Name: Visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Impara a visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi utilizzando la microscopia confocale con cellule DC 2.4. Questo metodo permette di monitorare in tempo reale l'ingresso dei patogeni nelle cellule ospiti.

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Ringraziamo Wendy salmone e Nicki Watson della struttura Keck al Whitehead Institute del MIT per l&#39;imaging.

1. Preparazione di DC2.4 e RAW 264.7 cellule Lines NOTA: La linea cellulare di macrofagi come RAW 264.7 e la linea di cellule dendritiche DC2.4 sono sia di origine murina, e le seguenti condizioni sono stati usati per far crescere le cellule. <ol><li> Grow RAW 264.7 cellule in DMEM (Minimal mezzo di Eagle Dulbecco) supplementato con 10% inattivato siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2. </li><li> Crescere le cellule DC2.4 in condizioni simili a quello di RAW 264.7 cellule, tranne l&#39;uso di media RPMI (Roswell Park Memorial Institute) integrata con L-glutammina, invece di DMEM. </li></ol> 2. Preparazione di coniugati fluorescenti Particolato: Beads C. albicans, Zymosan, IgG-rivestite <ol><li> Crescere Candida albicans <ol><li> Seminare C. albicans ceppo SC5314 da uno stock di glicerolo congelato in 25 ml di YPD integrato con Uri (2% Bacto-peptone, 1%estratto di lievito, 2% di glucosio e 80 ug / ml di uridina) notte a 30 ° C. NOTA: Evitare che cresce la cultura Candida più di un OD 600 del 12. </li><li> Prendere 1 ml di C. albicans e spin giù a 2.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet con 1 ml di PBS. </li><li> Raccogliere il pellet per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Ripetere il punto 2.1.4. </li><li> Calcolare la molteplicità di infezione (MOI) di C. albicans in relazione al numero dei fagociti e procedere con il test fagocitosi come descritto nella sezione 3. Una OD 600 del 1 è equivalente a 2,5 x 10 7 Candida albicans per 1 ml. NOTA: Generazione di Candida-BFP è descritto in riferimento 13. </li></ol></li><li> Preparazione di Zymosan e perline IgG-rivestite NOTA: Zymosan è un β-glucano contenentifungine preparazione carboidrati particolato derivato da Saccharomyces cerevisiae. Zymosan è noto per evocare segnali infiammatori in macrofagi e cellule dendritiche, ed è stato ampiamente utilizzato in studi fagocitosi 13, 14, 15. <ol><li> Brevemente vortice la provetta contenente il particolato, e un&#39;aliquota una quantità sufficiente per un esperimento in una provetta da 1,5 ml. NOTA: in genere usiamo rapporto 1:10 (per una cella, aggiungere 10 particelle zymosan o perline IgG-rivestite). </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS freddo ghiaccio, e raccogliere le particelle mediante centrifugazione per 1 min a 10.000 x g. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS ghiacciato. </li><li> Ripetere i punti 2.2.2-2.2.3 NOTA: Passare al punto 2.2.5 o conservare il tubo a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Sonicare particolato per 10 sec a ultrasuoni bagno sonicatore (120 V, 50-60 kHz) per evitare unaggregazione delle particelle NY. </li></ol></li></ol> 3. fagocitosi NOTA: La fagocitosi è un processo complesso che inizia con il legame delle particelle sulla superficie cellulare dei fagociti attraverso l&#39;interazione di PRRs con ligandi sulla superficie della particella. Binding è seguito dal montaggio di actina e le sue proteine ​​associate al sito di contatto, e la formazione di una tazza fagocitaria. Il successivo smontaggio actina avviene al phagosome e provoca la engulfment completo del particolato. Di seguito si descrivono le varie fasi della fagocitosi. <ol><li> binding Assay NOTA: Lo scopo di questo esperimento è quello di monitorare il primo passo di fagocitosi che coinvolge l&#39;interazione tra i ligandi sulle particelle indicativi ei recettori sulle fagociti. <ol><li> Seme circa 5 x 10 4 cellule in una diapositiva camera in modo che siano il 60-70% confluenti al momento dell&#39;esperimento. Alterntivamente, le cellule piastra su vetrini (in 24 o formato a 12 pozzetti) o piastre a 96 pozzetti con fondo di vetro. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2. NOTA: Le cellule possono essere contate con emocitometro o una tecnica simile. </li><li> Posizionare il vetrino camera (o piastra) a 10 ° C per 10 min. </li><li> Rimuovere delicatamente il supporto da ciascun pozzetto con una pipetta o di aspirazione. ATTENZIONE: Eseguire questo passaggio attentamente ciascun pozzetto di un sistema coprioggetti camerata è piccolo; è facile per perturbare le cellule con la punta di una pipetta o un forte flusso d&#39;aria di un aspiratore. </li><li> Mescolare le polveri fluorescente con un mezzo di coltura cellulare (preparato come descritto sopra). Aggiungere Candida -BFP (ad una MOI di 10), fluorescenza coniugato-zymosan o lattice perline-rabbit IgG-FITC (10 particelle per cella) alle cellule. Utilizzare un volume finale di 200 microlitri mezzi per una camera bene a garantire tutte le cellule sono coperti. </li><li> Spin giù la diapositiva da camera presso 277xg per 3 min a 10 ° C. NOTA: Questo passaggio centrifugazione contribuisce ad aumentare il contatto tra le particelle e le cellule, e sincronizza il processo di associazione. </li><li> Trasferire immediatamente il vetrino camera ad un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2 per 5 min. </li><li> Rimuovere il vetrino da camera dal termostato e aspirare i media. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con PBS ghiacciato. NOTA: controllare la presenza di particelle non legate con un microscopio ottico e lavare più volte con PBS, se necessario. È essenziale per rimuovere le particelle non legate dal pozzo per minimizzare il rumore di fondo durante l&#39;analisi. </li><li> Fissare cellule aggiungendo 500 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) diluito in PBS incubando per 30 minuti a temperatura ambiente. ATTENZIONE: Questo passaggio richiede l&#39;utilizzo di PFA 4% che è altamente tossico, corrosivo, e il potenziale carcinogeno. Una corretta si deve usare cautela quando si usa questo liquido. Inoltre, proteggere i campioni dalla luce. </li><li&gt; Lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 500 ml di PBS nella camera e aspirare lentamente la soluzione. </li><li> Ripetere 3.1.9 passo due volte. NOTA: A questo punto, riempire ogni flacone immediatamente dopo la rimozione della precedente PBS. </li><li> Arrestare il fissaggio mediante incubazione con 500 pl di 50 mM NH 4 Cl in PBS per 10 min. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS come descritto al punto 3.1.10. </li><li> Permeabilize cellule aggiungendo 250 microlitri tampone di legame (0,1% saponina, 0,2% BSA in PBS) per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Stain F-actina aggiungendo fluorescente falloidina coniugato (diluito 1: 500 in tampone vincolante). Incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule tre volte con PBS come descritto al punto 3.1.10. </li><li> Catturare immagini utilizzando un microscopio confocale (obiettivo 63X e 402 nm e 488 nm laser) e analizzare le immagini utilizzando ImageJ 16. NOTA: legame Una particella successo è caratterizzato dalla presenza di un cu fagocitariap nel luogo dove il contatto particolato cellula fagocitica (Figura 1). Vedere il punto 3.2.5. </li></ol></li><li> Fagocitosi assorbimento Assay NOTA: Questo esperimento è stato progettato per monitorare l&#39;internalizzazione completa di particelle etichettate fluorescenza dai fagociti utilizzando la microscopia confocale (Figura 2). <ol><li> Seme circa 5 x 10 4 cellule in una diapositiva camera in modo che siano il 60-70% confluenti al momento dell&#39;esperimento. In alternativa, le cellule piastra su vetrini (in 24 o formato a 12 pozzetti) o piastre a 96 pozzetti con fondo di vetro. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2. NOTA: Le cellule possono essere contate con emocitometro o una tecnica simile. </li><li> Conservare le diapositive camera (o piastra) a 10 ° C per 10 min. NOTA: raffreddamento è necessario al fine di bloccare l&#39;endocitosi e fagocitosi indesiderate, e successivamente ad una fagocitosi sincronizzato. </li><li> Perfpassi ORM da 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> Trasferire il vetrino camera ad una 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2, e incubare per diversi tempi. Fix cellule dopo l&#39;infezione 30, 60 e 90 min dopo. Osservare C. albicans iniziano a formarsi ife a livello post infezione 60 min; fagociti cominciano a mostrare la morte cellulare (pyroptosis) dopo 90 min 8. NOTA: Questa è una raccomandazione e ottimizzazione è essenziale a seconda del tipo di cellula e del particolato utilizzato. </li><li> Eseguire i passaggi da 3.1.7 a 3.1.15. Analizzare le immagini utilizzando ImageJ 16. NOTA: un assorbimento successo è caratterizzato da una interiorizzazione completa di particolato all&#39;interno del citoplasma di un fagociti (Figura 2). Colorazione fagociti con pennarello superficie cellulare come falloidina contribuisce a delineare il contorno delle cellule. È anche essenziale per eseguire z-stack per determinare se il particolato è destinata a superficie cellulare o completely interiorizzato. </li></ol></li><li> Immagini dal vivo della fagocitosi NOTA: In questo protocollo si descrive l&#39;utilizzo di microscopia confocale per catturare le diverse fasi della fagocitosi utilizzando zymosan fluorescente coniugato. Usiamo la linea di cellule dendritiche DC2.4 che esprime stabilmente mCherry-tag F-actina 8, un biosensore che mostra la distribuzione di actina filamentosa nelle cellule viventi. Poiché fagocitosi è un processo actina-driven vivo imaging in questa cella non solo permette di catturare il movimento e la dinamica di rete F-actina, ma anche di visualizzare i diversi eventi fagociti all&#39;interno delle cellule viventi (Figura 3, Film 1). <ol><li> Seme circa 5 x 10 4 cellule in una diapositiva camera ad una concentrazione in modo che siano il 60-70% confluenti al momento dell&#39;esperimento. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2. NOTA: Le cellule possono essere contate con emocitometro o untecnica simile. </li><li> Mantenere i vetrini camera su ghiaccio per 10 min. NOTA: raffreddamento è necessario per bloccare l&#39;assorbimento indesiderato, e di avere una fagocitosi sincronizzato. </li><li> Eseguire i passaggi da 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> Pre-riscaldare la fase di microscopio a 37 ° C ed equilibrare la camera con 5% di CO 2. Attendere 30-45 min per la temperatura e la CO 2 si stabilizzi prima di iniziare l&#39;imaging. NOTA: Poiché i CO 2 e temperatura livelli sono critici per la fagocitosi, è importante accendere il riscaldamento del microscopio prima dell&#39;esperimento per equilibrare la camera ambientale. </li><li> Posizionare il vetrino camera contenente le cellule nel contenitore microscopio incubatore equilibrata a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Esibirsi dal vivo di immagini 17, 18. NOTA: Le impostazioni per la potenza del laser (guadagno, pinhole, ecc) può variare a seconda del tipo di the microscopio e sonda fluorescente utilizzati. Pertanto, si consiglia di consultare il manuale del microscopio per la condizione ottimale per la vostra imaging dal vivo 17,18. <ol><li> Utilizzare microscopio confocale a scansione laser (e il relativo software) per l&#39;imaging dal vivo. Utilizzare obiettivo olio 63X 1.4NA con un foro stenopeico di 1-1.1 unità Airy. </li><li> Per avviare l&#39;imaging utilizzato il campo luminoso di trovare una regione rappresentante sul vetrino da camera. Avanti, selezionare il campo facendo clic sull&#39;opzione Posizione sulla software. Per rilevare GFP nella pista 1 usato il set di filtri per 488 nm laser con un divisore di fascio a 582 nm, per rilevare le lunghezze d&#39;onda tra 488 e 582 nm. </li><li> In Pista 2 selezionare un filtro set ottimale per mCherry (RFP) utilizzando un divisore di fascio a 578 nm e rilevare le lunghezze d&#39;onda tra 578 e 600 nm. Utilizzare 488 nm e 578 nm laser con il 50% di potenza laser e un&#39;uscita guadagno di 600-700. Ottenere immagini ogni 30 secondi per un totale di 90 min. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

fagociti professionali, come i macrofagi e le cellule dendritiche, inghiottire e di eliminare gli agenti patogeni d&#39;invasione rendendo quindi la fagocitosi una componente importante del sistema di difesa dell&#39;ospite. Durante questo processo fagociti vengono sottoposti a riorganizzazione membrana e riarrangiamento citoscheletro alla loro superficie cellulare 8, 19, 20. Per comprendere meglio questo processo dinamico, vis...

Nonostante la continua esposizione agli agenti patogeni come batteri, virus e funghi, il nostro corpo è ben attrezzata con sistema immunitario che forniscono protezione contro le infezioni. Il sistema immunitario innato è la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni invasori e si basa principalmente su fagociti che riconoscono e interiorizzano obiettivi stranieri. La fagocitosi è un processo cellulare evolutivamente conservato che racchiude il engulfment di particelle indesiderate superiori a 0,5 micron. Fagociti esprimono una vasta gamma di recettori del sistema immunitario (noto anche come recettori pattern recognition, PRR) sulla superficie delle cellule che consentono loro di riconoscere i modelli molecolari associati ai patogeni (PAMPs) presenti sul patogeni prima di engulfment 3. Il legame patogeni è seguito da recettore cluster sulla superficie cellulare e innesca la formazione di una tazza fagocitaria. Ciò si traduce in rimodellamento della membrana actina-driven che sporge in girol&#39;obiettivo, alla fine avvolge e pizzicando-off per formare una discreta phagosomal vacuolo 2, 5. Il phagosome matura poi e acidifica con la successiva fusione con ritardo endosomi e lisosomi che forma fagolisosoma 6. Anche se la fagocitosi è descritto come recettore-mediata e actina-event driven, questo processo si basa anche sulla modifica spazio-temporale dei lipidi che compongono la membrana plasmatica, come fosfoinositidi (PI) e sfingolipidi 7, 8. Mentre polimerizzazione actina è dettato da un accumulo locale fosfoinositolo-4,5-bisfosfato (PI (4,5) P 2) alla base della coppa fagocitica, actina depolimerizzazione dipende dalla conversione di (PI (4,5) P 2 a fosfoinositolo-3,4,5-biphosphate (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Entrambe le modifichesono essenziali come la prima porta a un&#39;estensione di successo del pseudopodi intorno al bersaglio e la Quest&#39;ultimo consente affondamento di particelle nel citoplasma della fagocita 10. Le cellule che hanno la capacità di fagocitare sono o fagociti professionali, come macrofagi / monociti, granulociti neutrofili /, e le cellule dendritiche (DC) o fagociti non professionisti, come fibroblasti e cellule epiteliali 11. Fagocitosi eseguita da tutti i fagociti svolge un ruolo centrale nel mantenimento dei tessuti e rimodellamento, mentre la fagocitosi eseguita da fagociti professionali è responsabile del coordinamento della risposta immunitaria innata e adattiva contro gli agenti patogeni. fagociti professionali non si limitano a fagocitare e uccidere l&#39;agente patogeno, ma anche antigeni presenti alle cellule linfoidi del sistema immunitario adattativo. Ciò contribuisce al rilascio di citochine pro-infiammatorie e ad assunzione di cellule linfoidi, dunque ail successo blocco di infezione 12. tecniche biochimiche convenzionali sono state fondamentali per acquisire conoscenze per quanto riguarda il meccanismo molecolare di diversi processi cellulari durante la fagocitosi, come modificazioni post-traslazionali e varie associazioni ad alta affinità tra proteine. Tuttavia, è difficile ottenere informazioni sulle dinamiche spaziali e temporali di eventi fagocitarie utilizzando i metodi biochimici convenzionali. l&#39;imaging cellulare dal vivo non solo ci consente di monitorare eventi cellulari in modo sensibile il tempo, ma anche ci permette di ottenere informazioni a livello di singola cellula. Qui si descrive un metodo per investigare le diverse fasi della fagocitosi, nonché di analizzare l&#39;intero processo spatiotemporally usando la microscopia confocale.

<table><tbody><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare&nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dilattato)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Minimal Eagle' </td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Perle di lattice rivestite di IgG accoppiate a FITC</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide (4% in PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td><td></td></tr><tr><td>Falloidina-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264,7 celle</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano (0,4% (p/v) in PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (1x) (0,05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps Soluzione detergente</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; 85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di copertura in borosilicato camerato 1.0 (8 camere)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino in vetro 10 con griglie</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Il corpo dei mammiferi è dotata di vari strati di meccanismi che contribuiscono a difendersi dalle invasioni patogeni. Fagociti professionali del sistema immunitario - come i neutrofili, cellule dendritiche e macrofagi - mantengono la capacità innata di rilevare ed eliminare tali patogeni attraverso fagocitosi 1. La fagocitosi coinvolge eventi coreografia di riorganizzazione della membrana e actina rimodellamento sulla superficie delle cellule 2, 3. I fagociti interiorizzare con successo e sradicare molecole estranee solo quando sono soddisfatte tutte le fasi della fagocitosi. Questi passaggi includono il riconoscimento e vincolante del patogeno dai recettori pattern recognition (PRR) che risiede sulla superficie cellulare, formazione di tazza di fagocitosi attraverso actina-arricchito sporgenze membranose (pseudopodi) a circondare il particolato, e scissione della phagosome seguito da phagolysosome maturazione che risultati dellauccidendo del patogeno 3, 4. Imaging e quantificazione delle varie fasi della fagocitosi è strumentale per chiarire i meccanismi molecolari di questo processo cellulare. La presente manoscritto riporta metodi per studiare le diverse fasi della fagocitosi. Descriviamo un approccio microscopio-based per visualizzare e quantificare la formazione coppa fagocitica vincolante, e l&#39;interiorizzazione di particolato dai fagociti. Come si verifica quando la fagocitosi recettori innate su fagociti incontrano ligandi su una particella bersaglio più grande di 0,5 micron, le analisi che presentiamo qui comprendono l&#39;uso di patogeni funghi Candida albicans e altre particelle, come zymosan e perline IgG-rivestite.

Metodo Microscopio a base di monitorare le diverse fasi della fagocitosi è presentato. Vengono visualizzati i diversi eventi durante la fagocitosi delle varie particelle fluorescenti da parte delle cellule DC2.4. Utilizzando le tecniche qui descritte, abbiamo studiato il ruolo degli sfingolipidi nelle prime fasi della fagocitosi. A questo scopo, DC2.4 cellule dendritiche geneticamente carenti di Sptlc2, l'enzima che catalizza la prima e limitante passo nella via di biosintesi degli sfingolipidi, sono stati utilizzati. R...

Qui descriviamo una tecnica basata sul microscopio per visualizzare e quantificare le prime cascate di eventi durante la fagocitosi di agenti patogeni come i funghi Candida albicans e particolati che sono più grandi di 0,5 μm, inclusi zimosani e perle rivestite di IgG.

Visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

L'obiettivo principale di questa tecnica è quello di monitorare le diverse fasi della fagocitosi utilizzando un microscopio confocale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle interazioni tra patogeni. Principalmente per capire come gli agenti patogeni entrano nelle cellule ospiti durante l'infezione.Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice e ci consente di ottenere informazioni sulla cellula virale dei nostri eventi che si verificano durante la fagocitosi in modo sensibile al tempo. Per iniziare, preparare lo zimoso coniugato fluorescente come descritto nel protocollo di testo allegato. Il giorno precedente, seminare circa cinque volte 10 alla quarta cella DC 2.4 in un vetrino da camera, in modo che i pozzetti siano confluenti dal 60 al 70% al momento dell'esperimento.Una volta che le celle hanno raggiunto la densità corretta, posizionare il vetrino della camera a 10 gradi Celsius per 10 minuti. Il raffreddamento delle cellule è necessario per bloccare l'endocitosi e quando attivare la citosi. E successivamente di avere una fagocitosi sincronizzata.Quindi rimuovere delicatamente il terreno da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta o un aspiratore. Quindi, mescolare lo zimoso coniugato fluorescente con il terreno di coltura cellulare a una molteplicità di un'infezione di 10. Quindi, aggiungi 500 microlitri di terreno in ogni camera per assicurarti che tutte le celle siano coperte.Quindi ruotare il vetrino della camera per aumentare i contatti tra le particelle nelle celle e sincronizzare il processo di legame. Dopo la centrifugazione, trasferire il vetrino della camera in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, rimuovere il vetrino della camera dall'incubatrice e aspirare il terreno.Quindi, lavare le celle tre volte con PBS ghiacciato. Dopo il lavaggio finale, verificare la presenza di particelle non legate con un microscopio ottico ed eseguire ulteriori lavaggi se necessario. È essenziale rimuovere le particelle non legate dai pozzetti per ridurre al minimo il rumore di fondo durante l'analisi.Quindi, fissare le cellule aggiungendo 500 microlitri di paraformaldeide al quattro percento in PBS ai pozzetti e incubandole per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver fissato le cellule, lavarle aggiungendo 500 microlitri di PBS in ogni camera e poi aspirando delicatamente la soluzione. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte.Dopo il terzo ciclo di lavaggio, interrompere la reazione aggiungendo 500 microlitri di cloruro di ammonio 50 millimolare in PBS alle cellule e incubandole per 10 minuti. Quindi, lavare le celle in 500 microlitri di PBS a temperatura ambiente. Successivamente, permeabilizzare le cellule aggiungendo 500 microlitri di tampone legante a ciascun pozzetto e incubando le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente.Il passo successivo consiste nel colorare la F-actina aggiungendo falloidina coniugata fluorescente alle cellule e incubandole per un'ora a temperatura ambiente. Quindi lavare le cellule tre volte con 500 microlitri di PBS. Infine, acquisisci le immagini utilizzando un microscopio confocale e analizza le immagini utilizzando ImageJ.Per misurare l'assorbimento dello zimosano, preparare vetrini da camera con cellule come mostrato nel saggio di legame. Dopo le fasi di raffreddamento ed etichettatura, trasferire il vetrino della camera su un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il cinque percento di CO2. E incubare le cellule per diversi punti temporali.Ripara le cellule dopo 30, 60 e 90 minuti dopo l'infezione. Assicurati di ottimizzare questi punti temporali in base al rispettivo tipo di cella e alle particelle fluorescenti utilizzate. Quindi, analizza le immagini utilizzando ImageJ.Il successo dell'assorbimento è caratterizzato da una completa internalizzazione di un particolato all'interno del citoplasma di un fagocita. Per iniziare, preparare una camera ambientale per microscopio riscaldandola a 37 gradi Celsius ed equilibrando la camera con il 5% di CO2. Attendere da 30 a 45 minuti affinché la temperatura e la CO2 si stabilizzino prima di eseguire l'imaging.Vedere la CO2 e i livelli di temperatura sono fondamentali per la fagocitosi, così come è importante accendere il riscaldatore del microscopio prima dell'esperimento per equilibrare l'ambiente di quella camera. Successivamente, preparare i vetrini della camera con cellule DC 2.4 che stabilizzano l'espressione di F-actina di mCherry come mostrato nel saggio di legame. Dopo le fasi di tubazione ed etichettatura, trasferire il vetrino della camera dalla centrifuga direttamente su un tavolino da microscopio preriscaldato.Infine, eseguire l'imaging dal vivo utilizzando un microscopio a scansione laser confocale come descritto nel protocollo di testo allegato, non solo per catturare il movimento e la dinamica della rete di F-actina, ma anche per visualizzare i diversi eventi fagocitici all'interno delle cellule viventi. Le cellule mostrate qui in verde sono una cellula DC 2.4 di tipo selvatico che viene infettata da BFP canadese che è mostrata in rosso. L'imaging timelapse viene utilizzato per visualizzare le prime fasi della fagocitosi e viene mostrato qui a intervalli di 30 secondi.Le posizioni indicate dall'asterisco sono quelle in cui si verifica il rimodellamento dell'actina. L'intero processo avviene nel giro di pochi minuti. Qui è stato valutato il ruolo degli sfingolipidi per il loro ruolo nelle prime fasi della fagocitosi.Utilizzando questa tecnica, gli sfingolipidi sono risultati essenziali per il legame della candida albicans alle cellule e per la riduzione della fagocitosi complessiva. Questa riduzione del legame fagocitotico è stata dimostrata anche per il legame delle cellule DC 2.4 agli zimosi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'imaging dal vivo per studiare la fase iniziale della fagocitosi.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una o due ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire la fagocitosi di altri agenti patogeni, inclusi batteri e parassiti, al fine di comprendere l'intricata relazione tra le cellule immunitarie e di questi agenti patogeni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare, per esplorare l'endocitosi mediata dal recettore, compresa la fagocitosi e la macropinocitosi nelle cellule immunitarie.

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Questo video mostra un test per monitorare gli eventi di fagocitosi dei globuli rossi (RBC) mediati da macrofagi indipendenti. I globuli rossi umani opsonizzati con immunoglobuline G (IgG) di topo vengono incubati con macrofagi di topo e osservati al microscopio confocale. I globuli rossi sono inghiottiti dai macrofagi attraverso la formazione di una coppa fagocitaria e mirati alla degradazione lisosomiale.

Imaging in tempo reale della fagocitosi macrofagica dei globuli rossi opsonizzati IgG

Questo video mostra una tecnica di microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) ad alta risoluzione per la visualizzazione in tempo reale della formazione e della chiusura dei fagosomi durante la fagocitosi mediata dai macrofagi dei globuli rossi (RBC) opsonizzati da IgG attaccati alla superficie di un piatto con fondo di vetro. I macrofagi estendono gli pseudopodi attorno ai globuli rossi e li inghiottono all'interno dei fagosomi, staccandoli dalla superficie del vetro.

Visualizzazione basata su microscopia TIRF della formazione e della chiusura dei fagosomi

Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia...

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta

Qui presentiamo un protocollo per quantificare la fagocitosi delle particelle fluorescenti da parte di una linea cellulare di macrofagi aderenti utilizzando un metodo fluorimetrico. Questo metodo facilita una quantificazione ad alto rendimento dell'internalizzazione delle particelle e della conseguente polimerizzazione dell'actina.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Descriviamo una configurazione sperimentale per visualizzare con un'alta risoluzione senza precedenti la formazione e la chiusura di fagosomi in tre dimensioni in macrofagi viventi, utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Consente il monitoraggio della base della coppa fagocitica, degli pseudopodi estensibili e del sito preciso della scissione fagosomiale.

&quot;Phagosome chiusura Assay&quot; per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare il pH phagosomal e zona così come il pH citoplasmatico di neutrofili umani e di topo usando l'indicatore raziometrico seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Ciò si ottiene mediante live-cell microscopia confocale a fluorescenza e analisi di immagine.

Imaging dei neutrofili phagosome e nel citoplasma utilizzo di un indicatore di pH Raziometrico

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Il meccanismo associato alla fagocitosi nell'infezione da Leishmania rimane poco conosciuto. Qui, descriviamo i metodi per valutare gli eventi precoci che si verificano durante l'interazione di Leishmania con le cellule ospiti.

Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale

Qui viene presentato un protocollo per quantificare e produrre immagini dinamiche della regolazione mediata da cellule staminali mesenchimali (MSC) della fagocitosi macrofagica (MΦ) di particelle di lievito non opsonizzato (zymosan) coniugate a una molecola fluorescente sensibile al pH.

Regolazione mesenchimale delle cellule staminali della fagocitosi dei macrofagi; Quantificazione e imaging

Questo studio chiarisce l'elaborazione fagocitaria delle particelle Godanti Bhasma (GB) nelle cellule di mammifero, caratterizzandone l'assorbimento cellulare, la dinamica del vacuolo, l'acidificazione e la degradazione. Questi risultati non solo migliorano la nostra comprensione dei meccanismi fondamentali della fagocitosi, ma stabiliscono anche la GB come un promettente sistema modello per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

Esplorazione degli eventi cellulari sequenziali della fagocitosi innescata da Godanti Bhasma nelle cellule di mammifero

Impara a visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi utilizzando la microscopia confocale con cellule DC 2.4. Questo metodo permette di monitorare in tempo reale l'ingresso dei patogeni nelle cellule ospiti.

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