Name: Saggi per studiare il ruolo di Vitronectin nelladesione batterica e sulla resistenza del siero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Scopri i saggi per studiare il ruolo della Vitronectina nell'adesione batterica e nella resistenza del siero. Questi metodi aiutano a comprendere le interazioni ospite-patogeno e i meccanismi di virulenza.

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Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dalla Fondazione di Anna ed Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. e fondamento di Edla Johansson, svedese Medical Research Council (concedere numero K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fondazione di cancro all'Università Ospedale a Malmö, della società fisiografica (di Forssman Foundation) e del Consiglio della Contea di Skåne Fondazione ricerca e sviluppo.

1. analisi di Vn come ligando della proteina della superficie batterica
<ol><li>
Rilevamento di Vn-associazione sulla superficie batterica mediante citometria a flusso Nota: In citometria a flusso, abbiamo usato side scatter e forward scatter a cancello eventi positivi. Per esaminare le interazioni con Vn, gli isolati clinici di Hif (n = 10)7 sono stati selezionati insieme a e. coli BL21 (DE3) come controllo negativo (Figura 1A).<ol>
<li>Hif cultura clinica isola nel mezzo di infusione (BHI) cervello-cuore completato con 10 µ g/mL NAD ed Emina a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min. Utilizzare il mezzo di Luria-Bertani alla cultura Escherichia coli14. Raccolta di Hif al Mid-registro fase (OD600 = 0,3)15e risospendere i batteri in tampone fosfato salino (PBS), pH 7,2, contenente 1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) (tampone bloccante; PBS-BSA). Regolare le sospensioni a 109 CFU/mL.</li>
		<li>Trasferire le aliquote che contiene 5 x 106 CFU per provette di turno-fondo polistirene 5 mL (12 x 75 mm2) e aggiungere 1 mL di tampone bloccante. Centrifugare la sospensione a 3.500 × g a temperatura ambiente (TA)16 per 5 min per pellet i batteri, quindi aspirare accuratamente per rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet.</li>
		<li>Risospendere il pellet batterico con 50 μL di tampone bloccante contenente 250 nM Vn e incubare i campioni per 1 h a RT senza agitare. Dopo l'incubazione, pellet i batteri mediante centrifugazione a 3.500 x g per 5 minuti, quindi lavare il pellet tre volte con PBS e passaggi di centrifugazione simili.</li>
		<li>Per il pellet batterico, aggiungere 50 μL di Vn gli anticorpi policlonali di pecore primario anti-umano (Pass) alla diluizione di 1: 100 in PBS-BSA. Incubare la sospensione per 1 h a RT, quindi lavare i batteri tre volte con PBS per rimuovere gli anticorpi non legati (come descritto al punto 1.1.3).</li>
		<li>Successivamente, aggiungere 50 μL di PBS-BSA contenente isotiocianato di fluoresceina (FITC)-coniugato asino delle anti-pecore pAbs (diluizione 1: 100) e incubare a temperatura ambiente per 1 h al buio.</li>
		<li>Preparare un controllo vuoto incubando i batteri con blocco buffer solo e rubriche personali senza Vn.</li>
		<li>Lavare i batteri tre volte con 1 mL di tampone bloccante e pellet la sospensione mediante centrifugazione, come descritto nella sezione 1.1.2. Infine, risospendere il pellet batterico con 300 µ l di PBS e analizzare di flusso cytometry7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi di ELISA dell'interazione tra PH ricombinante e Vn Nota: I controlli devono essere inclusi per escludere il legame non specifico. Proteina umana di fattore H (FH) o C4b-binding (C4BP) vengono utilizzati come controlli positivi e negativi, rispettivamente.<ol>
<li>Diluire ciascuna delle proteine umane (Vn, FH e C4BP) separatamente a 50 nM in Tris-HCl, pH 9.0 (tampone di rivestimento). Pipettare 100 µ l di soluzione proteica in ciascun pozzetto della micropiastra Polysorp. Chiudere le piastre con il coperchio e conservare a 4 ° C durante la notte (16h) per facilitare l'immobilizzazione della proteina su pozzetti della piastra microtiter.</li>
		<li>Scartare la soluzione dalla piastra di microtitolo inclinando a testa in giù sopra il lavandino e lavare i pozzetti tre volte con 300 µ l di PBS/pozzetto. Bloccare i pozzetti per 1 h a RT con PBS contenente 2,5% (p/v) BSA (PBS-BSA).</li>
		<li>Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, lavare i pozzetti tre volte con 300 µ l di PBS contenente 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST) per pozzetto. Aggiungere 100 µ l di 50 ricombinante nM PH His-tag per ogni campione ed incubare per 1 h a TA. Nei pozzetti di controllo, aggiungere solo 100 µ l di PBS-BSA. Nota: Il gene lph codifica PH da Hif è stato amplificato dalla PCR e clonato nel vettore di espressione pET26b che aggiunge un 6 × His-tag al C-terminale della proteina espressa. Il vettore ricombinante è stato trasformato in e. coli BL21 (DE3) per l'espressione. NI-NTA resina è stata usata per purificare la proteina ricombinante15.</li>
		<li>Scartare la soluzione della proteina e rimuovere le proteine non associate lavando i pozzetti tre volte con 300 µ l di PBST. Aggiungere 100 µ l di perossidasi di PBS-BSA contenente rafano (HRP)-coniugato anti-sua pAbs (01:10, 000 diluizione) e incubare per 1 h a TA.</li>
		<li>Preparare soluzione 20 mM A sciogliendo tetrametilbenzidina in una soluzione di 5% di acetone e 45% di metanolo. Per preparare la soluzione B, sciogliere 19,2 g di acido citrico in 1.000 mL di H2O, regolare il pH a 4,25 aggiungendo KOH, quindi aggiungere 230 µ l di 30% H2O2. Conservare entrambe le soluzioni al buio a TA. Appena prima dell'uso, mescolare 500 µ l di soluzione B con 9,5 mL di soluzione A per preparare il reagente di rivelazione di ELISA.</li>
		<li>Lavare i pozzetti tre volte con 300 µ l di PBST e rilevare i complessi antigene-anticorpo aggiungendo 100 µ l di reagente di rivelazione di ELISA ad ogni pozzetto.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di 1 M H2così4/well per arrestare la reazione. Misurare la densità ottica dei pozzetti a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Studio della cinetica di interazione di ricombinante PH e Vn utilizzando BLI
	<ol>
<li>Immobilizzare Vn umano sui sensori ammina-reattivo utilizzando l'ammina accoppiamento metodo, secondo linee guida11 del produttore.</li>
		<li>Con PBS, in serie diluire il ligando (ricombinante PH) da 0 a 4 µM e trasferire le soluzioni risultante per micropiastra 96 pozzetti neri, fondo piatto. Eseguire l'esperimento a 30 ° C, utilizzando un BLI strumento17.</li>
		<li>Caricare la cartella di dati del software di analisi dati BLI. Selezionare l'opzione 'selezione sensore' . Quindi, seleziona 'riferimento ben' (rivestite con Vn sensore in PBS) per sottrazione.</li>
		<li>Selezionare 'allineamento asse y alla linea di base' e selezionare 'interstep correzione e allineare all'associazione'. Premere 'processo dati' che automaticamente si aprirà la scheda di analisi.</li>
		<li>Nella scheda analisi, selezionare l'opzione 'associazione e dissociazione' in curva. Selezionare il modello di ' associazione 1:1 e raccordo globale '. Premere 'forma curva' e l'esportazione di montaggio dati17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. caratterizzazione del ruolo di Vn in aderenza batterica
<ol><li>
Studio di aderenza batterica alle superfici di vetro rivestite con Vn
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di 2 µ g/mL di Vn in tampone PBS e dispensare 10 µ l di questa soluzione su un microscopio di vetro scorrevole come una sola goccia. Consentire la discesa ad asciugare il vetrino per 30 min a RT. cappotto una diapositiva con albumina sierica umana (HSA) come controllo negativo.</li>
		<li>Lavare tre volte le diapositive di vetro rivestite con proteina immergendo i vetrini per due secondi in un becher contenente PBS per rimuovere l'eccesso di proteine non patinata. Aggiungere 20 mL di coltura fresca di Hif (descritto al punto 1.1.1) in una capsula Petri in plastica sterile e immergere il Vn- / slides vetro rivestite con HSA nel terreno di coltura. Incubare i piatti a 37 ° C per 1 h con agitazione a 20 giri/min. Nota: Hif M10 e Hif M10Δlph erano coltivate in terreno BHI liquido o su piastre di agar cioccolato. Il mezzo per il mutante lph è stato completato con 10 µ g/mL kanamicina15.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, rimuovere eventuali batteri non associati immergendo i vetrini tre volte in un becher pieno di PBS. Visualizzare i batteri di colorazione di Gram, come descritto.<ol>
<li>Rimuovere l'eccesso di PBS da ogni diapositiva di inclinarla e toccando il bordo sulla carta velina. Asciugare i vetrini per 3-5 min a RT e difficoltà batteri aderiti passando ogni diapositiva tre volte sopra una fiamma.</li>
			<li>Tenendo il vetrino per le estremità con due dita su un vassoio di colorazione, quindi aggiungere 3-4 gocce (200 – 300 µ l) di soluzione viola di cristallo del 2,3%. Attendere 60 s, quindi lavare i vetrini sotto una leggera corrente di rubinetto acqua per 3 – 4 s.</li>
			<li>Aggiungere 3-4 gocce di 0,33% soluzione di iodio sulle diapositive. Attendere 1 minuto, quindi sciacquare il vetrino sotto un leggero getto d'acqua del rubinetto. Asciugare accuratamente le diapositive di carta assorbente.</li>
			<li>Aggiungere 3-4 gocce di soluzione decolorante contenente alcool isopropilico al 75% e 25% acetone nella diapositiva. Dopo 5 – 10 s, lavare il vetrino sotto un leggero getto d'acqua del rubinetto.</li>
			<li>Aggiungere 3-4 gocce (200 – 300 µ l) di soluzione di base carbolfuchsin. Attendere 1 minuto, quindi risciacquare le diapositive sotto un leggero getto d'acqua del rubinetto. Asciugare le diapositive utilizzando la carta assorbente.</li>
			<li>Visualizzare i batteri sotto un microscopio chiaro, selezionando un obiettivo a immersione in olio a 100 X ingrandimento18. Confrontare l'aderenza di Hif WT e mutanti batteri sulle superfici di vetro rivestito di Vn e HSA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Studio di aderenza Vn-dipendente dei batteri alle cellule epiteliali Nota: Questa analisi efficiente aderenza è stata usata in nostri precedenti studi4,7.<ol>
<li>Cellule A549 di cultura (cellule epiteliali alveolari di tipo II) in un matraccio di cultura del tessuto 75 cm2 con F12 supplementato con 10% di siero fetale di vitello (vol/vol) (FCS) (sostanza completa) e 5 µ g/mL Gentamicina. Incubare la beuta in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C per 3 giorni fino al 80% confluenti (confluency può essere stimato mediante visualizzazione copertura superficiale da parte delle cellule usando microscopio invertito). I quattro passaggi seguenti descrivono come preparare le cellule epiteliali per il dosaggio19,20.<ol>
<li>Lavare il monostrato cellulare nel pallone due volte con 20 mL di PBS di agitando delicatamente. Per staccare le cellule dalla superficie del pallone, aggiungere 2 mL di soluzione di enzima di distacco delle cellule e incubare la beuta per 5 min a 37 ° C. Tocca il pallone con il palmo della mano per staccare tutte le celle dalla superficie plastica. Pipettare su e giù un paio di volte per disperdere i ciuffi delle cellule.</li>
			<li>Aggiungere 18 mL di terreno completo F12 il matraccio e trasferire la sospensione cellulare intero in una provetta sterile da Falcon 50 mL. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 200 x g a RT e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno completo F12.</li>
			<li>Rimuovere 10 µ l di sospensione cellulare e metterlo in una provetta Eppendorf, quindi aggiungere 90 µ l di soluzione di blu di Trypan. Caricare il campione in un emocitometro (profondità 0,1 mm) dopo aver posizionato il vetrino coprioggetti.</li>
			<li>Contare tutte le cellule vitali nelle aree A, B, C e D (ogni campo è costituito da 16 quadrati e ogni piazza ha una superficie di 0,0025 mm2), quindi calcolare il numero medio di cellule ([A + B + C + D] / 4). Calcolare il numero di cellule per millilitro usando la seguente equazione: Vitali cellule/mL = media delle celle totali × 104 × diluizione fattore20. Nota: Qui, il fattore di diluizione è 10.</li>
			<li>Diluire la sospensione cellulare a 5.0 x 103 cellule/mL utilizzando media completa contenente gentamicina 5 µ g/mL. Dispensare 500 µ l di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO2 fino a quando le cellule sono 90% confluenti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prima dell'infezione batterica, rimuovere il supporto dai pozzetti e aggiungere mezzo F12 (senza FCS), quindi incubare per una notte a 37 ° C.</li>
		<li>Lavare il monostrato cellulare tre volte con 500 µ l di PBS a RT. Posizionare la piastra sul ghiaccio e aggiungere 100 µ l di pre-refrigerati F12 mezzo, contenente 10 µ g/mL di piastra Vn. Incubare a 4 ° C per 1 h. Per pozzetti di controllo, aggiungere solo F12 medio.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, scartare la soluzione pipettando e lavare lo strato delle cellule due volte con 1 mL di PBS a RT. Risospendere una cultura di recente sviluppata Hif M10 (punto 1.1.1) nel mezzo di F12 (2 × 108 CFU/mL). Aggiungere 100 µ l della sospensione batterica in ciascun pozzetto e incubare la piastra per 2 ore a 37 ° C. Nota: Ciascun pozzetto contiene circa 2 x 105 A549 cellule. Per l'infezione, 2 x 107 CFU batterica sono stati aggiunti, corrispondente ad una molteplicità di infezione di 100.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo di pipettaggio e lavare le cellule epiteliali A549 tre volte con PBS. Aggiungere 50 µ l/pozzetto di soluzione di distacco delle cellule e incubare la piastra per 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Successivamente, aggiungere 50 µ l di terreno completo F12 per pozzetto per fermare la reazione enzimatica. Trasferire le cellule epiteliali (≈ 100 μL [cioè, l'intero volume]) da ciascun pozzetto in una provetta di vetro da 6 mL contenente quattro perle di vetro. Lisare le cellule a RT nel Vortex per 2 min.</li>
		<li>Diluire 10 µ l della cella lysata 100 volte aggiungendo 10 µ l di lisato di 990 µ l di terreno di F12. Piastra 10 µ l del campione diluito su una piastra di agar cioccolato.</li>
		<li>Incubare la piastra di agar cioccolato a 37 ° C durante la notte, poi contare le colonie. Ogni Colonia rappresenta un CFU.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analisi della resistenza Vn-dipendente per l'attività battericida del siero umano
<ol><li>NHS di acquisto da una fonte commerciale. Preparare VDS come descritto in precedenza12. Ricostituire il VDS con 180 nM Vn che equivale a Vn presente nel NHS.</li>
	<li>Preparate del siero inattivato per calore (HIS) scaldando NHS a 56 ° C per 30 min al fine di inattivare proteine del complemento. Nota: La concentrazione ottimale del siero (5%) e il tempo di incubazione (15 min) per il dosaggio descritto nei passaggi 3.3 – 3.7 sono stati determinati empiricamente per Hif15; questi parametri potrebbero variare per altri batteri patogeni.</li>
	<li>Cultura di batteri (in questo caso, Hif M10 e il mutante Hif M10Δlph) alla fase di Mid-registro (OD600 = 0,3). A pellet batteri mediante centrifugazione a 3.500 x g per 10 min.</li>
	<li>Risospendere il pellet batterico con 1 volume di gelatina destrosio glucosio contenente tampone (DGVB ++; pH 7.3) Veronal del 2,5% (p/v), 2 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2e 0.1% (wt/vol) gelatina.</li>
	<li>Aggiungere 1,5 x 103 CFU di batteri a 100 µ l di DGVB ++ contenente 5% di siero (NHS, suo, VDS, o VDS + 180 nM Vn). Incubare il campione a 37 ° C per 15 minuti con agitazione a 300 giri/min.</li>
	<li>Rimuovere un aliquota 10 µ l dalla miscela di reazione a 0 min (esempio di T0 ) e 15 min (esempio dit T) e piastra su agar cioccolato. Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Dopo incubazione, contare le colonie che appaiono sulla piastra. Calcolare la percentuale di batteri uccisi12 utilizzando la seguente equazione: (CFU a Tt) / (CFU T0) × 100.</li>
</ol>

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<li>Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+A549+cell+line+as+a+type+II+pulmonary+epithelial+cell+model+for+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism.</a> Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).</li>
<li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li>
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<li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interessi finanziari.

Batteri patogeni reclutano Vn alla superficie delle cellule e utilizzano questo regolatore di complemento per impedire la deposizione di fattori del complemento e completamento del complesso membrana attacco2. VN funziona anche come una molecola di ponte tra proteine di superficie batteriche e host recettori di superficie, consentendo in tal modo gli agenti patogeni di aderire alla superficie delle cellule epiteliali e successivamente mediare interiorizzazione. In questo studio, descriviamo i prot...

Vitronectina (Vn) è una glicoproteina umana importante coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi via il regolamento del sistema fibrinolitico. VN funziona anche come un regolatore di complemento inibendo la via di complemento terminale durante la formazione del complesso C5b6-7 e polimerizzazione C9. Parecchi agenti patogeni batterici sono stati indicati per reclutare Vn alla superficie delle cellule come mezzo di resistenza complemento deposizione1,2,3. Inoltre, Vn funziona come una molecola di "sandwich" tra batteri e recettori delle cellule epiteliali di host, quindi promuovere l'aderenza e interiorizzazione dei patogeni2,4,5. Associazione di Vn alla superficie delle cellule batteriche è mediata da altre proteine attualmente non identificati. Completamente delucidare il ruolo funzionale di Vn-associazione di evasione della risposta immunitaria tubo richiederà pertanto l'identificazione di proteine Vn-recruiting.
Il primo passo nell'identificazione di proteine che legano il Vn è per verificare se un agente patogeno di interesse possibile associare purificata Vn. flusso cytometry è un metodo pratico e semplice per determinare se Vn è associato a patogeni e cellule. In questo studio, abbiamo valutato l'associazione di Vn da vari Haemophilus influenzae tipo f (Hif) isolati clinici6. Il metodo qui descritto è quantitativo e può essere utilizzato per distinguere la capacità di legame di una grande varietà di ceppi batterici. In uno studio precedente, abbiamo caratterizzato la proteina H (PH) di Hif come Vn-legante della proteina7. Di conseguenza, nello studio presente, il potenziale di Vn-associazione dei mutanti di wild type (WT) Hif e Hif M10Δlph sono stati confrontati usando i protocolli descritti.
Una volta che è stato stabilito che un agente patogeno lega Vn, il secondo passo è di caratterizzare il proteoma di superficie al fine di identificare potenziali proteine che legano il Vn. Una varietà di approcci può essere utilizzata per questo scopo8,9, ma queste metodologie non sono descritti in questo rapporto. Il metodo più adatto per l'esame di interazioni proteina-proteina è recombinantly esprimere proteine di superficie batteriche selezionate in e. coli e purificare dalla cromatografia di affinità. Qui, usiamo il PH e la sua interazione molecolare con Vn per illustrare il metodo. Interazioni tra ricombinante PH e Vn sono state caratterizzate utilizzando un enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) l'analisi7 e una tecnica sviluppata di recente privo di etichetta, conosciuta come bio-strato interferometria (BLI)10,11. Mentre Elisa può essere utilizzata per confermare le interazioni proteina-proteina, BLI fornisce dati dettagliati per quanto riguarda i parametri cinetici delle interazioni.
Per studiare il ruolo funzionale di Vn in aderenza batterica, possono essere utilizzati due diversi saggi. Il primo test qui descritto è la misura diretta di aderenza batterica sulle superfici di vetro rivestite con Vn, mentre il secondo saggio esamina l'aderenza alla superficie delle cellule epiteliali. Per il primo test, lastre di vetro sono stati rivestiti con Vn, e l'associazione di WT o ceppi mutanti di Hif è stata valutata da microscopia e colorazione di Gram. Questa tecnica si distingue facilmente batteri basati sulla capacità di associare Vn12. Adesione batterica alle cellule dei mammiferi è stato quindi analizzato aggiungendo batteri coltivati su un monostrato di cellule epiteliali alveolari di II tipo; allegato batterica è stata valutata contando il numero di formazione di colonie (CFUs) unità. Aderito e interiorizzati batteri possono essere distinti in presenza o assenza di Vn4,13.
Il ruolo di acquisizione Vn in resistenza batterica del siero è stato valutato usando un'analisi di uccisione del siero (cioè, l'attività battericida del siero). Per valutare l'importanza di Vn acquisizione nella resistenza del siero, l'attività battericida del siero Vn-vuotati (VDS) è stata confrontata con quella di siero umano normale (NHS). Il metodo utilizzato prontamente distingue Vn-associazione contro batteri vincolanti basati sulla resistenza del siero. Abbiamo usato questo metodo per studiare il ruolo di Vn nella resistenza del siero di diversi batteri patogeni4,12.
Sono stati segnalati numerosi metodi per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Qui, descriviamo una serie di protocolli che possono essere facilmente adattate per lo studio di qualsiasi agente patogeno al fine di valutare il ruolo di Vn nella patogenesi. Abbiamo testato questi protocolli usando vari agenti patogeni, e Hif è stato scelto come esempio per questo report.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL thermomixter</td><td>Eppendorf</td><td>5355</td> blocco <td>secco riscaldamento e raffreddamento shaker</td></tr><tr><td>5 mL tubo in polistirene a fondo tondo&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>60819-138</td><td>12 &times; 75 mm stile</td></tr><tr><td>5% CO2 fornito incubatore&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BBD6220</tr><tr><td>provetta a fondo tondo in polistirene da 6 mL</td><td>VWR</td><td>89000-478</td><td>12 &times; 75 mm con tappo</td></tr><tr><td>piastre a 24 pozzetti</td><td>BD Falcon</td><td>08-772-1H</td><td>Grado di coltura cellulare</td></tr><tr><td>30% Perossido di idrogeno (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Grado per analisi di laboratorio</td></tr><tr><td>75 cm2 pallone per coltura tissutale</td><td>BD Falcon</td><td>BD353136</td><td>Vented</td></tr><tr><td>Piastra a fondo piatto nera a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>Coltura tissutale trattata & micro; Piastre nere trasparenti</td></tr><tr><td>A549 Linea cellulare umana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86012804-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di distacco cellulare (Accutasi)&nbsp;</td>Sensori AR2G di <td>grado per coltura cellulare</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-500ML</td></tr><tr><td></td><td>Pall Life Science</td><td>18-5095</td><td>Sensore per proteina immobilizzata mediante accoppiamento amminico&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>97064-786</td><td></td></tr><tr><td>Albumine di siero bovino di grado di analisi (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>Adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>Carta bibulosa&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28511-007</td><td></td></tr><tr><td>Interferometro a biostrato</td><td>Pall Life Science</td><td>FB-50258</td><td>Apparecchiatura di misurazione dell'interferometria a doppio strato</td></tr><tr><td>Soluzione cristallovioletto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td></td></tr><tr><td>C4BP (proteina legante C4b)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>Acquistato come Congelato in forma liquida</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di carbol-fucsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT8018-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500G</td><td>American Chemical Society (ACS) grado</td></tr><tr>Soluzione<td>decolorante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>E. coli ospite (E. coli BL21)</td><td>Novagen</td><td>69450-3</td><td>Ospite di espressione proteica</td></tr><tr><td>F12 medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Citometro a flusso per colture cellulari</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>651154</td><td>Grado di analisi cellulare per applicazioni di ricerca&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>Adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>Siero umano normale (NHS)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>NHS</td><td>Pooled siero umano</td></tr><tr><td>coniugato con FITC anticorpi anti-pecora dell'asino&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR88F</td><td>Gentamicina policlonale</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>Grado di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>Adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Marienfeld</td><td>640210</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi anti-His tag coniugati HRP</td><td>Abcam</td><td>ab1269</td><td>Fattore umano policlonale</td></tr><tr><td>H</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A137</td><td>Acquistato come liquido congelato da</td></tr><tr><td>C4BP</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>Soluzione congelata</td></tr><tr><td>Albumina sierica umana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1653-10G</td><td>polvere liofilizzata</td></tr><tr><td>Istidina colonna in resina di affinità (HisTrap HP)</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>17-5247-01</td><td>Colonne preimpaccate con Ni Sepharose</td></tr><tr><td>PH marcato</td><td></td><td></td><td>in modo ricombinante espresso e purificato nel nostro laboratorio</td></tr><tr><td>Soluzione di iodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT902-8FOZ</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>VWR</td><td>BDH1135-1LP</td><td>Grado di analisi</td></tr><tr><td>&nbsp; Microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>Microscopio invertito</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>liscio, dimensioni 25 mm &volte; 75 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide contenente C terminale 6x His-tag sulla spina dorsale (pET26(b))</td><td>Novagen</td><td>69862-3</td><td>Vettore di DNA</td></tr><tr><td>Piastre per microtitolazione in polisorbo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9410</td><td>per idrossido di potassio ELISA</td></tr><tr><td>(KOH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>6009</td><td>American Chemical Society (ACS) grado</td></tr><tr><td>Pecora anticorpi Vn</td><td>AbD Serotec</td><td>AHP396</td> Agitatore <td>policlonale</td></tr><tr><td></td><td>Stuart Scientific</td><td>STR6</td><td>Agitatore a piattaforma</td></tr><tr><td>Pallone per colture tissutali</td><td>BD Falcon</td><td>3175167</td><td>75 cm2</td></tr><tr><td>&nbsp; Termomiscelatore&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3317</td><td>Agitatore di riscaldamento e raffreddamento a blocco secco</td></tr><tr><td>Tetrametilbenzidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860336-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina (Vn)</td> di grado ELISA da plasma umano <td>Sigma-Aldrich</td><td>V8379-50UG</td><td>grado di coltura cellulare</td></tr></tbody></table>

saggi per studiare il ruolo di vitronectin nell'adesione batterica e sulla resistenza del siero

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

I batteri utilizzare regolatori di complemento come mezzo per eludere la risposta immunitaria. Qui, descriviamo protocolli per valutare l'acquisizione di vitronectin ruolo presso i giochi di superficie delle cellule batteriche nella resistenza al sistema immunitario dell'ospite. Esperimenti di citometria a flusso identificato vitronectina plasmatica umana come un legante per la proteina della membrana esterna batterica del recettore H di Hemophilus influenzae tipo f. Un'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente è stata impiegata per caratterizzare le interazioni proteina-proteina tra proteina ricombinante purificata H e vitronectina e affinità di legame è stata valutata mediante interferometria bio-strato. L'importanza biologica del legame di vitronectin alla proteina H alla superficie delle cellule batteriche di evasione della risposta immunitaria ospite è stata confermata usando un'analisi di resistenza di siero con siero umano normale e vitronectina-vuotati. L'importanza di vitronectin in aderenza batterica è stata analizzata utilizzando lastre di vetro con e senza rivestimento vitronectina, seguita dalla macchiatura di grammo. Infine, è stata studiata l'adesione batterica di monostrati di cellule epiteliali alveolari umane. I protocolli descritti qui possono essere facilmente adattati per lo studio di qualsiasi specie batteriche di interesse.

VN-si legano alla superficie dei batteri è stato determinato tramite flusso cytometry. Tutti Hif isolati clinici testati in questo studio ha reclutato Vn alla superficie delle cellule. Alcuna interazione di Vn con superficie delle cellule è stata osservata per il ceppo di controllo negativo Escherichia coli (Figura 1A). Come illustrato nella Figura 1B, PH è una proteina legante il Vn pri...

Questo rapporto descrive protocolli per caratterizzare le interazioni tra proteine della membrana esterna batterica e la vitronectina regolatore complemento umano. I protocolli possono essere utilizzati per studiare le reazioni di associazione e la funzione biologica di vitronectin in qualsiasi specie batteriche.

Saggi per studiare il ruolo di Vitronectin nell'adesione batterica e sulla resistenza del siero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione ospite-patogeno come il modo in cui gli agenti patogeni batterici causano malattie nell'uomo utilizzando proteine umane. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può rispondere se qualsiasi agente patogeno può utilizzare vitronectina per stabilire l'infezione dell'ospite. Ci concentreremo sulla Vitronectina, una proteina ospite che prende parte alla matrice extracellulare, ma funziona anche come inibitore del complemento nella via determinante dell'attivazione del complemento.Questi fatti sono molto importanti e molto attraenti per gli agenti patogeni che causano malattie nell'uomo. Per prepararsi alla citometria del flusso, rimorsipare i pellet batterici con 50 microlitri di tampone di blocco contenente 250 vitronectina nanomolare. Quindi, incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente senza tremare.Dopo l'incubazione, pellet i batteri per centrifugazione a 3.500 g per cinque minuti. Quindi, lavare i pellet tre volte utilizzando PBS e passaggi di centrifugazione simili. Dopo il lavaggio, aggiungere 50 microlitri di anticorpi policlonali di vitronectina antiumani delle pecore primarie a

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo protocollo è un test semplice adesione batterica che consiste nel contare il numero di unità formanti colonie batteriche che vengano rispettate su cellule in coltura. Il test è robusto, indipendente dal adesina studiato, e numerose varianti vengono utilizzate nella maggior parte dei laboratori che lavorano su patogenesi batterica.

In vitro di Adesione batterica su mammiferi cellule epiteliali

Questo video descrive una tecnica basata su ELISA che rileva le interazioni proteina-proteina tra due proteine misurando il legame della seconda proteina alla prima proteina immobilizzata. La seconda proteina legata viene rilevata utilizzando anticorpi specifici marcati con un enzima, come la perossidasi di rafano.

Metodo basato su ELISA per analizzare le interazioni tra le proteine dell'esca e della preda

In questo video, dimostriamo un test per studiare il ruolo della vitronectina nell'aderenza di Haemophilus influenzae alle cellule epiteliali dell'ospite.

Un test per studiare il ruolo della vitronectina nell'aderenza batterica alle cellule epiteliali dell'ospite

Questo video dimostra il ruolo della vitronectina, una glicoproteina sierica umana, sulla resistenza batterica. Gli anticorpi nel siero interagiscono con le proteine della superficie batterica, attivando le proteine del complemento e formando il complesso di attacco alla membrana, causando la lisi cellulare batterica. Il legame della vitronectina sulla proteina della membrana batterica impedisce la formazione del complesso di attacco alla membrana, con conseguente sopravvivenza batterica.

Determinazione del ruolo della vitronectina nella resistenza batterica all'attività battericida del siero umano

In questo video, dimostriamo un test che utilizza la microscopia a fluorescenza per rilevare l'adesione delle cellule tumorali alle trappole extracellulari dei neutrofili (NET). Nei pozzetti di prova, c'è un notevole aumento del numero di cellule tumorali marcate in fluorescenza che aderiscono ai NET, mentre i pozzetti trattati con DNasi mostrano una ridotta adesione delle cellule tumorali ai NET.

Saggio di adesione in vitro per rilevare l'aderenza delle cellule tumorali alle trappole extracellulari dei neutrofili

Questo video dimostra il rilevamento dell'interazione della vitronectina con le proteine di superficie batteriche. L'analisi di citometria a flusso misura il segnale di fluorescenza di anticorpi marcati in fluorescenza legati alla vitronectina, confermandone la presenza sulla superficie batterica. Questa tecnica fornisce informazioni sulle interazioni ospite-patogeno e sulle potenziali terapie per le infezioni batteriche.

Rilevamento del legame della vitronectina alle superfici batteriche mediante citometria a flusso

L'adesione dei neutrofili all'endotelio attivato nei siti di infezione è una componente integrale della risposta infiammatoria dell'ospite. Descritto in questo rapporto è un saggio di legame dei neutrofili che permette...

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

Per studiare l'interazione dei batteri con i vasi sanguigni sottoposti a stress di taglio, vengono descritti una camera di flusso e un modello di microscopia intravitale mesenterica in vivo che consentono di sezionare i fattori batterici e dell'ospite che contribuiscono all'adesione vascolare.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

L'attaccamento batterico alle cellule ospiti è un passaggio fondamentale durante la colonizzazione e l'infezione dell'ospite. Questo protocollo descrive la generazione di adesine ricombinanti accoppiate a polimeri come materiali biomimetici che consentono l'analisi del contributo delle singole adesine a questi processi, indipendentemente da altri fattori batterici.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Un metodo è descritto qui per la determinazione dell'associazione e della competizione inter-regno (batterica e fungina) per l'adesione ai monostrati di cellule HeLa infettate da virus. Questo protocollo può essere esteso a più combinazioni di procarioti, eucarioti e virus.

Determinazione del biofilm iniziazione su cellule infettate da virus da batteri e funghi

Viene fornito un protocollo dettagliato per l'imaging di singole piastrine in migrazione utilizzando cavi avidina-biotina funzionalizzati con RGD con densità regolabile, rivelando che le piastrine generano una forza sufficiente per rompere il legame avidina-biotina.

Un test in vitro per studiare la migrazione piastrinica utilizzando tethers avidina-biotina funzionalizzati con RGD

Scopri i saggi per studiare il ruolo della Vitronectina nell'adesione batterica e nella resistenza del siero. Questi metodi aiutano a comprendere le interazioni ospite-patogeno e i meccanismi di virulenza.

Saggi per studiare il ruolo di Vitronectin nell'adesione batterica e sulla resistenza del siero

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