Acquose goccioline utilizzate come microreattori enzimatica e loro attuazione elettromagnetica
28 agosto 2017
Sistemi di laboratorio-in-a-goccia reazione consentono l'implementazione versatile di reazioni complesse in una scala di microfluidica. Una piattaforma di azionamento automatico costituito da una matrice 3 x 3 di bobine elettromagnetiche è stata sviluppata e utilizzato con successo per Unione due 10 µ l microreattori e quindi avvia una reazione enzimatica nei marmi liquidi risultante.
Lo scopo generale di questo dispositivo è quello di fornire una nuova tecnologia di piattaforma microfluidica che realizzi reazioni a cascata automatizzate in piccole goccioline acquose. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia sintetica riproducendo sequenze di reazione di microrganismi eseguendo sequenze di reazioni complesse con enzimi e screening di nuovi catalizzatori. Il vantaggio principale del nostro approccio lab-in-a-drop è che è molto adattabile.
A differenza dei chip microfluidici basati su canali, l'unico prerequisito è un ambiente di reazione idrofila. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle reazioni enzimatiche, può essere applicato anche ad altri sistemi, come i catalizzatori inorganici o l'incordatura di leganti. L'idea di questo metodo è nata quando ho cercato di progettare un dispositivo microfluidico con separazione integrata del prodotto, ma senza un complesso sistema di valvole e separatori.
Spostando la soluzione di reazione sotto forma di gocciolina, il controllo della reazione diventa molto semplice. Innanzitutto, progetta in 3D i corpi della bobina. Quindi, utilizzare una bobinatrice per avvolgere i corpi con un filo di rame da 08 millimetri 45 volte ciascuno.
Posiziona un elemento Peltier su una tavola elettrica. Avvitare il primo strato di bobine sull'elemento Peltier per formare un quadrato. Quindi, fissa il secondo strato di bobine sulla parte superiore con il telaio in plastica stampato in 3D o altro materiale non conduttivo.
Collegare la scheda elettrica al magnete di comando con un cavo a nastro. Inserire i magneti al neodimio nelle bobine. Posizionare un vetro di quarzo spesso un millimetro o una lastra di plastica sopra la matrice della bobina.
Fissare il coperchio in posizione con le viti per completare il montaggio della piattaforma di azionamento. Per iniziare la sintesi delle nanoparticelle in atmosfera inerte, sospendere prima 85 grammi di cloruro di ferro (III) esaidrato e 3 grammi di cloruro di ferro (II) tetraidrato in 200 millilitri di una soluzione acqua-etanolo quattro a uno. Quindi, aggiungere 0,2 millilitri di PFOTES e mescolare la miscela a 500 giri/min con un'ancoretta magnetica.
Aggiungere 1,5 molari di idrossido di ammonio alla miscela per ottenere un pH di 8,0. E poi continuare ad agitare la soluzione per 24 ore per ottenere le nanoparticelle magnetiche idrofobiche. Fissare una barra magnetica con una forza di attrazione di 25 kg sul fondo del pallone di reazione.
Versare la soluzione e lavare le particelle tre volte con una soluzione acqua-etanolo quattro a una. Rimuovere il magnete e asciugare le particelle a 60 gradi Celsius per 24 ore. Caratterizzare le particelle con la microscopia elettronica a scansione.
Preparare una soluzione di 0,1 microgrammi per millilitro di perossidasi di rafano in tampone fosfato di potassio a pH 0,1 molare 6,5 con perossido di idrogeno 10 millimolare. Quindi, preparare una soluzione 20-micromolare della sonda fluorescente 10-acetil-3, 7-diidrossifenossazina in tampone fosfato di potassio. Quindi, macinare delicatamente le nanoparticelle secche usando un mortaio di vetro e un pestello.
Trasferire le particelle in un piatto di pesata in polistirene e aggiungere 10 microlitri della soluzione di perossidasi. Far roteare delicatamente la padella per circa 10 secondi per ottenere l'autoassemblaggio delle nanoparticelle attorno alla soluzione di perossidasi. Trasferire questo microreattore sulla piattaforma di attuazione.
Ripetere questo processo con 10 microlitri della soluzione della sonda fluorescente e posizionare il secondo microreattore sulla piattaforma. Conservare le particelle rimanenti a temperatura ambiente. Utilizzare l'elemento Peltier per mantenere le soluzioni di reazione nei microreattori a 25 gradi Celsius.
Monta un microscopio a fluorescenza a circa 10 millimetri sopra i microreattori e collega il microscopio a un computer. Utilizzando il controllo del magnete, attivare i magneti e ruotare per posizionare il microreattore della soluzione della sonda fluorescente sotto il microscopio. Accendere la spia di eccitazione.
Sollevare il magnete della bobina per aprire il microreattore e iniziare a registrare l'immagine della microscopia a fluorescenza. Dopo due-cinque secondi, abbassare il magnete per chiudere il microreattore. Quindi, utilizzare il controllo magnetico per spostare il microreattore perossidasi adiacente al microreattore a fluorescenza.
Aprire il microreattore a sonda fluorescente. Il microreattore perossidasi viene aspirato nel microreattore della sonda e aperto, avviando la reazione. Monitorare la reazione mediante microscopia a fluorescenza, aprendo e chiudendo il microreattore unito, se necessario.
I microreattori sono stati creati codificando goccioline di soluzione con nanoparticelle di ferro idrofobiche. Questi microreattori possono essere spostati, aperti, chiusi e uniti mediante la manipolazione di magneti al neodimio sotto una piattaforma di attuazione. La piattaforma di attuazione può anche essere costruita con anime in ferro nei corpi della bobina.
Ciò fornisce una forza magnetica sufficiente per spostare un microreattore di oltre 10 millimetri, ma è insufficiente per aprire il microreattore. Pertanto, un magnete al neodimio deve essere utilizzato per eseguire reazioni in piccoli volumi di soluzione. È stata eseguita una reazione enzimatica rappresentativa tra una perossidasi e un'etichetta fluorescente e monitorata mediante microscopia fluorescente.
La cinetica menzionata da Michaelis osservata durante la reazione concorda bene con i valori della letteratura, indicando che la configurazione del microreattore non influenza l'andamento della reazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare microparticelle idrofobiche e generare microgoccioline acquose con esse. La tecnologia della piattaforma può essere utilizzata per il controllo automatico della reazione mediante fusione di gocce.
Inoltre, singoli microreattori riempiti con substrato possono essere spostati sopra piccole zone superficiali con enzimi mobilizzati. L'utilizzo di più zone di immobilizzazione con enzimi diversi consente una cascata di reazioni sequenziali con prodotti trasportabili e immediati. Lo sviluppo di questo prototipo è solo l'inizio.
Attualmente, stiamo implementando un sistema di distribuzione automatizzato sopra la piattaforma di reazione per riporre gli enzimi immobilizzati in qualsiasi posizione. La matrice della bobina verrà aumentata a 10 volte 10 posizioni. Questa tecnica può aprire la strada alla pianificazione e all'esecuzione computerizzata di sequenze di reazioni biochimiche.
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Panoramica
Questo studio presenta una nuova tecnologia di piattaforma microfluidica progettata per reazioni a cascata automatizzate in piccole goccioline acquose. L'approccio lab-in-a-drop consente un'implementazione versatile di reazioni complesse, permettendo di acquisire informazioni sui processi enzimatici e su altri sistemi.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Microfluidica
- Biologia sintetica
- Reazioni enzimatiche
Contesto
- I sistemi microfluidici utilizzano tradizionalmente design basati su canali.
- I sistemi lab-in-a-drop offrono un ambiente di reazione più adattabile.
- Le piattaforme automatizzate possono migliorare l'efficienza e la complessità della reazione.
- Le intuizioni di questa ricerca potrebbero far progredire le applicazioni di biologia sintetica.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare una piattaforma microfluidica per reazioni a cascata automatizzate.
- Riprodurre sequenze di reazioni complesse simili a quelle nei microrganismi.
- Selezionare nuovi catalizzatori e migliorare la comprensione delle reazioni enzimatiche.
Metodi utilizzati
- Sviluppo di una piattaforma di azionamento automatizzata con bobine elettromagnetiche.
- Fusione di microreattori per avviare reazioni enzimatiche.
- Utilizzo di ambienti idrofili per facilitare la reazione.
- Adattamento del metodo per vari sistemi catalitici.
Principali risultati
- Fusione di successo dei microreattori per creare marmi liquidi.
- Adattabilità dimostrata dell'approccio lab-in-a-drop.
- Possibili applicazioni oltre le reazioni enzimatiche, inclusi catalizzatori inorganici.
- Intuizioni acquisite che potrebbero informare future ricerche in biologia sintetica.
Conclusioni
- Il metodo lab-in-a-drop fornisce una piattaforma flessibile per reazioni complesse.
- Questa tecnologia potrebbe avere un impatto significativo sulla biologia sintetica e sullo screening dei catalizzatori.
- L'ulteriore esplorazione di questo metodo potrebbe portare a innovazioni in vari campi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Automated microreactor platforms using aqueous droplets enable programmable, multiplexed enzymatic and catalytic reactions at microscale volumes. This technology addresses the need for flexible, channel-free microfluidic systems that support rapid hypothesis testing and high-throughput screening in early discovery. Its adaptability and automation potential position it as a reusable capability for synthetic biology, catalyst evaluation, and mechanistic de-risking across the R&D pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of enzymatic pathways and substrate specificity in a controlled, miniaturized environment.
- Supports biological de-risking by allowing rapid, parallel testing of reaction sequences and catalyst candidates.
- Facilitates predictive confidence in target selection through quantitative, real-time monitoring of reaction kinetics.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microreactor systems for downstream compound or catalyst screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible assay conditions by automating droplet manipulation and merging.
- Enables scalable, multiplexed screening with minimal reagent consumption and high data density.
- Supports reliable evaluation of enzyme activity and substrate conversion via fluorescence readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant enzymatic pathways for translational biomarker exploration when appropriate substrates are used.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting sequential reaction cascades and product tracking.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by enabling precise control over reaction initiation and monitoring.
Pipeline & Workflow Integration
This microreactor platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical mechanistic studies, supporting hypothesis-driven research and rapid iteration.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling programmable reaction sequences in droplets.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible microreactors for high-throughput evaluation of enzymes, substrates, or catalysts.
- Analytics: Delivers quantitative fluorescence measurements and kinetic data for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports alignment with disease-relevant enzymatic processes when integrated with appropriate biological substrates.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, scalable platform adaptable to diverse reaction types and screening needs across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by enabling controlled, multiplexed reaction analysis.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability through automated droplet actuation and merging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing reagent use and enabling rapid data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates through robust mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, magnetic actuation, and fluorescence analytics.
- Needs access to 3D printing, coil winding, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of droplet preparation and actuation protocols.
- Adaptable to various model systems, but optimization may be needed for different enzyme or substrate classes.
- Practical limitations include the need for hydrophobic surfaces and precise magnetic control for reliable droplet manipulation.
