Name: Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Scopri come quantificare le interazioni proteina-proteina tra SBDS ed EFL1 mediante anisotropia di fluorescenza. Questa tecnica fornisce dati quantitativi e qualitativi essenziali per comprendere le funzioni cellulari.

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Gli autori riconoscono il sostegno finanziario dai numeri di progetto CONACyT 167359 e 177138 e dal numero di progetto DGAPA-UNAM IN201615.

1. SBDS-Flash etichetta proteine ​​Espressione e purificazione NOTA: Per gli esperimenti di anisotropia, un flash-tag corrispondente alla sequenza Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys stato aggiunto al C-terminale delle SBDS umani sequenza codificante mediante PCR. Questo costrutto è stato subclonato nel vettore di espressione pRSET-A e trasformato in celle C41 Escherichia coli per esprimere una proteina che codifica per un tag hexahistidine N-terminale (His-tag), i SBDS umani codificante sequenza e un C-terminale Flash etichetta 10. <ol><li> Espressione della proteina SBDS-FLASH <ol><li> Trasforma competente E. cellule coli C41 con il plasmide pRSET-HisSBDS-flash utilizzando un protocollo standard shock termico 19. Piastra le cellule in mezzi solidi Luria-Bertani (LB) integrato con 100 mg / ml di ampicillina. LB composizione mezzi solidi consiste di 10 g di NaCl, 5 g di estratto di lievito, 10 g di triptone e 20 g di agar per il volume 1 L. </li><li> Culture batteri trasformati a 37 ° C finoassorbanza a 600 nm (A 600) raggiunge 0,5-0,7 in 1 L di LB liquidi integrato con 100 ug / ml di ampicillina. </li><li> Indurre l&#39;espressione delle proteine ​​con l&#39;aggiunta di 0,5 mm isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside alla cultura e continuare l&#39;incubazione per ulteriori 5 ore. </li><li> Raccogliere sospensione batterica mediante centrifugazione a 3.800 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. A questo punto, sia immagazzinare il pellet cellulare a -20 ° C o utilizzare immediatamente per la purificazione della proteina. </li></ol></li><li> Purificazione della proteina SBDS-FLASH NOTA: Tutti i passaggi cromatografici sono eseguite utilizzando un sistema di cromatografia liquida (FPLC) veloce proteina o una pompa peristaltica. Ni 2+ -affinity cromatografia utilizza una colonna flusso veloce 5 ml. Cromatografia a scambio anionico utilizza una forte colonna di scambio cationico solfopropil 5 ml. Un flusso di 3 ml / min è stato usato per tutti i passaggi cromatografici. <ol><li> Risospendere le cellule in 35 ml di Lysis SBDS BUffer (50 mM tampone fosfato pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo) supplementato con 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) e lisi mediante sonicazione per un tempo totale di 4 min con cicli di 10 secondi ON e 30 secondi OFF, a 4 ° C. </li><li> Centrifugare il campione a 9000 xg per 50 min a 4 ° C. </li><li> Tenere il surnatante e scartare il pellet per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Equilibrare la colonna Ni 2+ affinità con 3 volumi di colonna (CV) di SBDS Lysis buffer e introdurre il tutto chiarito surnatante sulla colonna. </li><li> Rimuovere la proteina non legato mediante lavaggio con 3 CV di SBDS Lysis buffer e eluire con 3 CV di tampone SBDS eluizione (50 mm tampone fosfato pH 7.5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo). </li><li> Diluire la proteina 6-fold eluita con 50 mM di tampone fosfato pH 6,5 e rimuovere eventuali aggregati di filtrazione attraverso una membrana da 0,22 micron cellulosa. </li><li> Equilibrare la colonna solfopropil cazione scambiatore con 3 CV di mancanza sale colonna Stampone (50 mM tampone fosfato pH 6,5, 50 mM NaCl) e introdurre il campione di proteine ​​dal passaggio precedente. </li><li> Lavare il materiale non legato con 3 CV di mancanza sale S buffer di colonna ed eluire la proteina in un unico passaggio con 50 mM tampone fosfato pH 6,5, 1 M NaCl. </li><li> Diluire la proteina 3.3-fold eluita con tampone fosfato 50 mM pH 6.5. Concentrare la proteina con dispositivi di ultrafiltrazione per centrifugazione a 3.800 xg per 15 min. Flash congelare la proteina in azoto liquido e conservarlo a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Verificare la purezza della proteina mediante analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie 20. </li></ol></li></ol> 2. EFL1 espressione della proteina e purificazione NOTA: EFL1 è stata espressa ai sensi del regolamento del Gal 1/10 promotore divergenti 21 e il Saccharomyces cerevisiae MAT A 3&#39;UTR nel pRS426 vettore. La proteina ricombinante codifica il EFL1 isoforma umana 1 fuso ad un virus proteasi Tobacco Etch (TEV) sito di riconoscimento e un tag hexahistidine al C-terminale. <ol><li> Espressione della proteina EFL1 <ol><li> Trasforma S. cellule cerevisiae BCY123 con il plasmide pRS426-EFL1TevHis usando una batteria agli standard di acetato di protocollo 22. Piatto tutte le cellule trasformate a goccia sintetica su supporti senza uracile (SD-URA) addizionato con 2% (w / v) di glucosio. Composizione dei media SD-URA consiste di 8 g base azotata di lievito senza amminoacidi, acidi Casamino 11 g, 55 mg adenina solfato, 55 mg tirosina, 60 mg e 60 mg leucina triptofano per volume di 1 L. </li><li> Culture trasformato lievito a 30 ° C fino a 600 raggiunge 1,8 in 1 L di supporti SD-URA integrato con 0,5% (w / v) di glucosio. </li><li> Indurre l&#39;espressione della proteina aggiungendo 2,8% (w / v) galattosio alla cultura e continuare l&#39;incubazione per ulteriori 18 ore a 30 ° C. </li><li> Raccogliere la sospensione di lievito per centrifugazione a 3.800 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante.A questo punto, sia immagazzinare il pellet cellulare a -20 ° C o utilizzare immediatamente per la purificazione della proteina. </li></ol></li><li> Purificazione della proteina EFL1 NOTA: Tutti i passaggi cromatografici sono eseguite utilizzando un sistema FPLC o una pompa peristaltica. Ni 2+ -affinity cromatografia utilizza una colonna flusso veloce 5 ml ad un flusso di 3 ml / min. esclusione dimensioni cromatografia utilizza una colonna di 125 ml di pre-compresso con Superdex 200 in resina ad un flusso di 1 ml / min. <ol><li> Risospendere le cellule in 50 ml di EFL1 Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo) supplementato con 1 mM PMSF e 1 mM benzamidine e disturbare le cellule attrito su un battitore tallone utilizzando perle di vetro (Ø = 0,5 mm) per un tempo totale di 6 min con cicli di 2 min oN e OFF 15 min, a 4 ° C. </li><li> Centrifugare il campione a 9000 xg per 50 min a 4 ° C. </li><li> Tenere il surnatante e scartare il pellet per rimuovere i detriti cellulari. </li&gt; <li> Equilibrare la colonna affinità Ni 2+ con 3 CV di EFL1 Lysis buffer e inserire tutte le surnatante chiarificato sulla colonna. </li><li> Rimuovere proteina non legata mediante lavaggio con 3 CV di EFL1 Lysis buffer ed eluire con 3 CV di tampone EFL1 eluizione (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo). </li><li> Equilibrare la colonna esclusione dimensionale con 1,5 CV di tampone Anisotropia (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo, 5 mM β-mercaptoetanolo). </li><li> Concentrato a 1 ml della proteina EFL1 eluito dalla colonna di affinità Ni 2+ con dispositivi di ultrafiltrazione per centrifugazione a 3.800 xg al volume desiderato. Introdurre il campione sulla colonna delle dimensioni dell&#39;esclusione. </li><li> Raccogliere la proteina eluita e concentrare per ultrafiltrazione ad una concentrazione finale di circa 30 micron. Flash congelare la proteina in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. Verifica °e la purezza della proteina mediante analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie 20. </li></ol></li></ol> 3. Etichettatura di SBDS-flash con il flash colorante fluorescente 4 &#39;, 5&#39;-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina <ol><li> Mescolare 3 nmol della proteina SBDS-flash con 3 nmol di 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina in 5 volumi microlitri di tampone Anisotropia. </li><li> Lasciate che la reazione di proseguire per 8 ore a 4 ° C. Dializzare il campione contro il buffer di anisotropia durante la notte per rimuovere il colorante libero. </li><li> Utilizzare la legge di Lambert-Beer per quantificare la% di proteina marcata. Misurare l&#39;assorbanza a 280 nm e 508 nm in uno spettrofotometro utilizzando una cuvetta di quarzo di volume adeguato. NOTA: Considerare i seguenti coefficienti di assorbimento molari (M -1 cm -1): <img alt="Equation1B" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" /></li><li> Calcolare la concentrazione di proteina etichettata SBDS-flash utilizzando Equazione 2. <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" /></li><li> Calcolare la concentrazione di proteine totali SBDS usando Equazione 3 sostituendo il calcolato C SBDS-Flash da precedente passaggio. <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" /></li><li> Calcolare la percentuale di proteina marcata usando l&#39;equazione 4. <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" /></li></ol> 4. Esperimenti anisotropia di fluorescenza NOTA: esperimenti anisotropia sono state fatte in un spettrofluorimetro attrezzato con una collezione di polarizzazione strumenti e dati è stata effettuata utilizzando il programma anisotropia fornita nel software dell&#39;apparecchio. La lunghezza d&#39;onda di eccitazione è stata fissata a 494 nm con una banda spettrale di 8 nm e l&#39;emissione è stato registrato utilizzando un filtro passa-banda di 530 ± 25 nm. Le misurazioni sono state effettuate a 25 ° C in una cuvetta 200 microlitri con un 5 mm di traiettoria 10. <ol><li><html> In una vaschetta di fluorescenza, mettere 200 ml di 30 nm SBDS-Flash nel buffer di anisotropia e titolare di 2 ml di 30 micron EFL1. Mescolare accuratamente e lasciar riposare la reazione per 3 minuti prima di misurare il valore di anisotropia. </li><li> È stato aggiunto Ripetere il punto 4.1 fino ad un volume totale di 40 microlitri di EFL1. </li></ol> Analisi 5. I dati <ol><li> Montare i dati al modello di rilegatura appropriato utilizzando un algoritmo non lineare almeno quadrati di regressione. Equazioni per i modelli di attacchi più comuni sono riportati in Tabella 1. </li><li> Valutare il miglior modello che descrive l&#39;interazione tra le proteine ispezionando residui della misura 23. Sostenere il modello scelto con ulteriori esperimenti. </li></ol> Tabella 1. Modelli di legame interazioni proteina-proteina comune e le equazioni matematiche che li descrivono.0 / 54640table1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" />

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare e non hanno interessi finanziari concorrenti.

Maggior parte degli esperimenti biochimici con proteine ​​richiedono non solo proteina pura, ma anche grandi quantità di loro, indipendentemente dalla tecnica utilizzata. Per questo motivo, le proteine ​​utilizzate per questo tipo di esperimenti sono ottenuti mediante espressione eterologa, come era il caso qui presentato. spettroscopia Florescence richiede la presenza di un fluoroforo nella molecola studiata. residui aromatici costituiscono i fluorofori intrinseci di una proteina, tuttavia, utilizzando il segnale per s...

Le cellule contengono una moltitudine di biomacromolecole che interagiscono costantemente con l&#39;altro. Questa associazione dà luogo a complessi che partecipano alle vie cellulari responsabili per il loro funzionamento nella trasduzione del segnale, regolazione dell&#39;espressione genica e la migrazione delle cellule, tra gli altri. Tutte le interazioni proteina-proteina che si verificano in una cella comprendono una rete nota come dell&#39;interattoma. In Saccharomyces cerevisiae hanno dimostrato più del 70% delle proteine di avere partner interagenti 1. Comprendere la interattoma di una cella e le loro funzioni di fornire informazioni pertinenti sulla complessità e la diversità degli organismi viventi. Diverse metodologie sono state descritte per identificare e caratterizzare le interazioni proteina-proteina. Diverso alto attraverso metodi messi come il lievito doppio ibrido 2, saggi di complementazione proteine frammento 3, affinità di purificazione 4 accoppiata alla spettrometria di massa e microarra proteineys vengono utilizzati per identificare una interazione 5,6. Una volta identificato, è necessario convalidare e puo variare caso per caso. Tipicamente, questi esperimenti comportano interrompere stessa interazione a livello dei singoli membri della coppia interazione, ad esempio, dalla delezione gene o sovraespressione di una delle proteine, e quindi cerca di cambiamenti nelle proprietà o funzione di un altro membro del livello cellulare. Successivamente, tecniche biofisiche 7 sono utilizzati per caratterizzare l&#39;interazione proteina-proteina a livello molecolare. A tal fine, la struttura di complessi proteici sono determinati mediante cristallografia a raggi X, risonanza magnetica nucleare e la microscopia crioelettronica mentre calorimetria e spettroscopia di fluorescenza sono utilizzati per descriverli quantitativamente e meccanicamente. In questo lavoro, anisotropia di fluorescenza è stato utilizzato come tecnica per caratterizzare l&#39;interazione tra la GTPasi EFL1 e SBDS proteine. Queste proteine partecipano nella sintesi dei ribosomi promuovendo il rilascio di fattore di inizio eucariotico 6 dalla superficie 60S ribosomiale subunità 8. La proteina SBDS è mutato in una malattia nota come Shwachman-Diamond Sindrome 9 e agisce come un fattore di scambio guanina nucleotide per EFL1 diminuendo la sua affinità per guanosindifosfato 10,11. mutazioni malattia in SBDS abolire l&#39;interazione con EFL1 e quindi impediscono la sua attivazione. Fluorescenza anisotropia è comunemente usato in applicazioni biologiche per studiare la proteina-peptide o interazioni degli acidi nucleici proteine. Si basa sul principio che un fluoroforo eccitato con risultati luce polarizzata in una emissione parzialmente polarizzata. Anisotropia di fluorescenza è definito dall&#39;equazione 1: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" /> dove ho vv e mi VH sono ilintensità di fluorescenza della verticale (VV) e in orizzontale (VH) polarizzati emissione quando il campione è eccitato con luce polarizzata verticalmente 12. Anisotropia di fluorescenza è sensibile a fattori che influenzano la velocità di diffusione rotazionale del fluoroforo e dipende dalla temperatura, la viscosità della soluzione e la dimensione molecolare apparente del fluoroforo così. La dimensione apparente di una proteina contenente un fluoroforo aumenta quando interagisce con un&#39;altra proteina e tale modifica può essere valutato come un cambiamento di anisotropia. Più specificamente, un fluoroforo che ruota lentamente in soluzione rispetto alla sua durata fluorescente avrà un valore I VV e piccolo valore I VH e pertanto presentano una relativamente grande anisotropia. Per fluorofori che scendono rapidamente rispetto al loro ciclo di vita fluorescente, ho Vv e VH saranno simili e il loro valore anisotropia sarà piccolo 12 </sup&gt; (Figura 1). Inoltre, per un buon segnale anisotropia di misura del rumore, è necessario avere un fluoroforo con una vita di fluorescenza simile al tempo di correlazione rotazionale della molecola di interesse. Altrimenti, non è possibile registrare accuratamente la differenza di anisotropia tra la proteina libero e che nel complesso. Ad esempio, l&#39;anisotropia di una sonda fluorescente con una durata quasi 4 nsec come fluoresceina o rodamina collegati a un composto a basso peso molecolare di 100 Da è 0.05. Associazione a una molecola di 160 kDa aumenterà il suo valore anisotropia a 0,29; una differenza che può essere misurata con precisione. Al contrario, la stessa sonda fluorescente coinvolto in una reazione di legame cui incremento di peso molecolare varia da 65 a 1000 kDa comporterà solo un cambiamento anisotropia di 0,28 e 0,3, che è troppo piccola per essere misurata con precisione. In questo scenario, una sonda con una durata di 400 nanosecondi sarebbe più adatto 12. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione schematica delle apparecchiature utilizzate per misurare anisotropia di fluorescenza e la procedura. Rappresentazione schematica dell&#39;attrezzatura utilizzata per eseguire una anisotropia di fluorescenza misurazione proteina-proteina interazione esperimento. Fluorofori che scendono visualizzazione rapida piccolo anisotropia che aumenta dopo il legame a un partner di interazione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> applicazioni fluorescenza richiedono la presenza di un fluoroforo in una qualsiasi delle molecole studiate. Per studiare le interazioni proteina-proteina ci sono tre tipi di fluorofori: 1) i residui di triptofano presenti nelle proteine, 2) fluorofori allegate chimicamente e 3) partner di fusione fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP) e la sua Derivative. La maggior parte delle proteine ​​hanno residui di triptofano sulla sua struttura, così il modo più semplice per misurare un&#39;interazione è monitorando i cambiamenti nel corrispondente spettri di fluorescenza o monitorando i cambiamenti nell&#39;intensità di fluorescenza dei residui di triptofano. Tuttavia, residui di triptofano possono essere presenti in entrambe le proteine ​​complicare l&#39;analisi. D&#39;altra parte, per un fluoroforo per modificare le proprietà fluorescenti dovuto all&#39;interazione deve essere situato sopra o vicino al sito di legame e potrebbe interferire con l&#39;interazione stessa. Questo richiede particolare attenzione quando si utilizza fluorofori ingombranti come GFP. Se nessuno di questi fluorofori può essere utilizzato per studi di legame è necessario, quindi, di introdurre fluorofori estrinseci a una delle proteine ​​coinvolte. Molti fluorofori sintetizzati chimicamente esistono e possono essere covalentemente attaccati alle proteine ​​attraverso i loro gruppi reattivi come i gruppi amminici (catena laterale di lisine o N-terminale) ei gruppi tiolici in cisteina. Fderivati luorophore con isotiocianato e succinimidyl esteri reagiscono con gruppi ammidici mentre Iodoacetamide e maleimmide sono gruppi tiolo-reattivi 13. I coloranti più comuni utilizzati in applicazioni in fluorescenza sono derivati ​​del fluoresceina ei coloranti verdi rodamina, cumarine, fluorofori BODIPY e coloranti Alexa Fluor. Un elenco dettagliato dei fluorofori disponibili in commercio e il loro uso può essere trovato in riferimenti 14,15. Per l&#39;etichettatura di successo, il gruppo reattivo deve essere esposto sulla superficie della proteina, ma a causa del gran numero di gruppi funzionali reattivi tipicamente presenti in polipeptidi è molto difficile ottenere modificazioni sito-specifica. La proteina di interesse in questo studio, SBDS, contiene 5 cisteine ​​libere e 33 lisine che possono provocare l&#39;etichettatura più siti. l&#39;etichettatura non uniforme può influenzare il legame e complicherà l&#39;analisi dei dati come diverse molecole fluorofori possono suscitare diversi segnali di intensità fluorescente su vincolante. a Overcome questo problema, abbiamo usato il fluoroforo flash, 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina all&#39;etichetta sito-diretta la proteina SBDS. Questo è un colorante arsenoxide con alta affinità per quattro cisteine distanziati in un motivo conosciuto come FlAsH-tag costituito dalla CCXXCC sequenza in cui X è un qualsiasi amminoacido diverso cisteina 16,17. Questo motivo tetracysteine ​​viene aggiunto N- o C-terminale della proteina mediante ingegneria genetica insieme ad un linker opportuno evitare l&#39;interruzione della piega complessiva della proteina. La coppia che consiste di Flash tintura e Flash-tag è stato originariamente progettato per le proteine di etichette site-specific nelle cellule viventi 17, ma può anche essere usato per etichettare le proteine purificate in vitro come è esemplificato qui. Inoltre, sono stati sviluppati strategie enzimatici per consentire funzionalizzazione site-specific di proteine 18. In questo manoscritto descriviamo l&#39;utilità di anisotropia di fluorescenza unTool SA per studiare le interazioni proteina-proteina. Binding può essere valutata semplice ispezione della forma vincolante curva mentre le informazioni quantitative può essere ottenuta dalla misura dei dati sperimentali.

<table><tbody><tr><td>0,5 mm Perle di vetro Biospec</td><td>Prodotti</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td> ultra puro <td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>colorante 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-il) fluoresceina</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>LC6090</td><td>Questo kit contiene il colorante per etichettare un tag FlAsH</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucosio anidro</td><td>per mezzo</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-galattosio</td><td>per medio</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-leucina</td><td>per medio</td><td>DOC0157</td><td></td></tr><tr><td>L-triptofan</td><td>Formedium</td><td>DOC0189</td><td></td></tr><tr><td>Bezamidina cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Gold Biotechnology, Inc</td><td>P-470-25</td><td>Fenilmetilsulfonilfluoruro</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Formedium</td><td>NAC02</td><td>Cloruro di sodio&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Tecsiquim, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>Cloruro di magnesio</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Fosfato di potassio dibasico</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>Fosfato di sodio monobasico</td></tr><tr><td>Base azotata di lievito senza aminoacidi</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td>Micro Granulated</td></tr><tr><td>L-Tyroisne</td><td>Formedium</td><td>DOC0193</td><td></td></tr><tr><td>Adenina solfato</td><td>Formedium</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acidi</td><td>Formedium</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>Unità di filtrazione</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10&nbsp; kDa</td></tr><tr><td>Filtro a membrana</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>Filtro a membrana, esteri misti di cellulosa, idrofilo, 0,22&nbsp; &micro; m, 47&nbsp; mm, bianco, liscio</td></tr><tr><td>Ni2+ colonna di affinità</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>Cartuccia preriempita con 5&nbsp; ml Colonna</td></tr> per <tr><td>scambiatore di cationi solfopropilico</td> Ni-NTA Superflow <td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td></tr><tr><td>Colonna di esclusione dimensionale</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Cella di fluorescenza</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6860AA</td><td>Agitatore UV-Vis Cary 60</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 Intervallo di temperatura da banco Da -15 a 60 gradi C</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004271</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>Fuori produzione</td><td>Sistema FPLC conducibilità UV-MM II monitor P500 frazione di pompa</td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro</td><td>Olis</td><td>No applicabile</td><td>Olis DM 45 con Polarization Toolbox</td></tr></tbody></table>

anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Le interazioni proteina-proteina svolgono un ruolo essenziale nella funzione di un organismo vivente. Una volta che l&#39;interazione è stata identificata e convalidata è necessario caratterizzare al livello strutturale e meccanicistica. Esistono diversi metodi biochimici e biofisici per tale scopo. Tra questi, anisotropia di fluorescenza è una tecnica potente particolarmente utilizzata quando l&#39;intensità di fluorescenza di una proteina fluoroforo marcato rimane costante mediante interazione proteina-proteina. In questa tecnica, una proteina fluoroforo marcato è eccitato con luce polarizzata verticalmente di opportuna lunghezza d&#39;onda che eccita selettivamente un sottoinsieme dei fluorofori in base al loro orientamento rispetto al fascio in ingresso. L&#39;emissione risultante ha anche una direzionalità cui rapporto in piani verticali e orizzontali definisce anisotropia (r) come segue: r = (I VV -I VH) / (I + 2I VV VH), dove Vv e <sub&gt; VH sono le intensità di fluorescenza dei componenti verticale ed orizzontale, rispettivamente. Anisotropia di fluorescenza è sensibile alla diffusione di rotazione di un fluoroforo, vale a dire la dimensione molecolare apparente di un fluoroforo attaccato ad una proteina, che viene modificato mediante interazione proteina-proteina. Nel testo attuale, l&#39;uso di anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina è stato esemplificato per affrontare il legame tra la proteina mutata nella sindrome del Shwachman-Diamond (SBDS) e il fattore di allungamento like-1 GTPase (EFL1). Convenzionalmente, l&#39;etichettatura di una proteina con un fluoroforo viene effettuata sui gruppi tiolici (cisteina) o dei gruppi amminici (N-terminali amminici o lisina) della proteina. Tuttavia, SBDS possiede diversi cisteine ​​e lisine che non consentono sito-etichettatura di esso. In una tecnica alternativa, il colorante 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina è stato usato per etichettare specificamente un motivo tetracysteine, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, geneticamente nel C-terminale della proteina ricombinante SBDS. Montaggio dei dati sperimentali fornito informazioni quantitative e meccanicistica della modalità di legame tra queste proteine.

Per eseguire qualsiasi esperimento anisotropia è importante escludere grandi variazioni dell&#39;intensità di fluorescenza del fluoroforo poiché l&#39;anisotropia osservata di una miscela di specie è rappresentata dall&#39;equazione 5: <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" /> dove F i rappresenta la fluorescenza frazionata...

interazioni proteina sono al centro della funzione di una cellula. tecniche calorimetriche e spettroscopiche sono comunemente usati per caratterizzare loro. Qui si descrive anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare l&#39;interazione tra la proteina mutata nella sindrome di Shwachman-Diamond (SBDS) e il fattore di allungamento-simile 1 GTPase (EFL1).

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare e quantificare l'interazione tra due proteine di interesse utilizzando l'anisotropia di fluorescenza. Queste misure possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biochimica e della biofisica delle proteine, come ad esempio quali interazioni proteiche siano importanti per la funzione cellulare.Il principale vantaggio di questa tecnica è che possiamo ottenere informazioni quantitative e qualitative sull'interazione proteina-proteina. Per preparare la proteina SBDS-FlAsH purificata, preparare innanzitutto un litro di mezzo liquido LB integrato con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. In questo mezzo, coltivare i batteri trasformati a 37 gradi Celsius fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge un valore compreso tra 0,5 e 0,7.Indurre l'espressione della proteina SBDS-FlAsH aggiungendo 0,5 millimolare di IPTG alla coltura e proseguire l'incubazione per ulteriori cinque ore. Successivamente, raccogliere la sospensione batterica mediante centrifugazione a 3800 ×g per dieci minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante.Risospendere le cellule in 35 millilitri di buffer di l

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Questo protocollo descrive come immagine interazioni proteina-proteina mediante un saggio basato su FRET prossimità.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Questo video dimostra l'uso della spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per rilevare l'interazione tra le proteine della superficie cellulare ai contatti cellula-cellula. Esprimendo il recettore di adesione transmembrana di interesse marcato con una proteina fluorescente e mescolando due diverse popolazioni cellulari che ospitano due etichette fluorescenti spettralmente separate, la trans-interazione tra i recettori di due cellule vicine con fluorescenza di colore diverso viene...

Spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per studiare l'interazione delle proteine a contatto cellulare

Questo video dimostra la tecnica della spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza (FFS) per studiare l'omo-oligomerizzazione delle proteine. Le proteine marcate in fluorescenza in un campione vengono dimerizzate utilizzando un agente quando si studia l'oligomerizzazione proteica mediante FFS. Utilizzando un microscopio confocale, mentre le proteine si muovono dentro e fuori dal piccolo volume di osservazione, viene eseguita l'analisi delle fluttuazioni della luminosità delle molecole...

Spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per studiare l'omo-oligomerizzazione delle proteine

In questo video, descriviamo la tecnica dell'anisotropia a fluorescenza per studiare le interazioni tra la proteina della sindrome di Shwachman-diamond (SBDS) marcata con fluorofori e la 1 GTPasi simile al fattore di allungamento (EFL1). All'incubazione di proteine SBDS con concentrazioni gradualmente crescenti di EFL1, si osserva un costante aumento dell'anisotropia, indicando una riuscita interazione tra le due proteine.

Rilevamento basato sull'anisotropia della fluorescenza delle interazioni proteina-proteina

Questo video descrive l'anisotropia di fluorescenza ad alte prestazioni che aiuta a monitorare l'interazione tra fattori di trascrizione e DNA. Il test monitora le interazioni di una molecola di DNA marcata con fluoroforo con il suo fattore di trascrizione specifico misurando il grado di polarizzazione dovuto alla rotazione molecolare o all'anisotropia del DNA marcato con fluoroforo.

Anisotropia di fluorescenza per determinare l'affinità di legame tra fattore di trascrizione e DNA

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere dati di tre colori smFRET e la sua analisi con un ensemble 3D modello di Markov nascosto. Con questo approccio, gli scienziati possono estrarre informazioni cinetiche da sistemi proteici complessi, tra cui il cooperativity o interazioni correlate.

Usando tre colori singola molecola FRET per studiare la correlazione delle interazioni della proteina

Questo protocollo descrive un approccio privo di calibrazione per la quantificazione della proteina omo-oligomerizzazione in vitro basati sulla spettroscopia di fluorescenza fluttuazione mediante microscopia a scansione di luce commerciale. Le impostazioni di acquisizione corretta e i metodi di analisi sono mostrati.

Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

Questo protocollo descrive un approccio di basato su spettroscopia di fluorescenza fluttuazione per indagare le interazioni tra proteine che mediano interazioni cellula-cellula, cioè proteine localizzate nelle giunzioni delle cellule, direttamente nelle cellule viventi. Forniamo le linee guida dettagliate sulla calibrazione dello strumento, acquisizione dati e analisi, comprese le correzioni al fonti possibili manufatto.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra due molecole di fluorofori può essere utilizzato per studiare le interazioni proteiche nella cellula vivente. Qui, viene fornito un protocollo su come misurare la FRET nelle cellule vive rilevando l'emissione sensibilizzata dell'accettore e la tempra della molecola donatrice utilizzando la microscopia a scansione laser confocale.

Valutazione delle interazioni proteiche nelle cellule vive con emissione sensibilizzata alla FRET

Presentiamo un protocollo sperimentale e un flusso di lavoro di analisi dei dati per eseguire la spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore (FCCS) combinata con il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per studiare la dinamica del recettore di membrana nelle cellule vive utilizzando le moderne tecniche di etichettatura a fluorescenza.

Spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore per studiare l'interazione proteina-proteina e la dinamica proteica nelle cellule vive

Qui, presentiamo il protocollo per studiare la flessibilità locale e la dinamica delle biomolecole utilizzando l'anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo a livello di singola molecola in modalità microscopia confocale.

Anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo da singole molecole per la caratterizzazione della flessibilità locale nelle biomolecole

Scopri come quantificare le interazioni proteina-proteina tra SBDS ed EFL1 mediante anisotropia di fluorescenza. Questa tecnica fornisce dati quantitativi e qualitativi essenziali per comprendere le funzioni cellulari.

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

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