Name: Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Scopri come riprogrammare cellule mononucleari del sangue periferico in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando centrifugazione e virus Sendai. Questo metodo semplifica la generazione di iPSC per applicazioni in medicina rigenerativa.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Programma di Ricerca Scientifica di Base attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF), finanziata dal Ministero della Scienza, delle TIC e della Pianificazione Futura (2013R1A1A1076125).

Etica Dichiarazione: Questo protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell&#39;Università Cattolica di Corea (KC12TISI0861). 1. Isolamento dei monociti cellule dal sangue <ol><li> L&#39;isolamento di cellule monociti (Giorno -5) <ol><li> Ottenere almeno 10 ml di sangue fresco da un prelievo di sangue in un tubo preparato cellulare (CPT). </li><li> Trasferire il sangue in una nuova provetta conica da 50 ml e diluire con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) in un rapporto 1: 4. NOTA: un più alto rapporto di diluizione può essere utilizzato per una maggiore purezza. </li><li> Aggiungere 10 ml di media gradiente di densità in una nuova provetta conica da 50 ml e strato attentamente il sangue diluito in cima media gradiente di densità. Centrifugare a 750 xg per 30 min a temperatura ambiente (RT) senza freno centrifugazione. </li><li> Trasferire accuratamente lo strato di buffy ad un nuovo tubo conico da 50 ml, aggiungere 30 ml di PBS al tubo, e lavare le cellule. </li><li> Centrifugare le cellule a 515 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. &lt;/ Li&gt; <li> Eliminare il PBS e risospendere le cellule in 0,5 ml di mezzi delle cellule del sangue. </li><li> Contare le cellule e piastra 1 x 10 6 cellule per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere PBS ai pozzetti circostanti per evitare l&#39;evaporazione. </li><li> Stabilizzare le cellule per 5 giorni a 37 ° C in 5% CO 2 prima trasduzione. Aggiungere un ulteriore 0,5 ml di mezzi delle cellule del sangue fresco nelle giornate 3-4 senza disturbare le cellule. </li></ol></li></ol> 2. trasduzione da Sendai virus <ol><li> Trasduzione (giorno 0) <ol><li> Raccogliere e trasferire le cellule del sangue ad un tubo conico da 15 ml e contarli con un emocitometro. </li><li> Preparare 3 x 10 5 cellule per trasduzione e centrifugare le cellule a 515 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere le cellule in 0,5 ml di mezzi di cellule del sangue. </li><li> Trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra non rivestiti 24 pozzetti. </li><li> Scongelare la miscela di virus di Sendai in ghiaccio e aggiungerlo al SUcellule trascorsa. Aggiungere Sendai virus alle cellule in base alle raccomandazioni del produttore. </li><li> Sigillare la piastra con un film di sigillatura e centrifugare a 1150 xg per 30 min a 30 ° C. </li><li> Dopo centrifugazione, incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 overnight (O / N). </li></ol></li><li> trasferimento di cellule di matrice alimentatore (1 ° giorno) <ol><li> Il giorno successivo, il cappotto di un 24-pozzetti con vitronectina. Diluire la soluzione vitronectin in PBS per una concentrazione finale 5 mg / ml. Aggiungere 1 ml di vitronectina in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti ed incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora. Rimuovere la soluzione di rivestimento prima dell&#39;uso. piastre rivestite possono essere memorizzati in RT per 3 giorni. </li><li> Trasferire tutti i supporti contenenti le cellule e virus al rivestito bene. </li><li> Raccogliere le cellule rimanenti con l&#39;aggiunta di 0,5 ml di mezzi delle cellule del sangue fresco e aggiungerlo alla cella contenente bene. </li><li> Centrifugare la piastra a 1.150 xg per 10 min a 35 ° C. </li><li> dopo centorifugation, rimuovere il surnatante, aggiungere 1 ml di IPSC dei media, e mantenere le cellule a 37 ° C in 5% di CO 2 O / N. </li></ol></li><li> In secondo luogo il trasferimento di cellule (2 ° giorno) <ol><li> Coat pozzetti di una nuova 24-pozzetti con 5 mg / ml vitronectina, come descritto al punto 2.2.1. Utilizzare uno pozzetto della piastra per ogni trasduzione. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare dalla prima piastra alla piastra vitronectina appena rivestito. NOTA: se non necessario, cellule in sospensione possono essere scartati. La procedura di cui al punto 2.3 può essere ripetuta 2-3 volte con le celle di sospensione. Se si ripeteranno i passi, raccogliere le cellule. </li><li> Nel frattempo, aggiungere 1 ml di COPSI media per pozzo della prima piastra, per la manutenzione e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 O / N. </li><li> Mantenere le cellule attaccate a 37 ° C e 5% CO 2 ed eseguire un cambiamento supporto quotidiano con mezzi COPSI fresco. Le colonie appariranno nei giorni 14-21 dopo trasduzione. </li><li> Centrifuge la piastra appena rivestito contenente le celle di sospensione a 1.150 xg e 35 ° C per 10 min. </li><li> Dopo centrifugazione, incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 O / N. </li><li> Il giorno successivo, rimuovere il surnatante e sostituirlo con i media IPSC freschi. NOTA: La procedura di cui al punto 2.3 può essere ripetuta 2-3 volte con le cellule di sospensione. Se si ripeteranno i passi, raccogliere le cellule del surnatante e ripetere il punto 2.3. </li><li> Mantenere le cellule attaccate con i cambiamenti dei media al giorno fino a raggiungere l&#39;80% di confluenza. </li></ol></li></ol> 3. Manutenzione delle cellule riprogrammato <ol><li> manutenzione anticipata dopo la cultura 24-pozzetti <ol><li> 7-10 giorni dopo la trasduzione, una volta che le cellule sono confluenti, preparare una, piatto vitronectina in acciaio 60 mm. Diluire soluzione vitronectina in PBS per una concentrazione finale 5 mg / ml. Aggiungere 1 ml di vitronectina al piatto ed incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora. </li><li> lava ilcellule con PBS e aggiungere 1 ml di PBS / 1 mM EDTA per staccare le cellule. </li><li> Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 2 min. </li><li> Raccogliere le cellule e centrifugare a 250 xg ed RT per 2 min. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 3 ml di mezzi freschi IPSC. </li><li> Piastra tutte le cellule risospese sulla nuova rivestito piatto di 60 mm. </li><li> Aggiungere 10 mM chinasi RHO alle cellule e mantenerli a 37 ° C in 5% CO 2 fino a quando le cellule sono 80% confluenti. </li></ol></li><li> Spalato per l&#39;aspetto delle colonie (Subclonaggio Preparazione) <ol><li> Preparare una, piatto vitronectina rivestite da 100 mm, come descritto al punto 3.1.2. </li><li> Lavare le cellule con PBS e aggiungere 1 ml di PBS / 1 mM EDTA per staccare le cellule. </li><li> Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 2 min. </li><li> Raccogliere le cellule e centrifugare a 250 xg ed RT per 2 min. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare 1 x 10 4 cellule per piatto.</li><li> Centrifugare le cellule a 250 xg ed RT per 2 min. </li><li> Risospendere 1 x 10 4 cellule in 6 ml di IPSC mezzi, li piatto sulla rivestito piatto da 100 mm, e aggiungere 10 inibitore della chinasi mM RHO ai media. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 per una settimana finché appaiono grandi colonie. NOTA: Mantenere e ampliare le colonie per subcloning. Subcloning di solito è fatto in meno di 5 passaggi. </li></ol></li><li> Colony raccolta utilizzando iPSC colonia distacco soluzione <ol><li> Una settimana prima colonia di raccolta, di semi di 1 x 10 4 cellule in un piatto vitronectina rivestite da 100 mm, come indicato al punto 3.2.7. </li><li> Preparare un piatto vitronectina rivestito 60 mm aggiungendo 2 ml di soluzione di vitronectina e incubando a temperatura ambiente per almeno 1 ora. </li><li> Osservando al microscopio (40x o ingrandimento 100X), marcare colonie con chiari confini con un pennarello. Rimuovere la soluzione vitronectin dalla nuova piastra realizzato in fase 3.3.2 e aggiungere 6 mldi IPSC multimediale integrato con 10 mM RHO chinasi. </li><li> Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e lavare con 3 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di distacco iPSC colonia e incubare per 30 s a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la soluzione dalla piastra ed incubare a temperatura ambiente per altri 30 sec. </li><li> Usando una pipetta P200, disegnare 200 ml di mezzi dalla piastra e staccare le colonie mirati pipettando. Trasferire le colonie sparse per il nuovo piatto da 100 mm. </li><li> Incubare e mantenere le cellule a 37 ° C in 5% CO 2. NOTA: Dopo aver ottenuto un puro colonie IPSC, le cellule sono state mantenute fino a raggiungere il passaggio 10. La caratterizzazione è stata fatta dopo almeno 10 passaggi. Diluizioni Anticorpo e informazioni di primer sono riportati nelle tabelle 1 e 2. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine%3A+current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li>
<li>Seki, T., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application.</a> World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).</li>
<li>Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPSCs+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+non-integrative+Sendai+virus+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li>
<li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Dal momento che le cellule staminali embrionali (CSE) hanno evidenziato diverse lacune, è stato richiesto l&#39;esigenza di uno strumento alternativo. Pertanto, lo sviluppo delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da Yamanaka è venuto sotto i riflettori internazionali. E &#39;stato quasi un decennio da quando Yamanaka ha scoperto che pluripotenza può essere indotta con l&#39;aggiunta di soli quattro geni nelle cellule somatiche adulte. Dal momento che iPSCs sono &quot;indotte&quot; dalle cellule somatiche ma...

Le cellule staminali sono stati uno dei materiali più interessanti nella terapia clinica per gli ultimi decenni 1. Le proprietà interessanti di cellule staminali sono pluripotenza e la capacità di auto-rinnovarsi. Nel 1981, le prime cellule staminali embrionali (ESC) sono stati isolati dal embrione di topo 2. Tuttavia, quando la tecnica è stata applicata agli embrioni umani, ha affrontato diverse questioni etiche. Nel 2006, quando il dottor Yamanaka e il suo team riprogrammate la prima cella pluripotenti da cellule somatiche del mouse, il campo delle cellule staminali ha riguadagnato la sua possibilità e l&#39;interesse si è riaccesa 3. Offrendo diversi fattori definite, cellule staminali pluripotenti sono state con successo &quot;indotte&quot; dalle cellule somatiche adulte, e furono così chiamati &quot;cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs).&quot; Nel 2007, questa tecnica è stata applicata a cellule umane 4, cedendo le cellule con le caratteristiche esatte della CES, ma nessuno del dibattito etico. Teoricamente, iPSCs può essere generato da qualsiasi tipo cellulare ottenuta da qualsiasi individuo o paziente. iPSCs paziente-specifici sono in aumento come un potenziale strumento in grado di simulare i fenotipi di malattia e le condizioni epigenetici di ogni singolo paziente. Usando la modifica del gene o altri metodi che possono invertire la condizione patogena, iPSCs paziente-specifici possono essere utilizzati anche in medicina personalizzata 5. Inoltre, iPSCs sono meno associati con rigetto immunitario perché hanno la stessa identità immunitario come il donatore, rendendo l&#39;auto-trapianto più fattibile 6. Pertanto, iPSCs sono diventate la piattaforma più promettente nella modellazione della malattia, lo screening di stupefacenti, e le terapie rigenerative. Alla luce di questi vantaggi, protocolli migliorati che possono dare più puro e rendimenti più elevati nel minor tempo possibile dalla sorgente più piccola cellula sono costantemente in fase di sviluppo. Una considerazione importante di trovare il protocollo più efficiente per applicazioni future è il tipo di cellula primaria. La maggior parte della prima generazione proto iPSCCols sono ottimizzati per cellule aderenti dal momento che le linee originali IPSC sono state indotte da fibroblasti cutanei 4. Tuttavia, l&#39;isolamento e la preparazione di queste cellule sono lavoro intensivo. Inoltre, l&#39;isolamento di fibroblasti cutanei comprende procedure chirurgiche invasive che possono diventare una grave lacuna per la più ampia applicazione. Pertanto, per l&#39;ulteriore uso di iPSCs, è necessaria una fonte cella con acquisizione conveniente. Il sangue è considerato come fonte di cellule ideale in quanto ottenuto attraverso una procedura piuttosto minimamente invasiva 7-9. In questo studio, abbiamo sviluppato una semplice modifica al protocollo generare hiPSCs da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Senza il difficile processo di espansione di un tipo di cellula specifica, come le cellule CD34 +, le cellule del sangue intero o PBMC sono stati in serie placcato su piastre rivestite di matrice per centrifugazione dopo trasduzione con il virus di Sendai contenente fattori Yamanaka. Questo metodo riduce il tempo richiesto per lal&#39;attaccamento delle cellule galleggianti trasdotte e diminuito la perdita di cellule riprogrammate che non erano in grado di collegare in proprio.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Piatto</td><td>TPP&nbsp;</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Provetta cornica da 50 ml</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Provetta cornica da 15 ml</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta monouso da 10 ml</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta monouso da 5 ml</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PBMC Materiali di isolamento</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9805</td><td>Terreni cellulari del sangue</td></tr><tr><td>CC110</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>8697</td><td>Sangue Supplemento di terreni cellulari (100x)</td></tr><tr><td colspan="4">iPSC Materiali per la generazione e la coltura</td></tr><tr><td>CytoTune-iPSC Kit di riprogrammazione Sendai</td><td>Life Technologies</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>Terreni TeSR-E8</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5940</td><td>terreni iPSC</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express (TrypLE)</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>12604-039</td><td>Soluzione</td></tr><tr> per il distacco delle colonie<td colspan="4">Controllo di qualità Materiali</td></tr><tr><td>18 mm Vetro di copertura</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovazione</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Laboratorio vettoriale</td><td>SP-5050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-SSEA4</td><td></td><td>Millipore MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-TRA-1-60 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-TRA-1-81 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H + L) anticorpo</td><td>Sonda molecolare</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio IgG (H + L)</td><td>anticorpo Sonda molecolare</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sonda molecolare</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong oro antisbiadimento reagente</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>vetrino, rivestito&nbsp;</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprilalcol</td><td>Milliporo</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Kit di sintesi di cDNA a primo filamento</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA polimerasi</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE Tampone&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>stella di carico</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1kb (+) Marcatore a scala del DNA</td><td>Enzimiche</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Tampone</td></tr> <tr>di risciacquo<td>Cloruro di sodio</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520.1000</td><td>Tampone di risciacquo</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td>Tampone di risciacquo</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td>Tampone di risciacquo</td></tr></tbody></table>

pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue utilizzando sendai virus e centrifugazione

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Il recente sviluppo di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) ha dimostrato che le cellule somatiche mature possono tornare a una, stato pluripotente indifferenziata. Ora, riprogrammazione avviene con vari tipi di cellule somatiche adulte: cheratinociti, cellule urina, fibroblasti, ecc I primi esperimenti erano solitamente fatto con fibroblasti dermici. Tuttavia, questo richiede una procedura chirurgica invasiva per ottenere fibroblasti da pazienti. Pertanto, cellule in sospensione, come le cellule del sangue e delle urine, sono stati considerati ideali per la riprogrammazione causa della convenienza di ottenere le cellule primarie. Qui, riportiamo un protocollo efficace per la generazione di IPSC dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Con placcatura le PBMC trasdotte in serie ad un nuovo, piastra con centrifugazione a matrice rivestita, questo protocollo può fornire facilmente colonie IPSC. Questo metodo è applicabile anche per le cellule mononucleate del sangue del cordone ombelicale (CBMCs). Questo studio presenta un prot semplice ed efficienteOcol per la riprogrammazione di PBMC e CBMCs.

Questo protocollo presenta un metodo semplice per riprogrammare PBMC isolate da sangue. Utilizzando la combinazione di rivestimento di serie e centrifugazione, iPSCs sono stati generati con successo. Con questo metodo, iPSCs potrebbero essere generati con una piccola quantità di cellule di sangue intero senza isolare o espandere un tipo di cellula specifico. Abbiamo generato con successo iPSCs da solo 1x10 4 celle in una piccola piastra di coltura cellulare. <p class="jove...

Proponiamo un protocollo per la riprogrammazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Placcando le cellule del sangue trasdotte su piastre rivestite di matrice con centrifugazione, le iPSC vengono indotte con successo da cellule galleggianti. Questa tecnica suggerisce un protocollo di riprogrammazione semplice ed efficace per cellule come PBMC e CBMC.

Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

L'obiettivo generale di questo studio è riprogrammare le cellule mononucleate del sangue periferico in cellule staminali pluripotenti indotte, utilizzando un piatto seriale mediante centrifugazione. Inizialmente, le cellule staminali pluripotenti indotte venivano generate riprogrammando i fibroblasti. Oggi, vengono utilizzate varie cellule per la riprogrammazione.Tuttavia, a causa della facile accessibilità del sangue, le PBMC possono rappresentare una fonte cellulare non accettabile per ulteriori applicazioni delle iPSC, nello screening farmacologico, nella modellizzazione delle malattie e nello sviluppo della medicina rigenerativa. Attraverso questo studio, condivideremo un protocollo per la riprogrammazione delle iPSC utilizzando le PBMC mediante l'applicazione di forza centrifuga. Questo protocollo fornirà un'ulteriore opzione nella riprogrammazione di cellule in sospensione.Per dimostrare la procedura, utilizzeremo Nam, uno studente laureato del mio laboratorio. Per isolare le cellule monocitarie, prelevare innanzitutto almeno dieci millilitri di sangue fresco mediante un prelievo ematico in un tubo per preparazione cellulare. Successivamente, trasferire il sangue in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e diluirlo con PBS sterile in un rapporto di uno a quattro.Successivamente, aggiungere dieci millilitri di mezzo a gradiente di densità in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e stratificare con attenzione il sangue diluito sopra il mezzo a gradiente di densità. Quindi, centrifugare il campione a 750 ×g per 30 minuti a temperatura ambiente, senza frenata della centrifuga. Dopo 30 minuti, trasferire con attenzione lo strato di buffy in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.Aggiungere 30 millilitri di PBS e lavare le cellule. Successivamente, centrifugare le cellule a 515 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopodiché, scartare il PBS e risospendere le cellule in 0,5 millilitri di mezzo per cellule del sangue.In seguito, contare le cellule e seminarle in una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere PBS nei pozzetti circostanti per prevenire l'evaporazione. Successivamente, stabilizzare le cellule per cinque giorni a 37 gradi Celsius prima della trasduzione.Aggiungere ulteriori 0,5 millilitri di mezzo fresco per cellule ematiche dal terzo al quarto giorno, senza disturbare le cellule. In questa procedura, trasferire le cellule ematiche in una provetta conica da 15 millilitri e contarle utilizzando un emocitometro. Successivamente, preparare tre volte dieci alla quinta cellule per la trasduzione e centrifugare le cellule a 515 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente.Successivamente, eliminare il soprannatante per aspirazione e risospendere le cellule in 0,5 millilitri di mezzo per cellule ematiche. Quindi, trasferire le cellule in una pozzetta di una piastra a 24 pozzetti non rivestita. Scongelare la miscela del virus Sendai sul ghiaccio e aggiungerla alle cellule sospese.Sigillare la piastra con una pellicola adesiva e centrifugare a 1.150 ×g per 30 minuti a 30 °C. Dopo la centrifugazione, incubare le cellule a 37 °C in 5% di anidride carbonica per tutta la notte. Per rivestire una piastra a 24 pozzetti con vitronectina, il giorno successivo, diluire la soluzione di vitronectina in PBS per ottenere una concentrazione finale di 5 µg/mL.Successivamente, aggiungere un millilitro di vitronettina in una pozzetta e incubare a temperatura ambiente per almeno un'ora. Dopodiché, rimuovere la soluzione di rivestimento e trasferire tutti i mezzi contenenti le cellule e il virus nella pozzetta rivestita. Quindi, raccogliere le cellule rimanenti con un ulteriore 0,5 millilitri di mezzo fresco per cellule ematiche e aggiungerlo alla pozzetta contenente le cellule.Successivamente, centrifugare la piastra a 1.150 ×g per dieci minuti a 35 gradi Celsius e quindi mantenere le cellule a 37 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica durante la notte. Per il secondo trasferimento cellulare, rivestire la pozzetta con cinque microgrammi per millilitro di vitronettina come descritto in precedenza. Utilizzare una pozzetta della piastra per ogni trasduzione e trasferire la sospensione cellulare dalla prima piastra alla nuova piastra rivestita con vitronettina.Nel frattempo, aggiungere un millilitro di mezzo iPSC in una pozzetta della prima piastra per la manutenzione e incubare a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5%, con un cambio giornaliero del mezzo con mezzo iPSC fresco. Le colonie appariranno dal giorno 14 al 21 dopo la trasduzione. Centrifugare la piastra appena rivestita, contenente le cellule in sospensione, a 1.150 ×g a 35 gradi Celsius per dieci minuti.Dopo la centrifugazione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5% per tutta la notte. Il giorno successivo, rimuovere il sopranatante e sostituirlo con un mezzo fresco per cellule staminali pluripotenti indotte. Mantenere le cellule aderenti con un cambio giornaliero del mezzo fino al raggiungimento di una confluenza dell'80%.Una settimana prima della selezione delle colonie, seminare 1 × 10⁴ cellule in una piastra da 100 millimetri rivestita con vitronectina. Successivamente, preparare una piastra da 60 millimetri rivestita con vitronectina aggiungendo due millilitri di soluzione di vitronectina e incubare a temperatura ambiente per almeno un'ora. Osservando al microscopio, segnare con un pennarello le colonie sul fondo della piastra delimitandole chiaramente.Rimuovere la soluzione di vitronectina dalla nuova piastra e aggiungere sei millilitri di terreno per cellule staminali pluripotenti indotte, integrato con dieci millimoli di RHO chinasi. Successivamente, rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e lavarle con tre millilitri di PBS. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione per il distacco delle colonie di iPSC e incubare per 30 secondi a temperatura ambiente.In seguito, rimuovere la soluzione dalla piastra e incubarla a temperatura ambiente per ulteriori 30 secondi. Dopo 30 minuti, prelevare 200 microlitri di terreno dalla piastra e staccare le colonie bersaglio mediante pipettaggio. Successivamente, trasferire le colonie disperse in una nuova piastra da 60 millimetri.Incubare e mantenere le cellule a 37 gradi Celsius in una atmosfera al 5% di anidride carbonica fino al raggiungimento del decimo passaggio. Nelle fasi iniziali del riprogrammamento, le iPSC erano mischiate alle cellule differenziate non riprogrammate adese. Prima dell'ampliamento, era difficile discriminare le iPSC dalle altre cellule.Sezionando le cellule a bassa densità, si sono ottenute colonie di dimensioni sufficienti per essere prelevate. Dopo l'isolamento della colonia, gli aggregati cellulari sono stati dissociati in singole cellule e coltivati. Successivamente, sono state osservate colonie pure di iPSC.Dopo l'espansione delle cellule staminali pluripotenti indotte pure, è stata verificata la qualità delle cellule. Le cellule sono state colorate con fosfatasi alcalina per confermare lo stato indifferenziato delle cellule staminali pluripotenti indotte. Tutte le colonie derivate dalle cellule staminali pluripotenti indotte isolate hanno mostrato una colorazione positiva.I marcatori di pluripotenza sono stati confermati mediante colorazione immunofluorescente. Le cellule riprogrammate esprimevano in alto livello marcatori di pluripotenza, come SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 e, soprattutto, TRA-1-60; l'espressione dei marcatori di pluripotenza è stata confermata mediante RTPCR. Mediante piastre seriali effettuate tramite centrifugazione, è stato ottenuto l'attacco di PBMC ad uso transitorio su una piastra rivestita con matrice.Le cellule si attaccano come previsto e le colonie di iPSC vengono ripetute per una purificazione. Utilizzando questo protocollo, le iPSC possono essere generate da PBMC entro un mese. Questo protocollo riduce il tempo necessario per l'attacco delle cellule transdotte e previene la perdita di cellule riprogrammate che non sono state in grado di attaccarsi autonomamente.Tuttavia, la purificazione di iPSC completamente riprogrammate capaci di formare colonie può risultare critica durante il tentativo di questa procedura. In precedenza, abbiamo riprogrammato con successo PBMC e cellule mononucleate utilizzando questo protocollo. Le iPC derivate da cellule del sangue così ottenute possono essere ampiamente utilizzate in diversi campi della ricerca.Questo protocollo può aiutare il processo di riprogrammazione di altri tipi di cellule in sospensione fluttuanti, per ulteriori applicazioni e studi.

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