Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo
4 novembre 2016
Riportiamo un protocollo utilizzando celle a fluorescenza-attivato di smistamento per isolare le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) con elevata purezza dal midollo osseo di topi lupus inclini per gli studi funzionali del PDC.
L'obiettivo generale di questo esperimento è isolare cellule dendritiche plasmacitoidi, o PDC, con un'elevata purezza dal midollo osseo di topi inclini al lupus per lo studio della loro funzione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative alle caratteristiche di una particolare popolazione di cellule immunitarie, come ad esempio l'interferone alfa che produce PDC durante la fase avanzata dello sviluppo del lupus. Il vantaggio principale di questa tecnica è che una o più popolazioni target possono essere arricchite a una purezza maggiore rispetto alla selezione magnetica delle bigelle.
Dopo la raccolta, trasferire le ossa degli arti posteriori e quattro millilitri di terreno completo, in un mortaio. Aggiungere sei millilitri di terreno completo fresco per portare il volume totale a 10 millilitri. E rompi delicatamente le ossa con un pestello.
Mescola delicatamente il pestello per rilasciare il midollo osseo. Quindi, trasferire tutto il terreno attraverso un colino da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio. Aggiungere 10 millilitri di terreno completo fresco al mortaio.
E filtra il surnatante altre due volte fino a quando le ossa appaiono bianche. Quindi, centrifugare le cellule del midollo osseo e risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno completo fresco. Quindi, sovrapporre le cellule su cinque millilitri di terreno di gradiente di densità appena preparato in un tubo conico da 15 millilitri, facendo attenzione a non interrompere gli strati.
E separare le celle mediante centrifugazione. Quindi, rimuovere con cura i primi otto millilitri della soluzione e raccogliere i due millilitri di buffy coat all'interfase. Aggiungere 12 millilitri di terreno completo ghiacciato alle celle mononucleate isolate e tappare la provetta per miscelare per inversione.
Quindi, pellettare le celle mediante centrifugazione. Per colorare le cellule per la FACS, risospenderle in 100 microlitri di anticorpo bloccante CD1632FC a quattro gradi Celsius. Dopo 10 minuti, lavare le cellule in quattro millilitri di tampone di selezione a freddo e marcare le cellule con 100 microlitri del cocktail di anticorpi per la colorazione della superficie cellulare appropriato.
Per 15 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Lavare le cellule in quattro millilitri di tampone di selezione a freddo ghiacciato per rimuovere qualsiasi anticorpo coniugato a fluorescenza non legato. Quindi, risospendere il pellet in 500 microlitri di soluzione di caricamento FACS e trasferire il campione in una provetta FACS su ghiaccio.
Per colorare i controlli di compensazione, aliquotare una volta da 10 a un sesto splenocita per provetta. Lavare le celle con quattro millilitri di tampone di selezione e risospendere i pellet in 100 microlitri di tampone di cernita. Quindi, aggiungere l'anticorpo coniugato a fluorescenza appropriato dal cocktail di anticorpi sulla superficie della cellula master a ciascuna provetta di compensazione corrispondente e agitare le provette per mescolare.
Dopo 15 minuti al buio, a quattro gradi Celsius, lavare tutti i campioni con il tampone di selezione e risospendere i pellet in 500 microlitri di tampone di selezione ghiacciato. Ad eccezione del tubo DAPI, che viene risospeso in 500 microlitri di soluzione di caricamento FACS. Per purificare la popolazione cellulare bersaglio mediante smistamento cellulare attivato a fluorescenza, caricare provette di raccolta contenenti 500 microlitri di FBS integrate con antibiotici sotto le valvole di smistamento.
Quindi, caricare il tubo non colorato e raccogliere 10.000 eventi per impostare il gate negativo per ogni intensità fluorescente. E 10.000 eventi nei singoli tubi di compensazione delle macchie per impostare il gate positivo per ogni intensità di fluorescenza. Raccogli 3.000 eventi dal campione sperimentale per impostare i cancelli della popolazione cellulare ordinata.
Utilizzando le intensità di fluorescenza come parametri del grafico di accesso X e Y per controllare manualmente la popolazione cellulare target. Quindi, smistare la popolazione di cellule bersaglio nella provetta di raccolta. Al termine della cernita, aggiungere fino a quattro millilitri di ice cole full medium alle celle.
Quindi, tappare la provetta e mescolare le celle per inversione. Pellettare le cellule purificate mediante centrifugazione, aspirando tutti tranne gli ultimi 200 microlitri del surnatante. Quindi, risospendere il pellet in un millilitro di terreno completo ghiacciato e trasferire le celle in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per una seconda centrifugazione.
Infine, aspirare tutti i microlitri del surnatante tranne gli ultimi 100 e conservare la popolazione cellulare selezionata su ghiaccio fino all'uso. La selezione cellulare attivata magneticamente di cellule dendritiche plasmacitoidi di midollo osseo da topi inclini al lupus determina solo una purezza del 7,75% dopo l'arricchimento. Le cellule dendritiche plasmacitoidi arricchite con FACS, tuttavia, dimostrano una purezza fino al 96,4% dopo lo smistamento.
Per garantire un'elevata purezza, le cellule mononucleate del midollo osseo vengono prima controllate e separate dai detriti mediante parametri di dispersione in avanti e lateralmente. Utilizzando la larghezza di dispersione diretta rispetto all'altezza di dispersione diretta e la larghezza di dispersione laterale rispetto all'altezza di dispersione laterale, le singole celle vengono ulteriormente controllate per evitare i falsi segnali positivi prodotti dagli aggregati. Le singole cellule DAPI negative vive vengono quindi gated dalla loro espressione di superficie cellulare CD11c positiva e CD11B negativa, consentendo un ulteriore gating della popolazione di cellule dendritiche plasmacitoidi del midollo osseo bersaglio B220 positive e PDCA-1 positivo.
La popolazione di PDC selezionata non è solo di elevata purezza, ma anche funzionalmente normale con la capacità di produrre IFNalfa dopo stimolazione CPG in vitro. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di rompere le ossa e mescolare delicatamente il midollo osseo rilasciato per preservare la vitalità cellulare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento dell'RNA o la coltura e la stimolazione in vitro, per rispondere a ulteriori domande sull'espressione genica o sulla funzione delle popolazioni cellulari arricchite.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori della PDC per esplorare il ruolo di questa potente cellula nello sviluppo del lupus e dei modelli murini inclini al lupus. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare una popolazione di PDC altamente purificata dal midollo osseo di topi inclini al lupus.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per l'isolamento di cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) dal midollo osseo di topi predisposti al lupus mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza. Il metodo mira a ottenere un'elevata purezza per successivi studi funzionali delle pDC.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Autoimmunità
Sfondo
- I dendritici plasmacitoidi sono cruciali per le risposte immunitarie.
- Producono interferone alfa, in particolare durante la progressione del lupus.
- L'isolamento ad alta purezza è essenziale per un'analisi funzionale accurata.
- Il sorting cellulare attivato da fluorescenza offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali.
Scopo dello studio
- Isolare le pDC da topi predisposti al lupus.
- Studiare le caratteristiche funzionali delle pDC.
- Migliorare la comprensione del comportamento delle cellule immunitarie nel lupus.
Metodi Utilizzati
- Prelevare il midollo osseo da topi predisposti al lupus.
- Utilizzare il sorting cellulare attivato da fluorescenza per l'isolamento.
- Preparare il mezzo completo per l'elaborazione cellulare.
- Frantumare le ossa per rilasciare le cellule da sottoporre a sorting.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di pDC con elevata purezza.
- Migliore comprensione della funzione delle pDC nel lupus.
- Dimostrati i vantaggi del sorting cellulare attivato da fluorescenza.
- Fornito un protocollo affidabile per studi futuri.
Conclusioni
- Il protocollo isola in modo efficace le pDC per studi funzionali.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della patologia del lupus.
- La ricerca futura può basarsi su questa metodologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di popolazioni rare di cellule immunitarie con elevata purezza è fondamentale per la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione degli obiettivi e nello sviluppo di modelli preclinici. La citometria a flusso attivata da fluorescenza (FACS) consente una separazione fenotipica precisa delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topi predisposti al lupus, favorendo saggi funzionali affidabili e la scoperta di biomarcatori traslazionali. Questo approccio riduce il rumore biologico nelle fasi iniziali della scoperta, migliorando l'affidabilità predittiva nei test successivi delle ipotesi terapeutiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi della funzione delle cellule dendritiche plasmocitoidi nella patogenesi del lupus, isolando una popolazione pura per studi sulla produzione di interferone alfa.
- Valore operativo: Raggiunge una purezza fino al 96,4% dopo il sorting, superando significativamente le alternative basate sul magnetic-activated cell sorting.
- Valore strategico: Favorisce la fiducia nei target riducendo l'eterogeneità cellulare nei risultati funzionali, supportando decisioni di avanzamento o interruzione negli screening di immunomodulatori.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera cellule dendritiche plasmacitoidi purificate adatte a saggi di stimolazione in vitro, come la misurazione dell'interferone alfa indotta da CpG.
- Valore operativo: Consente la separazione simultanea di diverse popolazioni cellulari, aumentando la produttività sperimentale e la standardizzazione dei saggi.
- Valore strategico: Fornisce un input riproducibile per flussi di screening, permettendo una valutazione affidabile di composti rispetto a fenotipi immunitari definiti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce un sistema rilevante per la malattia, utilizzando modelli murini predisposti al lupus per studiare il contributo delle cellule dendritiche plasmocitoidi all'autoimmunità.
- Valore operativo: Le cellule isolate rimangono funzionalmente normali e capaci di produrre interferone alfa dopo stimolazione, confermando la prontezza per saggi funzionali.
- Valore strategico: Favorisce una continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica, fornendo cellule primarie ben caratterizzate per studi sul meccanismo d'azione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta, supportando la validazione precoce del bersaglio mediante screening fenotipico e consentendo l'identificazione di composti promettenti attraverso letture funzionali in cellule immunitarie purificate.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi isolando le cellule dendritiche plasmacitoidi per chiarire il loro ruolo nella patologia del lupus mediata dagli interferoni.
- Screening: Fornisce popolazioni cellulari standardizzate e ad alta purezza per saggi funzionali riproducibili e screening di composti.
- Analisi: Permette misurazioni quantitative di variabili dipendenti come la produzione di citochine, i risultati della citometria a flusso e la valutazione della purezza mediante gating in base allo scattering anteriore/laterale.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'uso di topi predisposti al lupus, in linea con la riduzione del rischio meccanicistica nei modelli di malattie autoimmuni.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per l'isolamento di cellule immunitarie rare in diversi progetti di immunologia e autoimmunità.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica negli studi sulla funzione delle cellule immunitarie.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante strategie di gating definite e controlli di compensazione.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nello sviluppo di immunomodulatori.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio basata su dati preclinici affidabili ottenuti da popolazioni cellulari purificate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in citometria a flusso, colorazione cellulare e controlli di compensazione per una corretta selezione cellulare attivata da fluorescenza.
- Dipende da strumentazioni quali citometri a flusso, apparecchiature per il sorting e sistemi di centrifugazione per l'elaborazione del midollo osseo.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra gruppi di lavoro riguardo a pannelli di anticorpi, strategie di gating e protocolli di sorting tra gruppi di immunologia e sviluppo di saggi.
- Comporta considerazioni di adattamento nell'applicare il protocollo ad altri sistemi modello o fonti tissutali diverse dal midollo osseo murino.
- Include limitazioni pratiche, come la necessità di una rottura delicata del midollo osseo per preservare la vitalità cellulare e la natura laboriosa della purificazione in più passaggi.
