Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare e quantificare l'interazione tra due proteine di interesse utilizzando l'anisotropia di fluorescenza. Queste misure possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biochimica e della biofisica delle proteine, come ad esempio quali interazioni proteiche siano importanti per la funzione cellulare.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che possiamo ottenere informazioni quantitative e qualitative sull'interazione proteina-proteina. Per preparare la proteina SBDS-FlAsH purificata, preparare innanzitutto un litro di mezzo liquido LB integrato con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. In questo mezzo, coltivare i batteri trasformati a 37 gradi Celsius fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge un valore compreso tra 0,5 e 0,7.

Indurre l'espressione della proteina SBDS-FlAsH aggiungendo 0,5 millimolare di IPTG alla coltura e proseguire l'incubazione per ulteriori cinque ore. Successivamente, raccogliere la sospensione batterica mediante centrifugazione a 3800 ×g per dieci minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante.

Risospendere le cellule in 35 millilitri di buffer di lisi SBDS integrato con un millimolare di PMSF. Lisiare mediante sonificazione per un tempo totale di quattro minuti, utilizzando cicli di dieci secondi accesi e 30 secondi spenti a quattro gradi Celsius. Successivamente, centrifugare il campione a 9.000 ×g per 50 minuti a quattro gradi Celsius.

Mantenere il soprannatante e scartare il pellet per rimuovere i detriti cellulari. Dopo aver equilibrato la colonna a affinità per nichel con tre volumi di colonna di buffer di lisi SBDS, caricare l'intero soprannatante chiarificato sulla colonna. Rimuovere le proteine non legate lavando con tre volumi di colonna di buffer di lisi SBDS.

Dopo il lavaggio della colonna, eluire la proteina legata con tre volumi di colonna di tampone SBDS per l'eluizione. Per ulteriore purificazione della proteina, equilibrare la colonna scambiatrice cationica sulfopropilica con tre volumi di colonna di tampone S a basso contenuto salino. Diluire la proteina di sei volte con tampone fosfato 50 millimolare a PH 6,5 e caricarla sulla colonna.

Lavare il materiale non legato con tre volumi di colonna di tampone S a basso sale. Quindi, eluire la proteina in un unico passaggio aggiungendo sulla colonna tampone fosfato 50 millimolare a PH 6,5 contenente un mole di cloruro di sodio. Diluire l'eluito di tre volte con tampone fosfato 50 millimolare a PH 6,5.

Quindi, concentrare le proteine utilizzando dispositivi ad ultrafiltrazione mediante centrifugazione a 3800 × g per quindici minuti. La qualità delle proteine utilizzate in questo tipo di esperimento è molto elevata. L'interpretazione dei dati diventa complessa se i campioni proteici utilizzati non sono di alta purezza.

Verificare la purezza della proteina SBDS-FlAsH mediante analisi SDS-PAGE e colorazione con Coomassio. Congelare rapidamente la proteina in azoto liquido e conservarla a meno 80 gradi Celsius fino all'uso successivo. Per preparare la proteina EFL1 purificata, coltivare innanzitutto lievito trasformato a 30 gradi Celsius in un litro di mezzo sintetico di esaurimento privo di uracile, integrato con 0,5 percento di glucosio, fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 1,8.

Indurre l'espressione proteica aggiungendo il 2,8 percento di galattosio alla coltura e proseguire l'incubazione per 18 ore a 30 gradi Celsius. Raccogliere la sospensione di lievito mediante centrifugazione a 3800 ×g per dieci minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante dopo la centrifugazione.

Risospendere le cellule in 50 millilitri di tampone di lisi EFL1 integrato con un millimolare di PMSF e un millimolare di benzamidina. Rompere le cellule per frizione su un bead-beater utilizzando perle di vetro per un tempo totale di sei minuti, con cicli di due minuti accesi e quindici minuti spenti a quattro gradi Celsius. Successivamente, centrifugare il campione a 9.000 ×g per 50 minuti a quattro gradi Celsius.

Mantenere il soprannatante e scartare il pellet per rimuovere i detriti cellulari. Successivamente, equilibrare la colonna a affinità per il nichel con tre volumi di colonna di tampone di lisi EFL1. Applicare tutto il soprannatante chiarificato sulla colonna equilibrata.

Dopo aver rimosso la proteina non legata lavando la colonna con tre volumi di colonna di buffer per la lisi EFL1, eluire la proteina legata con tre volumi di colonna di buffer di eluizione EFL1. Per ulteriore purificazione della proteina EFL1, equilibrare la colonna a esclusione dimensionale con 1,5 volumi di colonna di buffer per l'anisotropia. Concentrare la proteina EFL1 eluita dalla colonna a affinità per il nichel fino a un millilitro utilizzando dispositivi di ultrafiltrazione mediante centrifugazione a 3800 × g. Successivamente, caricare il campione concentrato sulla colonna a esclusione dimensionale.

Raccogliere la proteina eluita e concentrarla mediante ultrafiltrazione fino a una concentrazione finale di circa 30 micromolari. Verificare la purezza della proteina EFL1 mediante analisi SDS-PAGE e colorazione con Coomassie. Congelare rapidamente la proteina in azoto liquido e conservarla a meno 80 gradi Celsius fino all'uso successivo.

Mescolare tre nanomoli della proteina SBDS-FlAsH con tre nanomoli del colorante lumio verde in un volume di cinque microlitri di buffer per anisotropia. Lasciare procedere la reazione per otto ore a quattro gradi Celsius. Dopo otto ore, dializzare il campione contro il buffer per anisotropia per tutta la notte per rimuovere il colorante libero.

Misurare gli assorbimenti a 280 nanometri e 508 nanometri in uno spettrofotometro utilizzando una cuvetta in quarzo. Successivamente, utilizzare la legge di Lambert-Beer per quantificare la percentuale di proteina marcata, come descritto nel protocollo testuale. Prima di misurare il valore di anisotropia, ogni passaggio di filtrazione dalla legione proteica deve essere eseguito con attenzione, assicurandosi che l'intero campione venga dispensato nella soluzione e reso omogeneo.

In una cuvetta per fluorescenza, aggiungere 200 microlitri di SBDS-FlAsH 30 nanomolare nel buffer per l'anisotropia e titolare con 2 microlitri di EFL1 30 micromolare. Mescolare accuratamente e lasciare riposare la reazione per tre minuti prima di misurare i valori di anisotropia e fluorescenza. Ripetere questo procedimento fino a quando non è stato aggiunto un volume totale di 40 microlitri di EFL1.

Come passaggio finale, adattare i dati a un modello di legame presunto come descritto nel protocollo testuale. Per eseguire qualsiasi esperimento di anisotropia, è importante escludere grandi variazioni dell'intensità di fluorescenza. Come mostrato qui, l'intensità di fluorescenza di SBDS-FlAsH non cambia in modo significativo in seguito al legame con EFL1.

La titolazione di EFL1 in una cuvetta di quarzo contenente SBDS-FlAsH provoca un aumento dell'anisotropia iniziale osservata. Diversi aggiunti di EFL1 descrivono la curva di legame corrispondente, che può essere adattata mediante regressione non lineare ai minimi quadrati a un modello di legame ipotizzato. In questo caso, un modello con un singolo sito di legame non descrive adeguatamente i dati sperimentali.

Invece, un modello con due siti di legame non identici descrive in modo appropriato i dati sperimentali. Una volta acquisita padronanza, l'esperimento di legame mediante anisotropia della fluorescenza può essere eseguito in tre ore, se effettuato correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante disporre di proteina purificata in grandi quantità.

In parallelo a questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il saggio di complementazione basato su frammenti o l'anisotropia di fluorescenza con diversi domini della proteina in studio, al fine di supportare il modello di legame appropriato. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento di legame seguito da anisotropia di fluorescenza.