Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione
21 dicembre 2016
Proponiamo un protocollo per la riprogrammazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Placcando le cellule del sangue trasdotte su piastre rivestite di matrice con centrifugazione, le iPSC vengono indotte con successo da cellule galleggianti. Questa tecnica suggerisce un protocollo di riprogrammazione semplice ed efficace per cellule come PBMC e CBMC.
L'obiettivo generale di questo studio è quello di riprogrammare le cellule mononucleate del sangue periferico in cellule staminali pluripotenti indotte, utilizzando la placcatura seriale mediante centrifugazione. Originariamente, le iPSC sono state generate riprogrammando i fibroblasti. Oggi, vari vengono utilizzati per la riprogrammazione.
Tuttavia, a causa dell'accessibilità del sangue, le PBMC possono essere una fonte di cellule non accettata per ulteriori applicazioni di iPSC, nello screening di farmaci, nella modellazione di tesi e nello sviluppo di medicina rigenerativa. Attraverso lo studio, condivideremo un protocollo sulla riprogrammazione delle iPSC utilizzando le PBMC aggiungendo la forza centrifuga. Questo protocollo fornirà un'altra opzione durante la riprogrammazione delle celle flottanti.
Per dimostrare la procedura, utilizzeremo Nam, uno studente laureato del mio laboratorio. Per isolare le cellule monocitiche, procurarsi prima almeno dieci millilitri di sangue fresco da un prelievo di sangue in una provetta per la preparazione delle cellule. Successivamente, trasferire il sangue in una nuova provetta conica da 50 millilitri e diluirla con PBS sterile in un rapporto da uno a quattro.
Successivamente, aggiungere dieci millilitri di terreno a gradiente di densità a una nuova provetta conica da 50 millilitri e sovrapporre accuratamente il sangue diluito sopra il mezzo a gradiente di densità. Quindi, centrifugare il campione a 750 volte g per 30 minuti a temperatura ambiente, senza interruzioni di centrifugazione. Dopo 30 minuti, trasferire con cura lo strato di buffy in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.
Aggiungere 30 millilitri di PBS e lavare le cellule. Quindi, centrifugare le celle a 515 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, scartare la PBS e risospendere le cellule in 0,5 millilitri di terreno cellulare.
Successivamente, contare le cellule e piastarle in una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere PBS ai pozzetti circostanti per evitare l'evaporazione. Successivamente, stabilizzare le cellule per cinque giorni a 37 gradi Celsius prima della trasduzione.
Aggiungere ulteriori 0,5 millilitri di terreno di coltura fresco nel terzo o quarto giorno, senza disturbare le cellule. In questa procedura, trasferire le cellule del sangue in una provetta conica da 15 millilitri e contarle utilizzando un ematocitometro. Quindi, preparare tre volte da dieci a cinque celle per la trasduzione e centrifugare le cellule a 515 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, scartare il surnatante per aspirazione e risospendere le cellule in 0,5 millilitri di terreno cellulare. Quindi, trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti non rivestita. Scongelare la miscela di virus Sendai nel ghiaccio e aggiungerla alle cellule sospese.
Sigillare la piastra con una pellicola sigillante e centrifugarla a 1,150 volte g per 30 minuti a 30 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per una notte. Per rivestire una piastra a 24 pozzetti con vitronectina, il giorno successivo, diluire la soluzione di vitronectina in PBS per ottenere una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro.
Quindi, aggiungi un millilitro di vitronectina in un pozzetto e incubalo a temperatura ambiente, per almeno un'ora. Successivamente, rimuovere la soluzione di rivestimento e trasferire tutti i terreni contenenti le cellule e il virus nel pozzetto rivestito. Quindi, raccogliere le cellule rimanenti con altri 0,5 millilitri di terreno di coltura fresco e aggiungerlo al pozzetto contenente le cellule.
Successivamente, centrifugare la piastra a 1,150 volte g per dieci minuti a 35 gradi Celsius, quindi mantenere le celle a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% durante la notte. Per il trasferimento della seconda cellula, rivestire il pozzetto con cinque microgrammi per millilitro di vitronectina come descritto in precedenza. Utilizzare un pozzetto della piastra per ogni trasduzione e trasferire la sospensione cellulare dalla prima piastra alla piastra di vitronectina appena rivestita.
Nel frattempo, aggiungere un millilitro di terreno iPSC a un pozzetto della prima piastra per il mantenimento e incubarlo a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%, con un cambio giornaliero del terreno con terreni iPSC freschi. Le colonie appariranno dal giorno 14 al 21, dopo la trasduzione. Centrifugare la piastra appena rivestita, contenente le celle sospese, a 1, 150 volte g a 35 gradi Celsius per dieci minuti.
Dopo la centrifugazione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%, per una notte. Il giorno successivo, rimuovere il surnatante e sostituirlo con un terreno di coltura fresco con cellule staminali pluripotenti indotte. Mantenere le celle attaccate con il cambio quotidiano del terreno, fino a raggiungere l'80% di confluenza.
Una settimana prima della raccolta delle colonie, seminare una volta dieci per le quarte cellule in un piatto da 100 millimetri rivestito di vitronectina. Successivamente, preparare un piatto da 60 millimetri rivestito di vitronectina, aggiungendo due millilitri di soluzione di vitronectina, e incubarlo a temperatura ambiente per almeno un'ora. Osservando al microscopio, segnare le colonie sul fondo della piastra con bordi chiari usando un pennarello.
Rimuovere la soluzione di vitronectina dalla nuova piastra e aggiungere sei millilitri di terreno di coltura di cellule staminali pluripotenti indotte, integrate con dieci millimolari di RHO chinasi. Successivamente, rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e lavarle con tre millilitri di PBS. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione distaccante per colonie di iPSC e incubarle per 30 secondi a temperatura ambiente.
Successivamente, rimuovere la soluzione dalla piastra e incubarla a temperatura ambiente per altri 30 secondi. Dopo 30 minuti, prelevare 200 microlitri di terreno dalla piastra e staccare le colonie mirate mediante pipettaggio. Quindi, trasferisci le colonie sparse in un nuovo piatto da 60 millimetri.
Incubare e mantenere le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% fino a raggiungere il passaggio dieci. Nella fase iniziale della riprogrammazione, le iPSC sono state mescolate con le cellule differenziate non riprogrammate collegate. Prima dell'espansione, le iPSC e altre cellule erano diverse da discriminare.
Seminando le cellule a bassa densità, si sono ottenute colonie abbastanza grandi per la raccolta. Dopo aver isolato la colonia, i grumi di cellule sono stati dissociati in singole cellule e in coltura. In seguito sono state osservate colonie di iPSC pure.
Dopo che le cellule staminali pluripotenti indotte pure si sono espanse, è stata testata la qualità delle cellule. Le cellule sono state colorate con fosfatasi alcalina per confermare lo stato indifferenziato delle cellule staminali pluripotenti indotte. Le colonie derivate dalle cellule staminali pluripotenti indotte isolate hanno tutte mostrato una colorazione positiva.
I marcatori pluripotenti sono stati confermati mediante colorazione immunofluorescente. Le cellule riprogrammate esprimevano marcatori pluripotenti, come SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 e, soprattutto, TRA-1-60, l'espressione di marcatori pluripotenti è stata confermata da RTPCR. Utilizzando la placcatura seriale mediante centrifugazione, l'attacco di PBMC per uso di transito su una piastra rivestita metricamente.
Gli attacchi sono come pended, e le colonie iPSC sono ripetute per una purificazione. Utilizzando questo protocollo, le iPSC possono essere generate dalle PBMC entro un mese. Questo protocollo riduce il tempo necessario per l'adesione delle cellule trasdotte e previene la perdita di cellule riprogrammate che non sono state in grado di attaccarsi da sole.
Tuttavia, la purificazione delle iPSC formanti colonie completamente riprogrammate può essere fondamentale, quando si tenta questa procedura. In precedenza, abbiamo riprogrammato con successo PBMC e celle mononucleate utilizzando questo protocollo. Gli iPC derivati da cellule del sangue generate possono essere ampiamente utilizzati in vari campi di ricerca.
Questo protocollo può aiutare il processo di riprogrammazione di altri tipi di celle in sospensione flottante, per ulteriori applicazioni e studi.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la riprogrammazione di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) mediante centrifugazione. Il metodo migliora l'accessibilità delle PBMC come fonte praticabile di iPSC, che possono essere utilizzate in diverse applicazioni come lo screening farmacologico e la medicina rigenerativa.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Riprogrammazione cellulare
- Medicina rigenerativa
Sfondo
- Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) sono state inizialmente generate da fibroblasti.
- Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs) rappresentano una fonte cellulare più accessibile.
- Le iPSCs hanno applicazioni nello screening farmacologico e nella modellizzazione delle malattie.
- I metodi attuali per la riprogrammazione delle PBMCs sono limitati.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo semplice ed efficace per la riprogrammazione dei PBMC in iPSC.
- Utilizzare la forza centrifuga per potenziare il processo di riprogrammazione.
- Fornire un metodo alternativo per lavorare con cellule in sospensione.
Metodi Utilizzati
- Riprogrammazione dei PBMC in iPSC.
- Piastratura di cellule ematiche transdotte su piastre rivestite con matrice.
- Applicazione della centrifugazione per favorire l'adesione cellulare.
- Induzione di iPSC da cellule in sospensione.
Risultati principali
- Induzione con successo di iPSC da PBMC utilizzando il protocollo proposto.
- Dimostrazione dell'efficacia della centrifugazione nel processo di riprogrammazione.
- Potenziale per applicazioni più ampie delle iPSC derivate da PBMC.
- Offerta di una nuova opzione per i ricercatori in biologia delle cellule staminali.
Conclusioni
- Il protocollo offre un approccio semplice per riprogrammare i PBMC in iPSC.
- Questo metodo potrebbe migliorare l'uso dei PBMC in varie applicazioni biomediche.
- Studi futuri potrebbero ampliare l'utilità di questa tecnica nella medicina rigenerativa.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo protocollo consente una generazione efficiente di iPSC a partire da cellule mononucleate del sangue periferico, fornendo una fonte non invasiva e scalabile per la modellizzazione delle malattie e lo screening di farmaci. Sfruttando la centrifugazione per migliorare l'adesione cellulare, aumenta l'efficienza del riprogrammamento e riduce la perdita cellulare nelle fasi iniziali. Il metodo supporta la validazione di bersagli e lo sviluppo di modelli preclinici mediante l'uso di cellule derivate da pazienti, accelerando la ricerca traslazionale in medicina rigenerativa.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche utilizzando iPSC umane geneticamente corrispondenti derivate da fonti ematiche accessibili.
- Valore operativo: Fornisce una fonte cellulare rinnovabile per la chiarificazione dei percorsi molecolari e la validazione funzionale di bersagli, senza ricorrere a biopsie invasive.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera popolazioni standardizzate di iPSC per screening di composti e sviluppo di saggi fenotipici coerenti.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità mediante piattamento seriale per centrifugazione, riducendo la variabilità nell'attaccamento cellulare e nell'efficienza di riprogrammazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione rilevante per le malattie producendo cellule pluripotenti capaci di differenziarsi in linee cellulari pertinenti ai test di tossicità e di efficacia dei farmaci.
- Valore operativo: Permette l'espansione scalabile e la banca delle colonie di iPSC per studi preclinici longitudinali e per la riduzione del rischio nei meccanismi d'azione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo una fonte affidabile a monte di iPSC da utilizzare in applicazioni a valle come la validazione del bersaglio, lo sviluppo di saggi e i test preclinici.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi mediante la generazione di iPSC specifici del paziente che mantengono il background genetico del donatore per studi meccanicistici.
- Screening: Produce colonie di iPSC aderenti e proliferative adatte a screening ad alto contenuto e saggi di risposta dose-dipendente dopo trasduzione e selezione.
- Analisi: Permette una valutazione quantitativa dell'efficienza di riprogrammazione tramite parametri di formazione delle colonie e l'espressione di marcatori di pluripotenza (ad esempio, SSEA4, Oct4, TRA-1-60) per decisioni di avanzamento o interruzione.
- Ricerca traslazionale: Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica fornendo cellule capaci di differenziarsi per saggi tissutali specifici e farmacologia della sicurezza.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la generazione di iPSC in progetti multipli, riducendo la dipendenza dalla riprogrammazione di fibroblasti e consentendo flussi di lavoro paralleli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi utilizzando iPSC di derivazione umana geneticamente stabili che riflettono la variabilità del paziente.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità della produzione di iPSC attraverso passaggi definiti di centrifugazione e piastre rivestite con matrice, riducendo al minimo la variabilità manuale.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico nell'identificazione dei composti attivi consentendo un'individuazione precoce di fenotipi legati all'obiettivo in contesti cellulari umani.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio fornendo letture meccanicistiche da modelli derivati da iPSC che informano le decisioni di avanzamento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nella trasduzione virale e nelle tecniche di manipolazione cellulare basate sulla centrifugazione.
- Presuppone l'accesso a centrifughe refrigerate, rivestimenti per matrice (ad esempio, vitronectina) e terreni specializzati per il mantenimento delle cellule ematiche e l'espansione delle iPSC.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro riguardo a forza g, tempistiche e temperatura durante i passaggi di semina seriale, al fine di garantire la riproducibilità.
- Richiede considerazioni adattative quando si applica a diverse fonti di cellule derivate dal sangue (ad esempio, sangue del cordone ombelicale rispetto a sangue periferico), a causa della variabilità nella vitalità cellulare e nell'efficienza di trasduzione.
- I limiti pratici includono la necessità di tecnica asettica durante i numerosi trasferimenti e la potenziale variabilità nell'efficienza di riprogrammazione, legata alla qualità delle cellule donatrici e alla loro storia di passaggi.
