Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

interazioni proteina sono al centro della funzione di una cellula. tecniche calorimetriche e spettroscopiche sono comunemente usati per caratterizzare loro. Qui si descrive anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare l'interazione tra la proteina mutata nella sindrome di Shwachman-Diamond (SBDS) e il fattore di allungamento-simile 1 GTPase (EFL1).

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di valutare e quantificare l'interazione tra due proteine di interesse utilizzando l'anisotropia di fluorescenza. Queste misure possono aiutare a rispondere a domande chiave. Il campo della biochimica e della biofisica delle proteine, come le proteine le cui interazioni sono importanti per la funzione cellulare.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo ottenere informazioni quantitative e qualitative sull'interazione proteina-proteina. Per preparare la proteina SBDS-FlAsH purificata, preparare prima un litro di terreno liquido LB integrato con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. E in esso, la coltura ha trasformato i batteri a 37 gradi Celsius fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge da 0,5 a 0,7.

Indurre l'espressione della proteina SBDS-FlAsH aggiungendo 0,5 millimolari di IPTG alla coltura e continuare l'incubazione per altre cinque ore. Successivamente, raccogliere la sospensione batterica mediante centrifugazione a 3800 volte G per dieci minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante.

Risospendere le cellule in 35 millilitri di burro di lisi SBDS integrato con un millimolare PMSF. Lisi mediante sonicazione per un tempo totale di quattro minuti utilizzando cicli di dieci secondi di accensione e 30 secondi di spegnimento a quattro gradi Celsius. Quindi, centrifugare il campione a 9.000 volte G per 50 minuti a quattro gradi Celsius.

Conservare il surnatante e gettare la tavolozza per rimuovere i detriti cellulari. Dopo aver bilanciato la colonna di affinità al nichel con tre volumi di tampone di lisi SBDS, introdurre l'intero surnatante chiarificato sulla colonna. Rimuovere la proteina non legata lavandola con tre volumi di colonna di tampone di lisi SBDS.

Dopo il lavaggio della colonna, eluire la proteina legata con tre volumi di tampone di eluizione SBDS. Per purificare ulteriormente la proteina, equilibrare la colonna dello scambiatore cationico sulfopropilico con tre volumi di colonna tampone a basso contenuto di sale. Diluire la proteina sei volte con 50 millimolare di tampone fosfato PH 6,5 e introdurla nella colonna.

Lavare il materiale non legato con tre volumi di colonna tampone per colonne S a basso contenuto di sale. Quindi, eluire la proteina in un solo passaggio aggiungendo 50 millimolari di tampone fosfato PH 6,5, un molare di cloruro di sodio sulla colonna. Diluire l'eluato tre volte con tampone fosfato 50 millimolare PH 6,5.

Quindi, concentrare la proteina con dispositivi di ultrafiltrazione mediante centrifugazione a 3800 volte G per quindici minuti. La qualità delle proteine utilizzate in questo tipo di esperimento è molto potente. L'interpretazione dei dati diventa complicata se i campioni proteici utilizzati non sono di elevata purezza.

Verificare la purezza della proteina SBDS-FlAsH mediante analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie. Congelare la proteina in azoto liquido e conservarla a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Per preparare la proteina EFL1 purificata, la prima coltura ha trasformato il lievito a 30 gradi Celsius in un litro di terreno sintetico drop-out senza uracile, integrato con lo 0,5% di glucosio fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 1,8.

Indurre l'espressione proteica aggiungendo il 2,8% di galattosio alla coltura e continuare l'incubazione per 18 ore a 30 gradi Celsius. Raccogliere la sospensione di lievito mediante centrifugazione a 3800 volte G per dieci minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione.

Risospendere le cellule in 50 millilitri di tampone di lisi EFL1 integrato con un millimolare di PMSF e un millimolare di benzammidina. Rompere le celle per attrito su un battitore di perline utilizzando perle di vetro per un tempo totale di sei minuti utilizzando cicli di due minuti di accensione e quindici minuti di spegnimento a quattro gradi Celsius. Quindi, centrifugare il campione a 9.000 volte G per 50 minuti a quattro gradi Celsius.

Conservare il surnatante e scartare il palato per rimuovere i detriti cellulari. Quindi, equilibrare la colonna di affinità al nichel con tre volumi di colonna di tampone di lisi EFL1. Introdurre tutto il surnatante chiarificato sulla colonna bilanciata.

Dopo aver rimosso la proteina non legata lavando la colonna con tre volumi di colonna di tampone di lisi EFL1, eluire la proteina legata con tre volumi di colonna di tampone di eluizione EFL1. Per purificare ulteriormente la proteina EFL1, equilibrare la colonna di esclusione dimensionale con 1,5 volumi di colonna di tampone anisotropia. Concentrare la proteina EFL1 eletta dalla colonna di affinità del nichel a un millilitro con dispositivi di ultrafiltrazione mediante centrifugazione a 3800 volte G.Quindi, introdurre il campione concentrato sulla colonna di esclusione dimensionale.

Raccogliere la proteina elusa e concentrarla mediante ultrafiltrazione fino a una concentrazione finale di circa 30 micromolari. Verificare la purezza della proteina EFL1 mediante analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie. Congelare le proteine in azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.

Mescolare tre nanomoli della proteina SBDS-FlAsH con tre nanomoli del colorante verde lumio in un volume di cinque micrometri di tampone anisotropia. Lasciare che la reazione proceda per otto ore a quattro gradi Celsius. Dopo otto ore, dializzare il campione contro il tampone di anisotropia durante la notte per rimuovere il colorante libero.

Misurare gli assorbenti a 280 nanometri e 508 nanometri in uno spettrofotometro utilizzando una cuvetta di quarzo. Quindi, utilizzare la legge di Lambert-Beer per quantificare la percentuale di proteine marcate come descritto nel protocollo di testo. Prima di misurare il valore di anisotrofia, ogni fase di filtrazione dalla legione proteica deve essere eseguita con attenzione, assicurandosi che l'intero campione venga erogato nella soluzione e diventi omogeneo.

In una cuvetta a fluorescenza, mettere 200 microlitri di SBDS-FlAsH 30 nanomolari in tampone anisotrofia e titolare due microlitri di EFL1 30 micromolare. Mescolare accuratamente e lasciare riposare la reazione per tre minuti prima di misurare il valore di anisotrofia e fluorescenza. Ripetere questo processo fino a quando non è stato aggiunto un volume totale di 40 microlitri di EFL1.

Come passaggio finale, adattare i dati a un modello di associazione presunto come descritto nel protocollo di testo. Per eseguire qualsiasi esperimento di anisotrofia è importante escludere grandi cambiamenti nell'intensità della fluorescenza. Come mostrato qui, la fluorescenza di SBDS-FlAsH non cambia in modo evidente dopo il legame con EFL1.

La titolazione di EFL1 in una cuvetta di quarzo contenente SBDS-FlAsH determina un aumento dell'anisotrofia iniziale osservata. Diverse aggiunte di EFL1 descrivono la corrispondente curva di legame che può essere adattata utilizzando la regressione dei minimi quadrati non lineare a un presunto modello di legame. In questo caso, un modello di sito di legame non descrive in modo appropriato i dati sperimentali.

Invece, un modello di due siti di legame non identici descrive in modo appropriato i dati sperimentali. Una volta padroneggiato, l'esperimento di legame dell'anisotrofia a fluorescenza può essere eseguito in tre ore se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante disporre di proteine purificate in grandi quantità.

Parallelamente a questa procedura, altri metodi come questo possono essere eseguiti con saggi di complementazione basati su frammenti o anisotrofia di fluorescenza con diversi domini della proteina studiata al fine di supportare il modello di legame appropriato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento di legame seguito da anisotrofia a fluorescenza.