Name: Preparazione della matrice extracellulare fibre proteiche per Brillouin Spettroscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Impara a preparare fibre di collagene ed elastina dalla matrice extracellulare per la spettroscopia Brillouin. Questo metodo consente di determinare completamente le proprietà micro-meccaniche senza conoscere l'indice di rifrazione del materiale.

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Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio di Ricerca in Ingegneria e Scienze Fisiche [numero di sovvenzione EP/M028739/1]. RSE è stata sostenuta da un Santander Postgraduate Research Award 2015.

Attenzione: Si prega di consultare i protocolli di sicurezza biologica e tutte le schede di sicurezza dei materiali rilevanti (MSDS) prima dell&#39;uso. Il laser impiegato in questi esperimenti è un laser di classe 3B; è richiesto il rispetto delle norme locali per un uso sicuro del sistema. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate durante l&#39;esecuzione di una misura di spettroscopia laser compreso l&#39;uso di dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza). tendini coda sono stati ottenuti 7-8 settimane di età ratti Wistar sacrificati per altri scopi, conformemente al regolamento UE 1099/2009 e il benessere degli animali (macellazione o l&#39;abbattimento) del 1995. bovino legamento nucale sono stati ottenuti da un mattatoio locale. 1. preparazione di fibre campione NOTA: fibre proteiche della matrice extracellulare possono essere estratti da vari tessuti, con procedure diverse. I protocolli sono stati raffinati in base a procedure ampiamente applicate. <ol><li><strong&gt; Estrazione di fibre di collagene da coda di topo <ol><li> Sacrifica un ratto mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di peso corporeo pentobarbitone sodio. Poi tagliare la coda direttamente nel punto di contatto con il corpo, premendo con una lama di rasoio singolo bordo. Avvolgere la coda nella pellicola e conservarlo congelato a -20 ° C fino al momento. </li><li> Raccogliere la coda dal congelatore, tagliare una lunghezza di 20 mm segmento dall&#39;estremità prossimale mentre ancora congelato e poi lasciarlo scongelare in una capsula di Petri riempito con una soluzione tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,4) a temperatura ambiente. </li><li> Una volta che la coda è scongelato, fare un&#39;incisione lungo la lunghezza del segmento utilizzando un bisturi per dividere la pelle. Poi buccia indietro per rivelare quattro fasci tendinei guaina circa la vertebra della coda. </li><li> Utilizzando una pinza sottile e facendo attenzione a non applicare alcuna pre-deformazione, aspirare lentamente ogni fibra dalla guaina e metterlo in un flaconcino contenente acqua distillata con 0,01% w / v di sodio azide (NaN 3) per prevento crescita batterica, e conservare in frigorifero. Una singola coda produce una trentina di fibre tendinee. </li><li> Per ottenere il tipo fibroso puro collagene, applicare un tre parti processo di digestione enzimatica 10 alle fibre tendinee per rimuovere i proteoglicani e ogni altro materiale noncollagenous. <ol><li> In primo luogo, immergere le fibre in 0,125 U / ml condroitinasi ABC in 0,05 M Tris buffer e 0,06 M acetato di sodio (CH 3 COONa) a pH 8,0 per 24 ore a 37 ° C in un incubatore agitazione a 200 rpm. </li><li> Poi, immergere le fibre in 1 U / ml Streptomyces ialuronidasi in 0,05 M Tris buffer e 0,15 M di cloruro di sodio (NaCl) a pH 6.0 e tornare alla incubatore agitazione per 24 ore a 37 ° C. </li><li> Infine, immergere le fibre a 1 mg / ml di tripsina in 0,05 M di fosfato di sodio (NaHPO 4) e 0,15 M NaCl a pH 7,2 per 16 ore in incubatore agitazione a 37 ° C. </li></ol></li><li> Conservare le fibre purificati refrigerati in flaconcini contenenti acqua distillata, with 0,01% NaN 3 per prevenire la crescita batterica, fino richiesto per la misurazione. </li></ol></li><li> Estrazione di fibre di elastina da bovini legamento nucale <ol><li> Ottenere bovina legamento nucale da macello, avvolgerla nella pellicola e conservarlo congelato a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Per produrre elastina puro, raccogliere il legamento dal congelatore, permettono di scongelare a temperatura ambiente, sgrassare utilizzando un bisturi e digerire il legamento in un bagno di acqua bollente secondo la procedura di Lansing, 11 come segue. <ol><li> Preparare una soluzione di idrossido di sodio (NaOH) in acqua distillata 0,1 M e aggiungerlo al legamento sgrassata in una beuta, coprendo il tessuto. </li><li> Far bollire il pallone in un bagno d&#39;acqua a 95 ° C per 45 min. </li><li> Rimuovere il legamento dal pallone Kjeldahl e lavare il blocco tessuti insolubile ripetutamente in acqua bidistillata fino a pH 7,0 (monitorati utilizzando un pHmetro). </li><li> Rimuovere il tessuto dalla finaleSoluzione di lavaggio e immergerlo in acqua distillata (miscelato con lo 0,01% NaN 3 per prevenire la crescita batterica) in un contenitore sigillato e conservarlo in frigorifero. </li></ol></li><li> Raccogliere il tessuto dal frigorifero e, facendo attenzione a non applicare una forza eccessiva e pre-deformazione, usa le pinzette per tirare delicatamente segmenti di elastina più piccoli (da 20 a 50 mm di lunghezza, circa 2 mm di spessore) di distanza dal blocco più grande e metterli in una capsula di Petri con la soluzione PBS (pH 7,4). </li><li> Utilizzando una pinza sottile, prendere in giro delicatamente piccoli fasci di fibre intorno 1 mm di spessore e tagliarli a lunghezze di pochi millimetri con un bisturi. </li><li> Trasferire le fibre di flaconi contenenti acqua distillata (con il 0,01% NaN 3 per prevenire la crescita batterica) e memorizzarli in frigorifero fino al momento per la misurazione. </li></ol></li><li> Montaggio delle fibre su supporto d riflettente <ol><li> Utilizzando un tagliatore di diamanti, tagliare un pezzo di silicone scorrevole riflettente. </li><li> Per creare un compartme idratatant, tagliare una striscia di Parafilm per adattarsi sopra la diapositiva in silicone con un taglio cava nel centro (grande abbastanza da contenere una fibra) e posizionarlo sul substrato di silicone. NOTA: Per misure fibre secche, tagliare il parafilm in una forma ad U in modo che uno dei quattro lati rimane aperto all&#39;aria volta sigillato nel passaggio 1.3.4. </li><li> Rimuovere le fibre dal frigorifero, utilizzare un paio di pinze sottili per raccogliere una singola fibra dalla soluzione di stoccaggio e collocarlo in una piccola capsula di Petri riempita con acqua pura a temperatura ambiente per 5 minuti per lavare il campione. Poi, raccogliere la fibra e trasferirlo al centro della cavità parafilm sul substrato di silicone. Un&#39;attenta: Evitare di danneggiare la fibra allungando durante questa operazione, ed evitare riorientare il campione sul substrato poiché ciò può causare un cambiamento nelle proprietà meccaniche. </li><li> Inserire un sottile vetrino coprioggetto sulla fibra e sigillare la camera passando un saldatore riscaldato delicatamente sulla superficie del vetro per fondere il parafilm sottoil vetro. Attenzione: Evitare di danneggiare la fibra da non portare la punta di saldatura troppo vicino o il riscaldamento del substrato eccessivamente. </li><li> Posizionare la camera stagna su una superficie piana in un piccolo peso e lasciare per circa 12 ore per ottenere un buon contatto tra il substrato di silicio campione e evitando danni al campione. </li><li> Rimuovere il peso e fissare la camera in posizione sul substrato, mediante viti. </li></ol></li></ol> 2. Configurazione del test Brillouin e l&#39;acquisizione di Spectra Fiber <ol><li> Preparazione del vano campione <ol><li> Montare il campione preparato come parte 1.3 su un supporto verticale dotato di un goniometro per permettere la rotazione nel piano del campione mantenendo un angolo di diffusione costante (2 Φ = 90 °; vedere Figura SI-1) e dispersione posizione di volume. </li><li> Eseguire una regolazione precisa messa a fuoco della luce laser sul campione attraverso lens. 9 Un&#39;attenta: La potenza di uscita del laser può essere troppo elevato e produrre una bruciatura nel campione. Assicurarsi che sia impostato sufficientemente alto per dare una buona sensibilità, ma non troppo alto per evitare danni al campione. Qui abbiamo usato una potenza di circa 76 mW sul campione. Questo era sufficiente per ottenere una buona sensibilità senza bruciare il campione, anche considerando che questo è sottile e in contatto con un substrato che aiuta a dissipare il calore generato dall&#39;illuminazione laser. </li><li> Posizionare il campione ad un angolo di 45 ° (Φ) al fascio laser incidente utilizzando una scala Vernier. Ottenere un posizionamento ottimale eseguendo una misurazione e massimizzando l&#39;intensità dei picchi nello spettro (vedi sotto). </li></ol></li><li> Impostazione dello spettrometro <ol><li> Aprire il software per l&#39;acquisizione e la manipolazione dei dati e impostare l&#39;acquisizione di uno spettro Brillouin del campione 12. La procedura qui descritta si applica al multipass tandem interferometro (Figura SI-1A). </li><li> Allineare i due Fabry-Perot (FP) interferometri mutevoli autonomamente le tensioni applicate al piezo dall&#39;unità di controllo. Per questa procedura di pre-allineamento, osservare la luce riflessa da ogni FP. Quando l&#39;intensità riflessa dai due PQ tende a zero, viene raggiunto il corretto allineamento. </li><li> Calibrare spettro: la gamma di frequenza accessibili, o intervallo spettrale libera FSR (), dipende dalla distanza tra i due specchi della prima cavità FP, L, attraverso FSR = c / 2 L, dove c è la velocità della luce e L è misurata da un quadrante calibro. </li><li> Sincronizzare le scansioni dei due interferometri FP e commutare il sistema ottico per la configurazione tandem multipass. Un controllo in retroazione della intensità della luce laser trasmesso manterrà automaticamente l&#39;allineamento dei due PQ durante la misurazione. </li></ol></li><li> misura of Brillouin Spectra Un&#39;attenta: Lo spettro Brillouin è fortemente dipendente dalla temperatura e idratazione del campione e così attento controllo di questi parametri è la chiave per ottenere spettri riproducibile. <ol><li> Avviare l&#39;acquisizione di uno spettro Brillouin del campione ed eseguirlo fino ad ottenere un buon rapporto segnale-rumore. Questo può richiedere alcuni minuti a seconda della dispersione sezione trasversale, concentrazione e spessore del campione. NOTA: Non c&#39;è una regola per il rapporto segnale-rumore, ma la qualità spettrale viene controllato dal sperimentatore basato sul campione analizzato specifico. Vi è un compromesso tra qualità spettrale e durata della misurazione, quindi i parametri sperimentali devono essere selezionati in base alla specifica applicazione. </li><li> Per la misurazione di un campione secco, prendere successive spettri - per ciascuno di essi, seguendo passo 2.3.1 - fino cambiamenti nella posizione dei picchi is osservate. Ciò si ottiene quando il campione è in equilibrio con l&#39;atmosfera ambiente e senza ulteriore essiccamento influenzerà spettro. </li><li> Selezionare la polarizzazione della luce (VV o VH; V sta per verticale e H per la direzione orizzontale della polarizzazione della luce rispetto al piano di scattering) e acquisire spettri ad ogni angolo rispetto all&#39;asse della fibra (θ; Figura SI-1) ruotando il campione plane mano. </li><li> Salvare gli spettri Brillouin di file per la successiva elaborazione. </li></ol></li></ol> 3. Analisi di Brillouin Spectra NOTA: analisi Fit dei picchi di Brillouin possono essere eseguiti utilizzando diverse funzioni. Una smorzata oscillatore armonico (DHO) Funzione di 4,13 è stato selezionato come questo è un modello valido per i picchi provenienti da modi acustici smorzate in mezzi viscoelastici. <ol><li> Analisi Fit di picchi di Brillouin <ol><li> Selezionare l&#39;intervallo spettrale per il picco di interesse in the spettro di Brillouin. </li><li> Attiva una linea di base nella forma se lo sfondo spettrale è molto superiore a zero. NOTA: La linea di base può variare tra spettri. Assicurarsi che la correzione viene applicata in modo sistematico e riproducibile. </li><li> Applicare un dettagliato minimi quadrati utilizzando una funzione DHO 4,13 al picco di Brillouin di interesse in modo iterativo fino al raggiungimento della convergenza e la migliore curva si ottiene. Poi, salvare i risultati in forma di file. </li><li> Ottenere valori medi dai parametri fit dei due picchi di ciascun doppietto Brillouin. </li><li> Calcolare la velocità dell&#39;onda acustica dalla frequenza di picco (utilizzando l&#39;espressione sotto). </li><li> Tracciare i risultati in forma attraverso grafici, ad esempio, velocità delle onde acustiche vs. angolo all&#39;asse della fibra, θ E applicare modelli rilevanti (ad esempio, per i sistemi acusticamente anisotropi 9) per estrarre le quantità meccaniche come i coefficienti di elasticità tensore. </li></ol>
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</ol>

<ol><li>Brillouin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+de+la+lumi%C3%A8re+et+des+rayonnes+X+par+un+corps+transparent+homog%C3%A8ne%3B+influence+de+l%27agitation+thermique%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Phys%22%5BJournal%5D)">Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l'agitation thermique.</a> Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

spettroscopia Brillouin dispersione è uno strumento unico con cui i singoli componenti del tensore di elasticità di una fibra della proteina possono essere caratterizzati in dettaglio senza precedenti. Inoltre, le misurazioni possono essere effettuate su scala microscopica e quindi ci fornirà nuove intuizioni meccanica micro-scala di strutture biologiche, che ci permette, per la prima volta, di capire la meccanica, e probabilmente funzionali, significatività delle complessità in architettura a matrice e biochimica, che è stato rivelato in questi ultimi anni. La tecnica misura caratteristiche meccaniche in un intervallo di frequenza GHz. Questo dominio non è mai stata esplorata prima di biopolimeri strutturali e sia alza e fornisce i mezzi per rispondere a domande fondamentali su meccanismi molecolari di elasticità. Abbiamo descritto le istruzioni per estrarre le fibre di collagene ed elastina da tessuti animali e per misurare Brillouin scatterispettri ng utilizzando un substrato riflettente per ottenere la descrizione completa di biomeccanica fibra. Passaggi critici all&#39;interno del protocollo sono quelli che garantiscono che le fibre purificate sono ottenuti ed appropriate condizioni sperimentali sono in atto per le misurazioni riproducibili delle proteine ​​fibrose. Tuttavia, si deve tener presente che le procedure di estrazione possono modificare le proprietà meccaniche delle fibre. Modifiche della tecnica comportano l&#39;accoppiamento con la microscopia ottica per lo scattering Brillouin microfocused e mappatura avvicina 13 e la possibile combinazione con tecniche complementari (ad esempio, Raman scattering). Le attuali applicazioni della tecnica si concentrano principalmente su materiali biologici escisse, ma importanti sviluppi, ad esempio, quelli basati su più etalon VIPA 14, stanno rendendo possibile la traduzione di questa tecnica dal banco al capezzale con una serie di applicazioni già demonestrare 15,16 compreso potenziale nelle applicazioni in vivo. L&#39;approccio VIPA è un&#39;alternativa a quello che descriviamo; ha tempo di acquisizione veloce ma non è necessariamente appropriata nel caso di campioni opachi come quelli qui analizzato. Inoltre, l&#39;uso di un substrato riflettente non è pratico in set-up che utilizzano i etalon VIPA perché il loro contrasto non sarebbe sufficiente per respingere la luce quasi-elastica. Limitazioni relative alla velocità di acquisizione di un set di dati spettrali e la sezione trasversale di scattering intrinsecamente debole del materiale possono limitare le applicazioni a sistemi biologici dinamici e per l&#39;acquisizione di dati dal profondo tessuti, ma filtri tecniche possono migliorare le prestazioni di corrente. BLS promette di essere uno strumento importante nella ricerca biofisica fondamentale sulla matrice extracellulare e, quindi, per la produzione di nuove intuizioni l&#39;evoluzione delle proprietà meccaniche durante la crescita della matrice e la loro perdita in patologicadegenerazione. Tuttavia, è importante ricordare che le misure sono invasiva e possono pertanto essere intrapresi in vivo. Infatti, questo è già stato realizzato nella cornea 16 e tale lavoro può fornire una piattaforma per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici per una vasta gamma di malattie del tessuto connettivo. Ultrasuoni elastografia e microscopia a forza atomica (AFM) sono metodi alternativi di misura micromeccanica, ma la tecnica BLS offre una migliore risoluzione spaziale (su una scala subcellulare) rispetto al primo e, a differenza di AFM, non impone forze meccaniche sul campione e non è limitata a l&#39;analisi solo di caratteristiche superficiali. moduli di Brillouin di collagene ed elastina sono nella gamma GPa, mentre moduli di Young da ceppi macroscopici sono dell&#39;ordine di MPa (ulteriori dettagli saranno riportati altrove). Questo risultato indica un modulo elastico differenziale con una forte dipendenza dalla frequenza di eccitazione, a causail comportamento viscoelastico delle fibre. BLS possono essere applicati a una vasta gamma di problemi e materiali in scienza biomedica. Essa può aiutare a rispondere a domande sulla fisiologia e patologia dei tessuti biologici, oltre a fornire uno strumento fisico per la comprensione fondamentale dei materiali e delle interazioni a livello molecolare.

L&#39;effetto luce Brillouin Scattering (BLS) è stato scoperto da Léon Brillouin nel 1922. 1 Si tratta della scattering anelastico di luce visibile da fononi acustici attivati ​​termicamente in un materiale. In fisica dello stato solido, fononi acustici sono vibrazioni coerenti di tutti gli atomi in un reticolo. Una catena unidimensionale di due tipi alternati di atomi in un reticolo è un semplice modello che illustra la differenza tra fononi acustici, rivelate da BLS e fononi ottici, controllati mediante assorbimento IR e Raman (Figura 1). fononi acustici sono movimenti in fase di atomi nella catena con uno spostamento lungo la direzione di propagazione (fononi acustici longitudinali) o perpendicolare alla direzione di propagazione (trasversali fononi acustici), mentre fononi ottici sono out-of-fase movimenti degli atomi producendo un momento di dipolo elettrico oscillante (longitudinale o modi trasversali). BLS Spectroscopia è stato utilizzato in scienza analitica dal 1920; tuttavia, solo dal 1980 hanno misure alto contrasto stato possibile attraverso l&#39;uso del multipass spettrometro Fabry-Perot tandem. Da allora, un numero crescente di progressi nella BLS per applicazioni analitiche in materia condensata (in cui viene sfruttato l&#39;interazione fotone-fononi) 2-4 e magnetici materiali (attraverso l&#39;interazione fotone-Magnon) 5 è stato portato. Opere seminali sulle applicazioni biomediche 6-8 hanno aperto la strada per lo sviluppo di vari approcci, compreso quello applicato qui e quella precedentemente descritta 9 utilizzando un substrato riflettente in una configurazione di piastrine come per ottenere la descrizione completa del tensore elasticità un campione. Nel presente lavoro, si applica la spettroscopia BLS ai componenti fondamentali della matrice extracellulare nei tessuti connettivi, le proteine ​​fibrose di elastina e collagene di tipo I-. Tipo collagene è una molecola rigida elica, tripla che assembla lateralmente e longitudinalmente con una vasta collegamento trasversale per formare fibre sostanzialmente rigidi in tessuti come tendini. Reti di collagene spesso coesistono con le reti di elastina, una proteina che, insolitamente, genera lungo raggio elasticità attraverso una combinazione di entropia e interazioni idrofobiche con l&#39;ambiente ed è essenziale per le funzioni di tessuti come il polmone e la pelle. Entrambe le fibre sono modellati utilizzando un modello di cristallo esagonale nella ricerca attuale. 9 Nella parte 1, descriviamo il protocollo per estrarre le fibre provenienti da tessuti animali e per preparare il campione per le misure spettroscopiche. Nella parte 2, la procedura per la messa in opera dell&#39;apparecchiatura Brillouin e l&#39;acquisizione di spettri dalle fibre è presentato. Parte 3 fornisce dettagli di analisi dei dati applicati agli spettri Brillouin per estrarre le informazioni pertinenti meccanica ivi contenute. Poi, risultati rappresentativi sono presentati e discussed.

<table><tbody><tr><td>Condroitinasi ABC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2905</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffer</td><td>Fluka</td><td>93358</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S608-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td> Azide di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces Hyaluronidase&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1136-1AMP</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4665</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320-500</td><td></td></tr><tr><td>Acqua pura</td><td>Millipore</td><td>ZRQS0P3WW</td><td>Prodotto internamente</td></tr><tr><td><forte>Acqua distillata</forte></td><td>Bibby Scientific Limited</td><td>D4000</td><td>Prodotto internamente da acqua ancora</td></tr><tr><td><forte>Eutale</forte></td><td>Merial&nbsp;</td><td>J01601A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Interferometro tandem TFP-1</td><td>JRS Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezer</td><td>Lec</td><td>TU55144</td><td></td></tr><tr><td>Frigorifero</td><td>Zanussi</td><td>ZBA15021SA</td><td></td></tr><tr><td>Hot Plate</td><td>Fisher</td><td>Scientific SP88857206</td><td></td></tr><tr><td>Clamps</td><td>VWR</td><td>241-7311 & 241-7201</td><td></td></tr><tr><td>Clamp Stand</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 241-0093</td><td></td></tr><tr><td>Termometro</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-201-401</td><td></td></tr><tr><td>Cling Film</td><td>Sainsbury's</td><td>7650540</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Silicone</td><td>IDB Technologies</td><td>N/A</td><td>Nessun catalogo numero. Ordina su richiesta.</td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>VWR</td><td>631-1571</td><td></td></tr><tr><td>Conical Flask</td><td>VWR</td><td>214-1175</td><td></td></tr><tr><td>Beaker</td><td>VWR</td><td>213-0469</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro di misura</td><td>VWR</td><td>612-3838</td><td></td></tr><tr><td>Flalon</td><td>VWR</td><td>548-0051 & 548-0863</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>VWR</td><td>391-0441</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann Morton Ltd</td><td>&nbsp; 0914 & 0308</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Scribe</td><td>RS Instruments</td><td>394-217</td><td></td></tr><tr><td>Saldatore</td><td>RS Instruments</td><td>231-5332</td><td></td></tr><tr><td>Fine Pincipe</td><td>VWR</td><td>232-0188</td><td></td></tr><tr><td>Doppia micro-spatola</td><td>VWR</td><td>Varie misure</td><td></td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI-2210-02</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>IKA</td><td>&nbsp; </td><td></td>0002819000</tr></tbody></table>

preparazione della matrice extracellulare fibre proteiche per brillouin spettroscopia

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

La spettroscopia Brillouin è una tecnica emergente nel campo biomedico. Sonda le proprietà meccaniche di un campione attraverso l'interazione della luce visibile con onde acustiche indotte termicamente o fononi che si propagano a una velocità di pochi km/sec. Le informazioni sull'elasticità e la struttura del materiale sono ottenute in modo non distruttivo senza contatto, aprendo così la strada ad applicazioni in vivo e alla potenziale diagnosi di patologia. Questo lavoro descrive l'applicazione della spettroscopia di Brillouin allo studio della biomeccanica nelle fibre di collagene di tipo I digerite in elastina e tripsina della matrice extracellulare. Le proteine fibrose della matrice extracellulare sono gli elementi costitutivi dei tessuti biologici e studiare il loro comportamento meccanico e fisico è la chiave per stabilire relazioni struttura-funzione nei tessuti normali e i cambiamenti che si verificano nella malattia. Vengono presentate le procedure di preparazione del campione seguite dalla misurazione degli spettri di Brillouin utilizzando un substrato riflettente, insieme ai dettagli del sistema ottico e ai metodi di analisi dei dati spettrali.

L&#39;apparecchiatura spettroscopia Brillouin utilizzato in questo esperimento (Figura SI-1A) è stata precedentemente descritta. 9 Si impiega una modalità singola 532 nm laser a stato solido con potenza di uscita 76 mW a campione. Una lente acromatica 20 centimetri focalizza la luce laser sul campione e raccoglie la luce diffusa dal campione in una geometria backscattering. Un tandem multipass Fabry-Perot è utilizzato per filtrare la luce diffusa, che viene rilevata da un rilevatore fotodiodo basso rumore. Questo approccio dà contrasto estremamente elevato (circa 120 dB) e la stabilità attraverso l&#39;auto-allineamento piezo-scansione dei etalon. Un polarizzatore e analizzatore vengono introdotti per selezionare la polarizzazione della luce incidente e diffusa. Gli spettri vengono solitamente ottenuta con il polarizzatore mantenuto fisso selezionando la direzione verticale (V) della luce incidente polarizzazione e l&#39;analizzatore selezionando alternativamente verticale (V) or orizzontale (H) in direzione della polarizzazione della luce diffusa. In questa configurazione, modi acustici longitudinali e trasversali vengono rilevati rispettivamente. Un tipico spettro Brillouin ha un intenso picco centrale a causa di diffusione elastica e uno o più insiemi di picchi equamente spostate, o doppietti Brillouin, che sono la firma della meccanica del campione. In queste misurazioni, la luce diffusa può provenire sia da fononi bulk viaggiano quasi-ortogonale al campione e, dopo la riflessione della luce incidente all&#39;interfaccia campione-substrato, da fononi bulk viaggiano parallelamente alla superficie (modalità PS). 9 La figura 2 mostra BLS spettri delle fibre di collagene tripsina-digeriti secchi e idrati ottenuti con VV polarizzazione ad una risoluzione di 0,2 GHz, con una gamma spettrale gratuita di 30 GHz e circa il tempo di raccolta 10 minper ogni spettro. Ogni spettro corrisponde ad un determinato angolo di rotazione, θ (Figura SI-1C). In fibre collagene secco a θ = 0 °, modi longitudinali danno luogo ad un picco massa a (18.92 ± 0.02) GHz mentre la modalità PS è a (9,85 ± 0,03) GHz (Figura 2A). I turni PS picco a frequenze più basse come θ va da 0 ° (fononi sondare l&#39;orientamento assiale della fibra) a 90 ° (fononi sondare l&#39;orientamento radiale), mentre il picco di massa solo leggermente rosso-sposta al variare θ nello stesso intervallo (fonone sondare una direzione quasi-radiale durante la rotazione). In fibre collagene bagnato, i due picchi dovuti alla fononi longitudinali sono sostanzialmente immutato durante l&#39;esperimento, con il picco massa a circa 10,5 GHz e il picco PS a 4,9 GHz (Figura 2B). Questo indica una riduzione dall&#39;80 al 100% in frequenza di picco (relative ai dati di 18.92e 9,85 GHz, rispettivamente), e quindi della rigidità del materiale, a causa di idratazione. Notare che i modi rinfusa e PS di collagene idratato trovano vicino in frequenza per i modi di acqua pura, suggerendo che le sue costanti elastiche sono una combinazione dei contributi acqua e fibre, con un ruolo dominante svolto da acqua. La figura 3 mostra uno spettro di secca fibre collagene tripsina digerito misurato a θ = 30 ° con VH polarizzazione; una perdita della polarizzazione VV permette al PS e picchi di massa per ancora essere osservati. Modi trasversali rappresentano un picco a (4.1 ± 0.2) GHz (θ = 0 °) che leggermente blu-turni i cambiamenti θ da 0 ° a 90 °. risultati Fit sia per la trasversale e picchi di PS sono mostrati anche. Parametri di picco sono stati estratti e velocità delle onde acustiche sono state derivate da V L = v λ / √2, dove <em&gt; v è la frequenza del modo ottenuta mediante analisi della curva-fit dei picchi e λ è la lunghezza d&#39;onda di eccitazione, 532 nm. Si noti che in questa geometria, la conoscenza dell&#39;indice di rifrazione del materiale non è richiesto per ottenere la velocità modalità acustica (grazie alla geometria di scattering, q s = 2 k i sin (Φ); Figura SI-1b, c), quindi rendendo questo approccio particolarmente vantaggioso. La figura 4 è un grafico delle velocità delle onde acustiche ottenuti modi longitudinali e trasversali (picchi PS e T) in funzione della θ angolare . Analisi Adatta ad un modello di esagonale simmetrica solido elastico 7 - Equazioni A1 e A2 sotto - fornisce i cinque componenti del tensore elastico di tipo tripsina-digerito secco collagene fibre (Tabella 1). 9 <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54648/54648eq1.jpg" /> , (A1) <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54648/54648eq2.jpg" /> , (A2) dove ρ è la densità del materiale, ec 11, c 33, c 44 c 13 sono quattro dei cinque costanti elastiche che caratterizzano i sistemi a simmetria esagonale. Il quinto costante, c 12, può essere derivata dalla relazione approssimata c ~ 12 c 11 -. 2 c 44 7 I coefficienti sono simili a quelli precedentemente ottenuti da non purificato fibe collageners. 9 A differenza notevole si verifica per il coefficiente c 13 che si riflette in valori simili dell&#39;elastico moduli E ǁ ed E <img alt="Perpendicolare" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig_flippedT.jpg" /> (Circa 7,2 e 7,7 GPa) per il collagene purificato. La figura 5 è un grafico della velocità longitudinale onda acustica di collagene bagnato rispetto θ . In questo caso, nessun cambiamento periodico in frequenza è osservato, dando una velocità costante entro l&#39;errore. La Figura 6 mostra lo spettro di fibre di elastina secchi e idrati misurati a θ = 0 °. modi trasversali non sono stati rilevati per questi campioni. In elastina secca, il picco di massa si verifica a 16.8 GHz, mentre la modalità PS a 8,2 GHz 9 (13 e 20% inferiore ai corrispondenti picchi di collagene secca). le fibre di elastina Wet presentano una massa peak a (12,30 ± 0,01) GHz (37% più basso in frequenza rispetto al picco di massa di elastina secco). La modalità PS di elastina bagnato non risulta nello spettro causa dell&#39;intenso coda del picco elastica a quelle frequenze. D&#39;altro canto, il picco a circa 7,5 GHz è attribuita all&#39;acqua bulk. La Figura 7 mostra la dipendenza della velocità dell&#39;onda acustica in fibra di elastina asciutto su θ. Da questi dati, i componenti elasticità tensore (e moduli meccanici) sono stati ottenuti (Tabella 1). 9 Come nel collagene bagnato, vi è evidenza di isotropia nel modulo meccanica delle fibre di elastina idrati. Questi risultati indicano come la spettroscopia Brillouin può dare informazioni rilevanti sulla rigidità, composizione e aspetti strutturali di un materiale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig1.jpg" /> Fifigura 1. acustica e fononi ottici a catena unidimensionale di atomi. Schema di vibrazioni acustiche e ottiche in una catena biatomica unidimensionale. Gli atomi hanno massa m 1 e m 2 e si alternano. Le frecce indicano gli spostamenti degli atomi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig2.jpg" /> Figura 2. Brillouin spettri di tipo tripsina-purificata collagene fibre di coda di topo tendine. Spectra di (A) di fibra secca e (B) idratata fibra da misure VV ad angolo diverso da all&#39;asse della fibra θ, in gradi. è anche mostrato Uno spettro di acqua distillata pura. Gli spettri sono stati normalizzati all&#39;intensità (altezza) del picco di massa.<html> Le etichette B e PS denotano picchi relativi alla massa e modalità parallela-superficie, rispettivamente. Le barre di errore indicano l&#39;errore standard (radice quadrata del numero di conteggi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig3.jpg" /> Figura 3. spettro Brillouin di tipo tripsina-secco purificato collagene fibre di coda di topo tendine. Spectrum da una misura VH a θ = 30 °. Etichette T, PS e B denotano picchi relativi alla trasversale, modalità parallela-superficie e sfusi, rispettivamente. sono mostrati anche i risultati delle analisi in forma utilizzando un modello di oscillatore armonico smorzato (DHO) per entrambe le modalità T e PS. Le barre di errore indicano l&#39;errore standard (radice quadrata del numero di conteggi)./54648fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig4.jpg" /> Figura 4. Trama della velocità delle onde acustiche in collagene tripsina-purificato secco vs angolo all&#39;asse della fibra. Velocità longitudinali e trasversali onde acustiche di fibre collagene secca derivati ​​da analisi in forma dei picchi di Brillouin. I dati sono montati su un modello di esagonale simmetrica solido elastico. Linea rossa: Equazione A1 (R 2 = 0,99); linea blu: Equazione A2 (R 2 = 0,36). Le barre di errore indicano gli errori standard ottenuti dalla radice quadrata degli elementi diagonali della matrice di covarianza, dopo un non lineari Levenberg-Marquardt minimi quadrati di spettri Brillouin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un Versi più grandi</a><html> su questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig5.jpg" /> Figura 5. Trama della velocità delle onde acustiche longitudinali in collagene tripsina-purificato bagnato vs angolo all&#39;asse della fibra. Velocità dell&#39;onda acustica longitudinale delle fibre collagene idratato derivato da analisi in forma dei picchi di Brillouin. La linea indicata è una guida per l&#39;occhio e fornisce il valore medio della velocità dell&#39;onda acustica in questo intervallo. Le barre di errore indicano gli errori standard ottenuti dalla radice quadrata degli elementi diagonali della matrice di covarianza, dopo un non lineari Levenberg-Marquardt minimi quadrati di spettri Brillouin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> jpg &quot;/&gt; Figura 6. Brillouin spettri delle fibre di elastina da bovini legamento nucale. Spettri di fibra secca e idratata a θ = 0 °. Gli spettri sono stati normalizzati all&#39;intensità (altezza) del picco di massa. Le etichette B e PS denotano picchi relativi alla massa e modalità parallela-superficie, rispettivamente. B F e B W riferiscono ai picchi di massa di fibra e di acqua, rispettivamente. Le barre di errore indicano l&#39;errore standard (radice quadrata del numero di conteggi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig7.jpg" /> Figura 7. Trama della velocità delle onde acustiche longitudinali in elastina secca vs angolo all&#39;asse della fibra. Velocità dell&#39;onda acustica longitudinale secca fib elastinaer derivato da analisi in forma dei picchi di Brillouin. I dati sono montati su un modello di esagonale simmetrica solido elastico. Linea rossa: Equazione A1 9 (R 2 = 0,74). Le barre di errore indicano gli errori standard ottenuti dalla radice quadrata degli elementi diagonali della matrice di covarianza, dopo un non lineari Levenberg-Marquardt minimi quadrati di spettri Brillouin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Supplementare Figura 1" src="/files/ftp_upload/54648/54648supfig1.jpg" /> Figura SI-1. Schema del Brillouin set-up e la geometria di scattering BLS. (A) La luce incidente emessa da un laser a stato solido viene inviato al campione attraverso una lente acromatica. La luce diffusa dalla fononi acustici di massa e da quelli derivanti da riflezione di luce alla superficie del substrato, che è in contatto con il campione, viene raccolta dalla lente, filtrato da un tandem-multipasso Fabry-Perot e rivelata da un fotomoltiplicatore. FP1 e FP2 indicano i due interferometri che costituiscono il tandem set-up. Un polarizzatore seleziona la polarizzazione della luce incidente, ed un analizzatore viene usato per selezionare la polarizzazione della luce diffusa. (B) geometria BLS con un esemplare in contatto con la superficie di un substrato di silicio riflettente. Un vetrino (non mostrato) è disposto sopra il campione per sigillare il vano e leggera pressione viene applicata attraverso rilievi agli angoli del substrato. La luce incidente (k i) passa attraverso l&#39;obiettivo, viene rifratta all&#39;interfaccia aria-campione (k &#39;i) e concentrato all&#39;interfaccia campione-substrato. La luce diffusa raccolti dalla stessa lente (K &#39;s) i risultati di interazione sia con i fononi rinfusa (qb) e quelli che viaggiano PS del campione (q s). . Angoli tra le direzioni di luce e la normale alla superficie sono indicati come Φ e Φ &#39;(C) Schema del campione e del sistema di coordinate adottata; z definisce l&#39;asse straordinario parallelo alla direzione delle fibre. Angoli θ e α sono quelli tra la direzione di fononi q s e q b per z -axis rispettivamente k i, k &#39;I, K s, k&#39; s:. Numeri d&#39;onda del incidente e luce diffusa; q b, q s, vettori d&#39;onda del prodotto sfuso e modalità PS, rispettivamente. (Ristampato da ref 9.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648supfig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-con-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; Tabella 1. coefficienti del tensore elastico derivati ​​da analisi in forma delle velocità delle onde acustiche coefficienti tensori elastici di secca tipo tripsina-purificata collagene fibre (. questo lavoro) e fibre di elastina (rif 9). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> campione </td><td colspan="2"> coefficienti elastici (GPa) </td></tr><tr><td> collagene tripsina digerito </td><td> c 33 </td><td> 18.7 ± 0.1 </td></tr><tr><td></td><td> c 11 </td><td> 14.4 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> c 44 </td><td> 3.4 ± 0.1 </td></tr><tr><td></td><td> c 12 </td><td> 7.2 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> c 13 </td><td> 11.2 ± 0.3 </td></tr><tr><td> elastina </td><td> c 33 </td><td> 11.5 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> c 11 </td><td> 10.4 ± 0.1 </td></tr><tr><td></td><td> c 44 </td><td> 1.9 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> c 12 </td><td> 6.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> c 13 </td><td> 6.8 ± 0.3 </td></tr></tbody></table>

Presentiamo un protocollo per l'applicazione della spettroscopia di diffusione della luce Brillouin alle fibre di collagene di tipo I purificate con elastina e tripsina della matrice extracellulare per estrarre le loro proprietà elastiche complete.

Preparazione della matrice extracellulare fibre proteiche per Brillouin Spettroscopia

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare un campione di fibra proteica della matrice extracellulare, collageno o elastina, da posizionare nel compartimento del campione per misurazioni mediante spettroscopia Brillouin. Utilizzando questo metodo, le fibre di collagene ed elastina della matrice extracellulare possono essere ottenute da tessuti connettivi di origine animale per essere impiegate nelle misurazioni mediante spettroscopia Brillouin. Il principale vantaggio di questo approccio è che le proprietà micro-meccaniche del campione possono essere completamente determinate senza la necessità di conoscere preventivamente l'indice di rifrazione del materiale.Mentre la coda è ancora congelata, tagliare un segmento lungo 20 millimetri dall'estremità prossimale e scongelare il tessuto in una piastra di Petri riempita con PBS a temperatura ambiente. Quando la coda è completamente scongelata, utilizzare un bisturi per praticare un'incisione lungo il campione in modo da aprire la pelle, quindi staccare il tessuto per esporre i quattro fasci di tendini della guaina intorno alle vertebre della coda. Utilizzando pinzette fini, estrarre delicatamente ciascuna fibra dalla guaina e posizionarla in una provetta contenente acqua distillata integrata con azoturo di sodio allo 0,01% peso/volume, per la conservazione a quattro gradi Celsius.Per ottenere collagene di tipo I puramente fibroso, immergere le fibre in condroitinasi ABC in tampone tris e acetato di sodio per 24 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore agitato. Il giorno successivo, trasferire le fibre in ialuronidasi da Streptomyces in tampone tris e cloruro di sodio per altre 24 ore a 37 gradi Celsius nell'incubatore agitato. Successivamente, immergere le fibre in tripsina in fosfato di sodio e cloruro di sodio per 16 ore a 37 gradi Celsius con agitazione.Le fibre purificate possono quindi essere conservate a quattro gradi Celsius in provette contenenti acqua distillata integrata con azide di sodio allo 0,01% fino al momento dell'utilizzo. Per estrarre le fibre di elastina dal legamento nucale bovino, prima eliminare il tessuto adiposo dal legamento nucale bovino appena ottenuto. Una volta rimosso tutto il tessuto adiposo, aggiungere il legamento a un pallone conico e coprire il tessuto con idrossido di sodio appena preparato in acqua distillata.Fare bollire il legamento in un bagno d'acqua a 95 gradi Celsius per 45 minuti. Quindi lavare ripetutamente il blocco insolubile in un becher riempito con acqua distillata. Quando si raggiunge un pH di 7,0, immergere il tessuto in acqua distillata integrata con azoturo di sodio allo 0,01% e sigillare il contenitore per la conservazione a quattro gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo.Dopo la conservazione, utilizzare pinzette per estrarre delicatamente segmenti più piccoli di elastina spessi circa due millimetri e lunghi da 20 a 50 millimetri dal blocco più grande. Posizionare i segmenti in una piastra di Petri contenente PBS ed usare pinzette fini per separare delicatamente fasci di fibre spessi circa un millimetro dai segmenti. Successivamente, utilizzare un bisturi per tagliare i fasci in frammenti lunghi alcuni millimetri e trasferire i pezzi di fibra in vial contenenti acqua distillata integrata con azoturo di sodio allo 0,01% per la conservazione a quattro gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo.Per montare la fibra su un substrato riflettente, utilizzare innanzitutto un tagliente al diamante per sezionare un pezzo di vetrino di silicio riflettente. Successivamente, tagliare una striscia di para-film con una cavità al centro sufficientemente grande da contenere un pezzo di fibra e posizionare il para-film sul substrato di silicio. A questo punto, utilizzare una pinzetta fine per trasferire una singola fibra dalla soluzione di conservazione a quattro gradi Celsius in una piccola capsula di Petri riempita con acqua pura a temperatura ambiente.Dopo 5 minuti, trasferire la fibra risciacquata al centro della cavità in para-film sul substrato di silicio. Quindi posizionare una sottile lamella di vetro sopra la fibra e appoggiare delicatamente sopra la lamella un saldatore riscaldato per far fondere il para-film al di sotto del vetro. Per consentire la rotazione nel piano del campione mantenendo costanti l'angolo di scattering e la posizione del volume, montare il campione su un supporto verticale dotato di goniometro e posizionarlo a 45 gradi rispetto al fascio laser incidente.In fibre di collagene secche a un angolo specifico di rotazione di zero gradi, le onde longitudinali generano un picco di volume a 18,92 gigahertz, mentre le onde parallele alla superficie producono un picco a 9,85 gigahertz. Il picco parallelo alla superficie si sposta verso frequenze più basse quando l'angolo specifico di rotazione si avvicina ai 90 gradi, mentre il picco di volume subisce solo un lieve spostamento verso il rosso variando l'angolo specifico di rotazione nello stesso intervallo. In fibre di collagene idratate, i due picchi rimangono sostanzialmente invariati durante l'esperimento, con il picco di volume a 10,5 gigahertz e il picco parallelo alla superficie a 4,9 gigahertz, indicando una riduzione della frequenza compresa tra l'80 e il 100% e spiegando la minore rigidità del materiale idratato.In questa figura è mostrato un grafico della velocità dell'onda acustica del collagene secco ottenuta dai picchi paralleli alla superficie e trasversali, in funzione dell'angolo specifico di rotazione. Nelle fibre di elastina secca misurate a un angolo specifico di rotazione di zero gradi, il picco volumetrico si verifica a 16,8 gigahertz e la modalità parallela alla superficie si verifica a 8,2 gigahertz. Le fibre di elastina idratate, tuttavia, presentano un picco volumetrico a una frequenza del 37% inferiore rispetto al picco volumetrico dell'elastina secca, indicando una riduzione della rigidità della fibra.Come nel collagene secco, esiste evidenza di anisotropia nelle proprietà meccaniche delle fibre di elastina secca, dimostrando l'efficacia della spettroscopia Brillouin nell'ottenere dati rilevanti sulla rigidità, composizione e aspetti strutturali di materiali specifici di interesse. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare campioni di fibre di collagene ed elastina per test micro-meccanici basati sulla spettroscopia di scattering della luce Brillouin.

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