura ex ovo, in tutto sistemi di coltura tuorlo 13,17 - 19 o come le culture espianto 1,20 - 23. Nei sistemi interi coltura tuorlo, l&#39;embrione rimane sopra il tuorlo intatto, e l&#39;intero contenuto del uovo è trasferito in un altro contenitore per incubazione. Questo contenitore può essere un guscio d&#39;uovo surrogata 17, una capsula di Petri 19, o un&#39;amaca fatta di plastica trasparente involucro 13,18. Embrioni di intere culture tuorlo possono idealmente essere coltivato fino alla schiusa e sono accessibili a micromanipolazioni. Queste tecniche sono particolarmente utili per studiare lo sviluppo degli embrioni dopo l&#39;inizio della circolazione sanguigna (che aumenta il contrasto), mentre embrioni giovani rimangono difficile da visualizzare. Questi primi embrioni possono essere esposte meglio se sono asportati dal tuorlo e colto come espianti in vitro. Gli espianti sono facilmente accessibili per esperimentoAl manipolazioni e richiedono meno spazio per la coltura. Per molti anni, una tecnica introdotta da Denis nuovo nel 1955 e le sue variazioni sono state le norme d&#39;oro di metodi di espianto di embrioni di pollo, rendendo in tal modo l&#39;embrione accessibile per time-lapse microscopia e interventi di microchirurgia 20,21. Nonostante il suo grande successo, la tecnica di Nuovo è relativamente impegnativo e richiede tempo. Il blastoderma spesso si stacca quando la membrana vitellina, portando il blastoderma, è teso intorno a un anello di vetro per ottenere la giusta tensione 1. Inoltre, l&#39;embrione può essere coltivato solo con il lato ventrale. La cultura CE (Early Chick), una tecnica più recente sviluppato da Chapman e Collignon 1, aggira l&#39;allungamento della membrana vitellina utilizzando un vettore carta da filtro con una apertura centrale. La carta da filtro si attacca alla membrana vitellina, mantenendo così la sua naturale tensione, e circonda l&#39;embrione come una cornice 1.Gli embrioni vengono poi coltivate su un fondo agar-albume, di solito con il loro lato ventrale. Coltura dorsale verso l&#39;alto sembra possibile solo per gli embrioni a HH8 15 anni e più. Molti gruppi hanno adattato il vettore carta da filtro alle loro esigenze, ad esempio sostituendo il fondo agar-albume con un supporto in fibre suture chirurgiche 24 o un collagene rivestito membrana 25. Spesso, gli embrioni coltivati con la tecnica del nuovo o con la cultura CE sono esposti, con la loro dorsale o superficie ventrale all&#39;aria per facilitare la diffusione di ossigeno 1,20. Queste culture espianto devono essere conservati in atmosfera umidificata per evitare l&#39;evaporazione del mezzo e per impedire l&#39;embrione si secchi. Ciò si ottiene incubando il piatto con l&#39;espianto in formato piatto Petri contenente carta velina inumidita 1. L&#39;acquisizione di immagini time-lapse di questi embrioni richiede o l&#39;uso di un incubatore clima controllato intorno all&#39;intera microscopio o un carattereature controllato contenitore con un coperchio riscaldato per impedire la condensazione nel percorso ottico 14. Tuttavia, embrioni di pollo possono anche sviluppare ex ovo completamente immersi in un terreno di coltura come le culture di carta filtro 25, inserita tra uno strato di olio minerale pesante e albume in adattamenti della tecnica di New 2,21, o come espianti blastoderma piegato a &quot;Cornish Pasty Cultura &quot;23,26, senza contatto diretto con l&#39;aria. Il panino carta da filtro sommerso è una nuova variante della tecnica del filtro portacarta. Combinando la conoscenza in precedenza su coltura di embrioni di pollo ex ovo, rende l&#39;incubatore clima controllato e il coperchio riscaldato superflua. L&#39;embrione è inserito tra due vettori di carta identici (laser-cut) di filtro 24 e colta completamente sommerso in un mezzo semplice cultura (Pannett-Compton salina 27,28 e albume sottili in un rapporto 3: 2) in temperatura controllata contenereER. Uno strato di olio minerale leggero che galleggia sulla parte superiore del mezzo impedisce l&#39;evaporazione 2,21 e riduce al minimo la perdita di calore verso l&#39;ambiente. Il fondo del contenitore ha una finestra di vetro, e l&#39;intera configurazione viene eseguita su una lunga distanza di lavoro zoom microscopio verticale. Questa configurazione permette l&#39;acquisizione di alta risoluzione campo chiaro e campo scuro filmati time-lapse di circa 30 ore di sviluppo embrionale, che vanno dalla prima fase primitiva striscia allo stadio 28-somite (equivalente a Hamburger Hamilton stadi da 5 a 16, HH5-16 ) 15. Gli embrioni possono essere coltivate altrettanto bene con loro ventrale o dorsale verso l&#39;alto. Pertanto, gli embrioni sono accessibili per l&#39;osservazione e la manipolazione di ventrale (ad esempio, il cuore presto 7,8 e somitogenesis 6) e dorsale (per esempio, in ritardo gastrulation 2, neurale chiusura del tubo 3-5, e il cervello precoce 9 - 13) di sviluppo. Il filtro sommerso panino carta provides un ambiente semplice e stabile per microchirurgia, perline impianto, microiniezione, silenziamento genico, e gli studi elettroporazione. Il suo potenziale di imaging può essere spinto molto più in là utilizzando l&#39;imaging basato su laser (tra cui la microscopia ottica fogli) e gli obiettivi di immersione.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q&nbsp; Sistema di depurazione dell'acqua di riferimento</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Duran&nbsp; flaconi da laboratorio, con tappo, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich/Duran</td><td>Z305200-10EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Solution A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183; H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>13152-1KG-D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&#183; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#183; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1063420250</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Whatman carta da filtro qualitativa, grado 595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10311611</td><td></td></tr><tr><td>Macchina da taglio laser MLS-90120-C130, CO2-laser, 130&nbsp; W, lunghezza d'onda 10,6&nbsp; &micro; m</td><td>Micro Lasersystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tork Tessuti facciali extra morbidi</td><td>Tork</td><td>140280</td><td></td></tr><tr><td>Guanti in lattice</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z645613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMDAMED</td><td>EMDA 300.131</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>WITG5.480.003</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet pro Pipetta Controller</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26332</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche in plastica, 25&nbsp; ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251</td><td></td></tr><tr><td>Buste</td><td></td><td></td><td></td>portadocumenti in plastica</tr><tr><td>Incubatrice per uova - Incubatrice mod. Cip Cip 40</td><td>Fiem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uova di gallina fecondate (Gallus gallus)</td><td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Piastre per coltura tissutale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Petri da 6 cm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 ml, provette da centrifuga Greiner o provette Cellstar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td></td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anelli in acciaio inossidabile, su misura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anelli grandi, diametro esterno 30 mm, 4 mm di altezza, 1,5 mm di spessore</td><td></td><td></td><td></td>della parete</tr><tr><td>Anelli piccoli, diametro esterno 20 mm, 4 mm di altezza, 1,5 mm di spessore della parete, 6,5 mm di spazio nell'anello</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbice</td><td></td><td></td><td></td>per unghie</tr><tr><td>Pinze, Dumont #5, Inox</td><td>Fine Science Tools , F.S.T.</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini e affilate per tagliare la carta da filtro</td><td>VWR</td><td>21-102</td><td></td></tr><tr><td>M3516&nbsp; Olio minerale Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Numero CAS&nbsp; 8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Agar bottoms per la cultura EC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&nbsp; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Impianto di microsfere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Sampler Kit III (45 &; sono state utilizzate perline m)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16905-1</td><td></td></tr><tr><td>Aghi per agopuntura: tipo J, n. 02, 0,12x30 mm</td><td>SEIRIN&</td><td>nbsp; tipo J, n. 02, 0,12x30 mm</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Bicchiere a temperatura controllata</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sensore di temperatura RTD con custodia filettata M4 RTD-850M</td><td>Omega</td><td>RTD-850M</td><td></td></tr><tr><td>RTD sigillato ermeticamente Sensori HSRTD-3-100-A-3M</td><td>Omega</td><td>HSRTD-3-100-A-1M</td><td></td></tr><tr><td>Termistore e cavo di prolunga RTD EXTT-3CU-26S-50</td><td></td> Omega <td>EXTT-3CU-26S-50</td><td></td></tr><tr><td>Mini connettori a 3 pin per termocoppie, RTD a 3 fili e termistori MTP-U-M</td><td>Omega</td><td>MTP-U-M</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatori flessibili isolati Kapton (film di poliimmide) KHLV-103/(10)-P</td><td>Omega</td><td>KHLV-103/(10)-P</td><td></td></tr><tr><td>Controllore di temperatura/processo CNi16D24-C4EIT-DC</td><td>Omega</td><td>CNi16D24-C4EIT-DC</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere in alluminio su misura, isolato con poliacetale (disegni vedi scheda 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Configurazione del microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 con ApoTome.2</td><td>ZEN Carl Zeiss AG</td><td>495010-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Piano obiettivoNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56&nbsp; mm</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435281-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Comando rotativo manuale MARC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435604-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminazione top 450 mot</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435500-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Stadio di misura motorizzato S 150x100 mot; CAN (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di inserimento S, vetro 237x157x3&nbsp; mm (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9053-000</td><td></td></tr><tr><td>Controller EMS 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435610-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Pannello di controllo del sistema SYCOP 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435611-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 fotocamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Stazione di lavoro di fascia alta Xeon Quad-Core multilingue</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>490004-0025-000</td><td></td></tr><tr><td>Pacchetto Lingua Windows 7 x64 Ultimate Inglese US</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410373-0200-000</td><td></td></tr><tr><td>Monitor LCD TFT HP ZR2440w 24"</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410350-2403-000</td><td>non più disponibile</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012 Chiave di licenza hardware</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1002-120</td><td>non più disponibile</td></tr><tr><td>ZEN Software Driver Hamamatsu Fotocamere Chiave di licenza hardware</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1045-110</td><td></td></tr><tr><td>Modulo ZEN Stack Z Carl</td><td>Zeiss AG</td><td>410136-0030-110</td><td></td></tr><tr><td>Modulo ZEN Piastrelle/ Posizioni</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1025-110</td><td></td></tr><tr><td>Modulo ZEN Time Lapse</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1031-110</td><td></td></tr><tr><td>Progettista di esperimenti del modulo ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1022-110</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Desk 2012 Chiave di licenza hardware</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1004-120</td><td>non più disponibile</td></tr></tbody></table>

un sommerso sandwich carta da filtro per il lungo termine ex ovo time-lapse imaging di chick primi embrioni

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Grazie alla sua disponibilità, a basso costo, la geometria piana, e la trasparenza, l&#39;ex ovo embrione di pollo è diventata un importante modello animale vertebrato per lo studio di eventi morfogenetici, come gastrulation 2, neurulazione 3-5, somitogenesis 6, cuore piegatura 7, 8, e il cervello la formazione di 9 - 13, durante l&#39;embriogenesi precoce. Chiave di lettura dei processi morfogenetici è quello di seguirli in modo dinamico da time-lapse imaging. L&#39;acquisizione di filmati time-lapse di pulcino embriogenesi ex ovo è stato limitato sia per finestre di tempo breve o la necessità di un incubatore per controllare la temperatura e l&#39;umidità attorno all&#39;embrione 14. Qui, vi presentiamo una nuova tecnica per la cultura pulcino embrioni ex ovo per alta risoluzione time-lapse imaging mediante microscopia a luce trasmessa. Il panino carta da filtro sommerso è una variante del filtro portacarta techn consolidataique (CE-coltura) 1 e consente la coltura di embrioni di pollo, senza la necessità di una camera climatica. L&#39;embrione è inserito tra due vettori di carta filtro identici e viene mantenuta completamente sommerso in un semplice mezzo, a temperatura controllata coperto da uno strato di olio minerale leggero. A partire dalla fase primitiva striscia (Hamburger-Hamilton fase 5, HH5) 15 fino ad almeno la fase 28-somite (HH16) 15, gli embrioni possono essere coltivate sia con la loro ventrale o dorsale verso l&#39;alto. Questo permette l&#39;acquisizione di filmati time-lapse che coprono circa il 30 hr di sviluppo embrionale. Rappresentante frame time-lapse e film sono mostrati. Gli embrioni vengono confrontati morfologicamente ad un embrione coltivato nella CE-cultura standard. Il panino carta da filtro sommerso fornisce un ambiente stabile per studiare dorsale presto e processi morfogenetici ventrali. Essa consente anche di imaging di fluorescenza dal vivo e micromanipolazioni, come la microchirurgia, imp tallonelantation, microiniezione, silenziamento genico, ed elettroporazione, e ha un forte potenziale per essere combinati con obiettivi a immersione per l&#39;imaging basato su laser (compresa la luce fogli microscopio).

<img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig2.jpg"> Figura 2: Confronto morfologica tra embrioni in Culture CE 1 e sommersi carta da filtro Cultura Sandwich. frame time-lapse selezionati mostrano gli embrioni a intervalli di 3 ore. Le pagine sono ridimensionate per dare una visione d'insieme completa della morfologia degli embrioni. Gli embrioni sono stati pari età alla fase 7-somite (HH9) 15. 0 hr indica l'inizio di ogni esperimento. Anteriore è sempre a sinistra. Le immagini sono state acquisite con illuminazione campo scuro. (A) degli embrioni nella cultura CE 1, colta lato ventrale su un agar-albumina inferiori a 1,33. Immagini di alta qualità possono essere acquisiti, come l'embrione è confinata nella direzione z. (B e C) Due embrioni coltivati nel panino carta da filtro sommerso: (B) lato ventrale e (C) dorsale verso l'alto.Embrioni in sandwich carta da filtro sviluppano senza differenze qualitative per almeno 27 ore. Essi sviluppano la circolazione del sangue e funzionale flessione cranico e cervicale e girano con successo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> acquisizione time-lapse dipende dal sistema del microscopio a disposizione. In questo studio, la distanza di lavoro, è stato utilizzato in posizione verticale microscopio zoom. Il fattore di zoom è stato fissato a 5 volte. In combinazione con l'ingrandimento 16X dell'oculare, ciò ha comportato 80X ingrandimento totale, con una risoluzione teorica di 1,3 micron / pixel (come indicato nel software del microscopio) 30. Per aumentare il campo di vista, gli embrioni sono stati ripresi come panorami orizzontali di cinque sotto-immagini (piastrelle). Pertanto, una regione tegola, costituito da cinque piastrelle sovrapposte, è stato definito 29. Questa regione piastrelleè stato posizionato in modo da coprire completamente l'apertura ellittica del vettore carta filtro nella sua estensione orizzontale (Figura 2B - 0 hr). Ogni piastrella aveva una dimensione di 2.048 x 2.048 pixel, che coprono un campo di vista-di circa 2,7 mm e piastrelle sono state acquisite con una sovrapposizione del 10%, con conseguente totale campo di vista di circa 12 mm x 2.7 mm il panorama. Il motorizzata xy stadi spostato rispetto all'obiettivo con una velocità di circa 1,75 mm / sec tra acquisizione delle piastrelle separati 29. L'immagine dal vivo è stata incentrata sulla mesoderma presomitic anteriore e le somiti più recente formazione (il centro di ricerca del nostro gruppo). Per compensare l'ispessimento e curling degli embrioni nella direzione z, piccolo Z-stack (da cinque a sette piani diversi, con una distanza di 30 micron) sono stati acquisiti in ogni punto di tempo di 30. Questi sono stati scelti intorno al piano focale della punta anteriore del mesoderma presomitic. La durata del ACQ time-lapseuisition è stato fissato a 50 ore, e gli intervalli di imaging di 3, 4, o 10 minuti sono stati scelti 31. La qualità della acquisizione time-lapse potrebbe essere migliorato rifocalizzazione ogni 5 - 10 ore e ridefinendo lo z-stack intorno al nuovo piano focale ottimale. Alla fine dell'esperimento, per tutto il tempo della serie è stato modificato manualmente, e sottoinsiemi di immagini contenenti il piano z con la migliore messa a fuoco sono stati creati e salvati in una cartella separata 32. Questi sottoinsiemi di immagini erano tempo-cucito per creare un time-serie completa di immagini con messa a fuoco ottimale. Le piastrelle di ogni immagine di questo completo serie temporali sono stati cuciti e fusi insieme senza correzione ombreggiatura 30, e le cornici time-lapse sono stati esportati in formato JPEG-immagini di 100% le dimensioni e il 95% di compressione 32. I telai time-lapse sono stati importati come una sequenza di immagini in software di video-editing professionale. Le dettagliate 100% zoom sono stati stabilizzati, e il contrasto complessivo è stato adeguato al nostro gradimento. I termini decade finali sono stati codificared con il codec H.264 ed esportati in formato MPEG-4 contenitori. I filmati vengono visualizzati in un frame rate di 15 fotogrammi / sec (fps) e una risoluzione di 1.920 x 1.080 pixel. La figura 2 mostra un confronto tra un embrione in EC cultura 1 (Figura 2A) e due embrioni nel filtro coltura panino carta sommersa, uno in coltura lato ventrale (Figura 2B) e l'altro lato uno dorsale (Figura 2C). Tutti gli embrioni sono stati pari età di sette fase somite (HH9) 15 e ripreso con una risoluzione temporale di 4 min (Figura 2A e B) o 10 minuti (Figura 2C). fotogrammi selezionati su intervalli di 3 ore sono raffigurati. La cultura CE (Figura 2A) ha permesso di imaging molto stabile dovuto all'embrione che poggia su una stalla agar-albumina inferiori a 1,33. L'intero embrione rimasto in un piano focale tutta tha tutto il time-lapse. Questo potrebbe essere utile per esperimenti brevi (alcune ore) e molto embrioni precoci, ma si tratta di un forte confinamento dell'embrione nella direzione z, possibilmente ostacolando suo successo sviluppo tridimensionale a lungo termine. In principio, il confinamento unico risultato un leggero appiattimento laterale della testa dell'embrione rispetto ad un embrione coltivate in sandwich di carta da filtro sommerso con il lato ventrale (confronta Figura 2A e 2B a 0 ore). Più tardi, la rotazione della testa è stata compromessa (Figura 2A - 21 ore) e il battito cardiaco rallentato. La circolazione del sangue quasi fermato. Vedere supplementare Film 1 per il completo time-lapse dell'embrione nella cultura CE. Il pannello superiore in questo film mostra una panoramica completa di un embrione, mentre il pannello in basso a sinistra visualizza lo sviluppo cuore in piena risoluzione. La segmentazione del mesoderma presomitic in somiti può essere seit in dettaglio in basso a destra. Embrioni in sandwich carta filtro sommerso, d'altro canto, sono stati limitati nella loro espansione tridimensionale solo dalla tensione naturale delle membrane che li circondano. Potrebbero essere coltivato sia con loro ventrale (Figura 2B) o lato dorsale (Figura 2C). In entrambi i casi, gli embrioni hanno mostrato somitogenesis continuo, e le loro teste si voltò. Hanno sviluppato flessione del cranio e del collo dell'utero e la circolazione sanguigna funzionale. Entrambi gli embrioni nel panino carta da filtro sono stati ripresi con l'attenzione per il mesoderma segmentazione, in modo che le parti della testa gradualmente spostato fuori fuoco, come gli embrioni sono cresciuti, ispessite, e ha iniziato a girare, mentre la parte segmentazione del mesoderma è rimasto a fuoco (confrontare Figura 2B e 2C a 21 ore a 27 ore). Supplemental Movie 2 mostra la completa filmato time-lapse dell'embrione raffiguratoin Figura 2B. L'intervallo di imaging è stato di 4 min. Il pannello superiore di questo film mostra una panoramica completa di un embrione. Lo sviluppo dell'embrione è stato ripreso consecutivamente oltre 46 ore, ma dopo circa 30 ore, l'attenzione per il mesoderma segmentazione si è perso a causa l'ispessimento generale e tornitura del tessuto embrionale. Il pannello in basso a sinistra mostra lo sviluppo precoce del cuore in piena risoluzione dai telai time-lapse acquisite. Attraverso fusione del primordia cardiaca accoppiato su entrambi i lati della linea mediana, una struttura tubolare quasi retta è formata, che poi inizia a battere e piegando verso destra. Il pannello in basso a destra mostra il maggior numero di somiti di recente formazione e la punta anteriore del mesoderma presomitic in piena risoluzione e tiene traccia la formazione di nuovi somiti nel corso del tempo. Film supplementare 3 mostra un altro embrione colto e ripreso lato ventrale in panino carta da filtro sommerso. L'intervallo di imaging è stato di 4 min. Il film copre °e sviluppo dell'embrione dal palco HH5-6 a circa scena HH14 15, su circa 27 ore di tempo della cultura. La testa piega forme e progredisce posteriormente. Le forme di cuore dalla sua primordi bilaterale, inizia a battere, e si piega a destra. I primi tre o quattro somiti formano contemporaneamente. somiti Ulteriori germogliano fuori in sequenza dalla punta anteriore del mesoderma presomitic. Il pannello inferiore mostra la regione della testa di un embrione a piena risoluzione, permettendo l'osservazione della piega la testa e la formazione cardiaca precoce in alto dettaglio. Grazie alla trasparenza dell'embrione, la chiusura del tubo neurale può essere osservato nella regione della testa futuro. Supplemental Movie 4 display formazione somite nello stesso embrione in piena risoluzione nel tempo pieno di imaging nel pannello inferiore. Supplemental Movie 5 mostra la completa time-lapse dell'embrione colta dorsale verso l'alto (Figura 2C). L'intervallo di imaging era di 10 min. Mentre la UPPer pannello mostra lo sviluppo dell'embrione dai sette fase somite (HH9) a circa fase HH16-17, il pannello inferiore è ritagliata per visualizzare i cambiamenti morfologici nei primi anni del cervello, in quella fase in piena risoluzione. Il gonfiore locale del tubo neurale può essere osservato, che porta alla regionalizzazione del prosencefalo, mesencefalo e rombencefalo, che si dividono in cinque sub-regioni del cervello embrionale in fasi successive 13. Inoltre, la crescita delle vescicole ottiche può essere visto chiaramente. Dopo circa 30 ore di cultura, l'embrione sta morendo. Per mostrare la compatibilità del sandwich carta filtro sommerso con manipolazioni microchirurgia, diverse microsfere di polistirene (~ 40 micron in diametro) sono stati impiantati nel o in prossimità del mesoderma presomitic di un embrione di pollo nel filtro sommerso coltura panino carta. Le microsfere sono state lavate in PBS per rimuovere tampone di conservazione e implanted prima copertura del terreno di coltura con lo strato di olio minerale leggero (confronta al punto 2.18 della sezione protocollo). Un bicchiere pipetta Pasteur è stato usato per trasferire le perline alla superficie dell'embrione, sotto osservazione attraverso gli oculari del microscopio. Cinque fori sono stati creati nel endoderma raschiando delicatamente con un ago di agopuntura. Uno strumento a forma di J su misura, creato da stretching e piegando un bicchiere pipetta Pasteur in una fiamma, è stato utilizzato per manipolare le perline e spingere con attenzione nei fori fino a diventare immobile. Tre fori sono stati riempiti con una perla ciascuno (Figura 3A - 0 hr e 3B *) e due fori con due perle di ciascuno (Figura 3a - 0 ore). Figura 3A mostra, in frame time-lapse selezionati, lo sviluppo dell'embrione pulcino dopo l'impianto microchirurgica delle perline. Tre perle sono stati inseriti con successo nel tessuto nella posizione desiderata, e il loro movimento è stato ripreso ilcorso dell'esperimento in dettaglio alto (Figura 3B). Lo sviluppo dell'embrione non sembrava essere compromessa dalla manipolazione o la presenza delle perline. Vedere supplementare film 6 per l'intero filmato time-lapse. L'intervallo di imaging è stato di 4 min. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig3.jpg"> Figura 3: Time-lapse imaging dopo microperla impianto. La prova di principio esperimento mostra la compatibilità del sandwich carta filtro sommerso con microsfere impianto. La testa dell'embrione è a sinistra, ma non è stato ripreso in questo esperimento. Le immagini sono state acquisite con illuminazione campo scuro. (A) selezionato temporizzata fotogrammi che mostra l'embrione manipolato ad intervalli di 3 ore dopo l'impianto di sette microsfere (~ 40 micron in diametro). L'embrione allungata e continuamente formata ulteriore somites. Tre perle sembrano essere stati correttamente collegato e spostato medialmente con il flusso dei tessuti oltre 18 ore di cultura. Gli altri quattro perle spuntato fuori dalle loro tane tra 6 e 9 ore di cultura e alla deriva posteriormente. (B) Vista dettagliata delle tre singole perle (da B1 a B3) impiantato nel mesoderma presomitic all'inizio dell'esperimento (0 HR, B *) e dopo 12 ore di incubazione (B **). Il numero dei somiti appena formatura viene indicata (S9 in B * e S18 in B **). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="film 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie1.jpg"> Supplementare Film 1: EC-cultura Ventrale Side Up. Embryo nella cultura CE 1, colta lato ventrale, dalla fase di sette somite (HH9) 15 in poi su un Botto agar-albumem 1,33. L'intervallo di imaging è stato di 4 min. Il tempo relativo viene visualizzato nell'angolo in alto a sinistra. Immagini di alta qualità possono essere acquisiti, come l'embrione era confinato nella direzione z. Dopo 21 ore, il battito cardiaco e il flusso di sangue sono stati quasi arrestati e l'embrione avevano cominciato a disintegrarsi. Il pannello superiore mostra una panoramica ridimensionata dell'embrione, mentre i pannelli inferiori visualizzare sviluppo del cuore (pannello di sinistra) e la segmentazione del mesoderma presomitic (pannello di destra) a piena risoluzione (100% di zoom). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_1_EC_culture-Ventral_up.mp4" target="_blank">(Tasto destro del mouse per scaricare).</a> <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie2.jpg"> Film supplementare 2: filtro sommerso Sandwich carta Ventrale Side Up. Embrione coltivate nel panino carta sommerso dalla fase sette somite (HH9) 15 in poi, sid ventralee rivolto verso l'alto. L'intervallo di imaging è stato di 4 min. Il tempo relativo viene visualizzato nell'angolo in alto a sinistra in ore e minuti, il riavvio dopo 24 ore. Il pannello superiore mostra una panoramica ridimensionata dello sviluppo dell'embrione oltre 46 ore, consecutivamente. Il pannello in basso a sinistra visualizza sviluppo cardiaca precoce durante la prima 10 ore di acquisizione di immagini a piena risoluzione (100% di zoom). Il pannello in basso a destra raffigura la segmentazione mesoderma in circa 30 ore di sviluppo a piena risoluzione (100% di zoom) fino a quando messa a fuoco è perso a causa di un ispessimento generale e tornitura del tessuto embrionale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_2_Sandwich-Ventral_up.mp4" target="_blank">(Tasto destro del mouse per scaricare).</a> <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie3.jpg"> Film supplementare 3: capo Fold Formazione. Embrione colta lato ventrale in panino carta da filtro sommerso dal luiad-processo / stage testa volte (HH5-6) 15 a circa lo stadio 22-somite (HH14) 15 su circa 27 ore di tempo della cultura. L'intervallo di imaging è stato di 4 min. Il tempo relativo viene visualizzato nell'angolo in alto a sinistra in ore e minuti, il riavvio dopo 24 ore. Il pannello superiore mostra una panoramica ridimensionata dello sviluppo dell'embrione. Il pannello inferiore raffigura la regione della testa di un embrione a piena risoluzione (100% di zoom). La formazione della piega la testa e il cuore precoce e la chiusura del tubo neurale può essere osservato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_3_Sandwich-Ventral_up-Head.mp4" target="_blank">(Tasto destro del mouse per scaricare).</a> <img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie4.jpg"> Film supplementare 4: Somitogenesis. Embrione colta lato ventrale in panino carta da filtro sommerso dal / testa-fold fase head-processo (HH5-6) 15a circa lo stadio 22-somite (HH14) 15 su circa 27 ore di tempo della cultura. L'intervallo di imaging è stato di 4 min. Il tempo relativo viene visualizzato nell'angolo in alto a sinistra in ore e minuti, il riavvio dopo 24 ore. Il pannello superiore mostra una panoramica ridimensionata dello sviluppo dell'embrione. Il pannello inferiore raffigura la segmentazione mesoderma parassiale a piena risoluzione (100% di zoom). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_4_Sandwich-Ventral_up-Somitogenesis.mp4" target="_blank">(Tasto destro del mouse per scaricare).</a> <img alt="Movie 5" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie5.jpg"> Film supplementare 5: filtro sommerso Sandwich carta dorsale Side Up. Embrione lato colta dorsale fino nel panino carta da filtro sommerso dai sette fase somite (HH9) 15 a circa il palcoscenico HH16-17 15. L'intervallo di imaging era di 10 min. Viene visualizzato il tempo relativonell'angolo in alto a sinistra in ore e minuti, il riavvio dopo 24 ore. Il pannello superiore mostra una panoramica ridimensionata dello sviluppo dell'embrione. Il pannello inferiore raffigura cambiamenti morfologici nel cervello presto piena risoluzione (100% di zoom). L'embrione è morto dopo circa 30 ore di cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_5_Sandwich-Dorsal_up-Head.mp4" target="_blank">(Tasto destro del mouse per scaricare).</a> <img alt="film 6" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie6.jpg"> Film supplementare 6: microperle impiantato. Embryo colta lato ventrale in panino carta filtro sommerso per circa 19 ore, a partire dalla fase somite nove (HH9-10) 15. L'intervallo di imaging è stato di 4 min. Il tempo relativo viene visualizzato nell'angolo in alto a sinistra in ore e minuti. Il pannello superiore mostra una panoramica ridimensionata della regione coda con sette microsfere impiantate nel prmesoderma esomitic. Il pannello inferiore mostra la regione con microsfere impiantati a piena risoluzione (100% di zoom). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_6_Sandwich-Ventral_up-Microbeads.mp4" target="_blank">(Tasto destro del mouse per scaricare).</a>

Qui, presentiamo una nuova tecnica per coltivare embrioni di pollo ex ovo per l'imaging time-lapse utilizzando la luce trasmessa e la microscopia a fluorescenza. Il sandwich di carta da filtro sommerso è una variante della consolidata tecnica di supporto della carta da filtro1 che consente la coltura di embrioni di pollo completamente immersi in un terreno di coltura liquido.

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