Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine Ex Ovo Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di coltivare embrioni di pollo ex ovo per l'imaging time-lapse mantenendoli completamente immersi in un terreno di coltura liquido. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in uno studio degli eventi morfogenetici durante l'embriogenesi precoce, come la neurulazione, la gastrulazione, la somitogenesi, la formazione del cuore e del cervello. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non c'è bisogno di una camera climatica attorno al microscopio.

Uno strato di olio minerale leggero impedisce l'evaporazione dal terreno di coltura. Per iniziare, prepara 50 millilitri di terreno di coltura combinando 30 millilitri di soluzione salina Pannett-Compton appena preparata con 20 millilitri di albume sottile. Mescolare delicatamente i componenti capovolgendo più volte il tubo.

Quindi, posizionare due piccoli anelli di acciaio inossidabile il più distanti possibile in una fresca capsula di Petri di plastica da sei centimetri e utilizzare una pipetta di plastica da 25 millilitri per riempirla con 22 millilitri di terreno di coltura. Assicurarsi che i detriti accumulati sopra il fluido rimangano nella provetta da centrifuga. Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per rimuovere eventuali detriti o bolle dal mezzo nella capsula di Petri.

Quindi, riempi una piastra di Petri da 10 centimetri con 75 millilitri di soluzione salina Pannett-Compton da utilizzare in una fase successiva. Dopo il tempo di incubazione desiderato, togliete un uovo dall'incubatrice e lasciatelo riposare sul banco su un lato per un minuto in modo che l'embrione arrivi in cima al tuorlo. Quindi, rompi con cura l'uovo in una capsula di Petri e immergi il bordo di un pezzo di carta velina fine nell'albume denso.

Utilizzare la carta velina per centrare il blastoderma tirandolo in posizione. Quindi, tagliare la punta di una pipetta di trasferimento e usarla per rimuovere la maggior parte dell'albume sottile e denso dalla capsula di Petri. Con la maggior parte dell'albume denso rimosso, usa un pezzo di carta velina per rimuovere delicatamente l'albume denso rimanente intorno all'embrione per creare una finestra.

Fare attenzione che la carta velina non si attacchi alla membrana vitellina. Utilizzando una pinzetta, posizionare con cautela un supporto di carta da filtro sulla membrana vitellina attorno all'embrione in modo che l'asse più lungo dell'apertura ellittica sia parallelo all'asse antero-posteriore dell'embrione. Quindi, pizzica una punta delle forbicine per unghie attraverso la membrana vitellina vicino al supporto della carta da filtro e taglia rapidamente l'intero supporto della carta da filtro.

Usando una pinzetta, sollevare il supporto di carta da filtro dal tuorlo in una direzione obliqua parallela all'asse antero-posteriore dell'embrione, quindi girare il supporto di carta da filtro in modo da avere il lato ventrale dell'embrione sopra e immergerlo nella soluzione salina Pannett-Compton. Immergere il supporto di carta da filtro lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione in direzione obliqua. Quindi, sbarazzati di tutto il tuorlo che è ancora attaccato sia alla membrana vitellina che al blastoderma sciacquandolo delicatamente con soluzione salina Pannett-Compton da una pipetta di trasferimento di plastica.

Lavora rapidamente per ridurre al minimo il tempo che l'embrione trascorre in un bagno salino. Puntare sempre il flusso salino lontano dall'embrione e non spruzzare mai direttamente su di esso. Rimuovere il supporto di carta da filtro dalla soluzione salina Pannett-Compton lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione in direzione obliqua ed eliminare il liquido in eccesso tamponando il bordo del supporto di carta da filtro su un fazzoletto di carta.

Tieni la carta da filtro orizzontalmente e, con il lato ventrale dell'embrione rivolto verso l'alto, usa un secondo paio di pinzette per posizionare un secondo supporto di carta da filtro sopra il primo in modo che le loro aperture si allineino esattamente, inserendo l'embrione tra di loro. Immergere immediatamente il sandwich di supporto in carta da filtro nel terreno di coltura in direzione obliqua lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione. Posizionalo nell'area che copre lo spazio tra i due anelli d'acciaio.

Successivamente, fissa il sandwich di carta da filtro in posizione posizionando altri due anelli di acciaio sopra gli altri due, assicurandoti che l'apertura con l'embrione rimanga completamente scoperta. Controllare il livello del fluido e assicurarsi che il distanziatore superiore sia appena immerso nel fluido. Se necessario, aggiungere o rimuovere piccole quantità di terreno.

La coltura è ora pronta per essere inserita nella configurazione di imaging. Posizionare con cura la capsula di Petri al centro del bagno d'olio a temperatura controllata e stabilizzare la capsula lateralmente posizionando tre grandi anelli di acciaio inossidabile accanto alla capsula nell'olio. Assicurati che gli anelli d'acciaio tocchino i lati del piatto.

Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per aggiungere lentamente circa sei millilitri di olio minerale leggero sopra il terreno in modo che il terreno sia coperto da uno strato continuo di olio minerale. Questo video mostra un time-lapse completo di un embrione nella consolidata coltura di carta da filtro chiamata coltura EC, coltivato con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Questo embrione inizia allo stadio di sette somiti e viene ripreso con una risoluzione temporale di quattro minuti.

Il successivo sviluppo dell'embrione è ostacolato da un forte confinamento in direzione z. A differenza della coltura EC, gli embrioni coltivati nel sandwich di carta da filtro sommersa non sono limitati nella loro espansione tridimensionale. Sviluppano una corretta flessione cranica e cervicale e una circolazione sanguigna funzionale.

Lo sviluppo dell'embrione è stato ripreso consecutivamente per 46 ore, ma dopo circa 30 ore, l'attenzione sul mesoderma segmentato si è persa a causa dell'ispessimento e della rotazione complessivi del tessuto embrionale. Questo embrione viene coltivato con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Il pannello inferiore mostra il rigonfiamento locale del tubo neurale, che porta alla regionalizzazione del proencefalo, del mesencefalo e del rombencefalo, che si dividerà nelle cinque sottoregioni del cervello embrionale nelle fasi successive.

L'embrione muore allo stadio 28 somite, noto anche come stadio 16 di Hamburger Hamilton. Una volta padroneggiato, ci vogliono circa 10-15 minuti per portare un embrione nel sandwich di carta da filtro sommerso. Prima di applicare l'olio minerale sulla superficie del terreno di coltura, l'embrione è ancora accessibile alle micromanipolazioni, come la microchirurgia o l'impianto di perline.

In combinazione con gli obiettivi emergenti, il sandwich di carta da filtro sommerso sarà molto utile per l'imaging a fluorescenza a luce laser, compresa la microscopia a foglio di luce.