Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo
November 4th, 2016
Riportiamo un protocollo utilizzando celle a fluorescenza-attivato di smistamento per isolare le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) con elevata purezza dal midollo osseo di topi lupus inclini per gli studi funzionali del PDC.
L'obiettivo generale di questo esperimento è isolare cellule dendritiche plasmacitoidi, o PDC, con un'elevata purezza dal midollo osseo di topi inclini al lupus per lo studio della loro funzione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative alle caratteristiche di una particolare popolazione di cellule immunitarie, come ad esempio l'interferone alfa che produce PDC durante la fase avanzata dello sviluppo del lupus. Il vantaggio principale di questa tecnica è che una o più popolazioni target possono essere arricchite a una purezza maggiore rispetto alla selezione magnetica delle bigelle.
Dopo la raccolta, trasferire le ossa degli arti posteriori e quattro millilitri di terreno completo, in un mortaio. Aggiungere sei millilitri di terreno completo fresco per portare il volume totale a 10 millilitri. E rompi delicatamente le ossa con un pestello.
Mescola delicatamente il pestello per rilasciare il midollo osseo. Quindi, trasferire tutto il terreno attraverso un colino da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio. Aggiungere 10 millilitri di terreno completo fresco al mortaio.
E filtra il surnatante altre due volte fino a quando le ossa appaiono bianche. Quindi, centrifugare le cellule del midollo osseo e risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno completo fresco. Quindi, sovrapporre le cellule su cinque millilitri di terreno di gradiente di densità appena preparato in un tubo conico da 15 millilitri, facendo attenzione a non interrompere gli strati.
E separare le celle mediante centrifugazione. Quindi, rimuovere con cura i primi otto millilitri della soluzione e raccogliere i due millilitri di buffy coat all'interfase. Aggiungere 12 millilitri di terreno completo ghiacciato alle celle mononucleate isolate e tappare la provetta per miscelare per inversione.
Quindi, pellettare le celle mediante centrifugazione. Per colorare le cellule per la FACS, risospenderle in 100 microlitri di anticorpo bloccante CD1632FC a quattro gradi Celsius. Dopo 10 minuti, lavare le cellule in quattro millilitri di tampone di selezione a freddo e marcare le cellule con 100 microlitri del cocktail di anticorpi per la colorazione della superficie cellulare appropriato.
Per 15 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Lavare le cellule in quattro millilitri di tampone di selezione a freddo ghiacciato per rimuovere qualsiasi anticorpo coniugato a fluorescenza non legato. Quindi, risospendere il pellet in 500 microlitri di soluzione di caricamento FACS e trasferire il campione in una provetta FACS su ghiaccio.
Per colorare i controlli di compensazione, aliquotare una volta da 10 a un sesto splenocita per provetta. Lavare le celle con quattro millilitri di tampone di selezione e risospendere i pellet in 100 microlitri di tampone di cernita. Quindi, aggiungere l'anticorpo coniugato a fluorescenza appropriato dal cocktail di anticorpi sulla superficie della cellula master a ciascuna provetta di compensazione corrispondente e agitare le provette per mescolare.
Dopo 15 minuti al buio, a quattro gradi Celsius, lavare tutti i campioni con il tampone di selezione e risospendere i pellet in 500 microlitri di tampone di selezione ghiacciato. Ad eccezione del tubo DAPI, che viene risospeso in 500 microlitri di soluzione di caricamento FACS. Per purificare la popolazione cellulare bersaglio mediante smistamento cellulare attivato a fluorescenza, caricare provette di raccolta contenenti 500 microlitri di FBS integrate con antibiotici sotto le valvole di smistamento.
Quindi, caricare il tubo non colorato e raccogliere 10.000 eventi per impostare il gate negativo per ogni intensità fluorescente. E 10.000 eventi nei singoli tubi di compensazione delle macchie per impostare il gate positivo per ogni intensità di fluorescenza. Raccogli 3.000 eventi dal campione sperimentale per impostare i cancelli della popolazione cellulare ordinata.
Utilizzando le intensità di fluorescenza come parametri del grafico di accesso X e Y per controllare manualmente la popolazione cellulare target. Quindi, smistare la popolazione di cellule bersaglio nella provetta di raccolta. Al termine della cernita, aggiungere fino a quattro millilitri di ice cole full medium alle celle.
Quindi, tappare la provetta e mescolare le celle per inversione. Pellettare le cellule purificate mediante centrifugazione, aspirando tutti tranne gli ultimi 200 microlitri del surnatante. Quindi, risospendere il pellet in un millilitro di terreno completo ghiacciato e trasferire le celle in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per una seconda centrifugazione.
Infine, aspirare tutti i microlitri del surnatante tranne gli ultimi 100 e conservare la popolazione cellulare selezionata su ghiaccio fino all'uso. La selezione cellulare attivata magneticamente di cellule dendritiche plasmacitoidi di midollo osseo da topi inclini al lupus determina solo una purezza del 7,75% dopo l'arricchimento. Le cellule dendritiche plasmacitoidi arricchite con FACS, tuttavia, dimostrano una purezza fino al 96,4% dopo lo smistamento.
Per garantire un'elevata purezza, le cellule mononucleate del midollo osseo vengono prima controllate e separate dai detriti mediante parametri di dispersione in avanti e lateralmente. Utilizzando la larghezza di dispersione diretta rispetto all'altezza di dispersione diretta e la larghezza di dispersione laterale rispetto all'altezza di dispersione laterale, le singole celle vengono ulteriormente controllate per evitare i falsi segnali positivi prodotti dagli aggregati. Le singole cellule DAPI negative vive vengono quindi gated dalla loro espressione di superficie cellulare CD11c positiva e CD11B negativa, consentendo un ulteriore gating della popolazione di cellule dendritiche plasmacitoidi del midollo osseo bersaglio B220 positive e PDCA-1 positivo.
La popolazione di PDC selezionata non è solo di elevata purezza, ma anche funzionalmente normale con la capacità di produrre IFNalfa dopo stimolazione CPG in vitro. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di rompere le ossa e mescolare delicatamente il midollo osseo rilasciato per preservare la vitalità cellulare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento dell'RNA o la coltura e la stimolazione in vitro, per rispondere a ulteriori domande sull'espressione genica o sulla funzione delle popolazioni cellulari arricchite.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori della PDC per esplorare il ruolo di questa potente cellula nello sviluppo del lupus e dei modelli murini inclini al lupus. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare una popolazione di PDC altamente purificata dal midollo osseo di topi inclini al lupus.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per isolare le cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) dal midollo osseo di topi predisposti al lupus utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Il metodo mira a ottenere un'elevata purezza per successivi studi funzionali delle pDC.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Autoimmunità
Sfondo
- Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono cruciali per le risposte immunitarie.
- Producono interferone alfa, specialmente durante la progressione del lupus.
- L'isolamento ad alta purezza è essenziale per un'analisi funzionale accurata.
- La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali.
Obiettivo dello studio
- Isolare pDC da topi predisposti al lupus.
- Studiare le caratteristiche funzionali delle pDC.
- Migliorare la comprensione del comportamento delle cellule immunitarie nel lupus.
Metodi utilizzati
- Raccolta del midollo osseo da topi predisposti al lupus.
- Utilizzo della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza per l'isolamento.
- Preparazione del mezzo completo per l'elaborazione cellulare.
- Frantumazione delle ossa per rilasciare le cellule per la selezione.
Risultati principali
- Isolamento con successo delle pDC con elevata purezza.
- Migliore comprensione della funzione delle pDC nel lupus.
- Dimostrazione dei vantaggi della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.
- Fornitura di un protocollo affidabile per studi futuri.
Conclusioni
- Il protocollo isola efficacemente le pDC per gli studi funzionali.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della patologia del lupus.
- La ricerca futura può basarsi su questa metodologia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolating rare immune cell populations with high purity is critical for mechanistic de-risking in target validation and preclinical model development. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables precise phenotypic separation of plasmacytoid dendritic cells from lupus-prone mouse bone marrow, supporting reliable functional assays and translational biomarker discovery. This approach reduces biological noise in early discovery, improving predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plasmacytoid dendritic cell function in lupus pathogenesis by isolating a pure population for interferon alpha production studies.
- Operational Value: Achieves up to 96.4% purity post-sorting, significantly exceeding magnetic-activated cell sorting alternatives.
- Strategic Value: Supports target confidence by reducing cellular heterogeneity in functional readouts, aiding go/no-go decisions in immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified plasmacytoid dendritic cells suitable for in vitro stimulation assays, such as CpG-induced interferon alpha measurement.
- Operational Value: Permits simultaneous separation of multiple cell populations, increasing experimental throughput and assay standardization.
- Strategic Value: Creates a reproducible input for screening workflows, enabling reliable compound evaluation against defined immune phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system using lupus-prone mouse models to study plasmacytoid dendritic cell contributions to autoimmunity.
- Operational Value: Isolated cells remain functionally normal, capable of interferon alpha production upon stimulation, validating assay readiness.
- Strategic Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by supplying well-characterized primary cells for mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early target validation through phenotypic screening and enabling lead identification via functional readouts in purified immune cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating plasmacytoid dendritic cells to clarify their role in interferon-driven lupus pathology.
- Screening: Delivers standardized, high-purity cell populations for reproducible functional assays and compound screening.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as cytokine production, flow cytometry readouts, and purity assessment via forward/side scatter gating.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of lupus-prone mice, aligning with mechanistic de-risking in autoimmune disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating rare immune cells across multiple immunology and autoimmunity projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduction of mechanistic ambiguity in immune cell function studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined gating strategies and compensation controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions and reduced late-stage biological risk in immunomodulator development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable preclinical data from purified cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell staining, and compensation controls for accurate fluorescence-activated cell sorting.
- Dependent on instrumentation including flow cytometers, sorting equipment, and centrifugation systems for bone marrow processing.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, gating strategies, and sorting protocols across immunology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other model systems or tissue sources beyond mouse bone marrow.
- Includes practical limitations such as the need for gentle bone marrow disruption to preserve cell viability and the time-intensive nature of multi-step purification.
