Name: Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Scopri un modello animale avanzato per studiare la colonizzazione epatica da cloni tumorali metastatici del cancro colorettale. Questa tecnica consente la visualizzazione quantitativa in vivo ed ex vivo per migliorare diagnostica e terapia.

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Vorremmo ringraziare il Dott Geoffrey L. Greene (Università di Chicago) per il plasmide luc2-tdTomato e la linea cellulare HCT116, Mr. Ani Solanki (Resource Center Animale) per la gestione topi, e il Dr. Lara Leoni per l&#39;assistenza con il DLIT. Quantificazioni di intensità di fluorescenza e luminescenti sono stati eseguiti in Small Animal Imaging integrata delle risorse di ricerca presso l&#39;Università di Chicago su un Spectrum IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Questo lavoro è stato sostenuto dalla Virginia e Fondo Ludwig DK per la ricerca sul cancro, il Lung Cancer Research Foundation (LCRF), il Prostate Cancer Foundation (PCF), e il Cancer Center Support Grant (P30CA014599). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta dei dati e l&#39;analisi, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa presso l&#39;Università di Chicago (protocollo # 72.213-09) ed eseguite in condizioni sterili. 1. preparati <ol><li> Rendere 500 ml di terreno per la coltura di cellule tumorali HCT116: Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 100 U / mL di penicillina, e 100 mg / mL di streptomicina. </li><li> Autoclave gli strumenti da utilizzare per il modello iniezione milza, di cui 3 - 4 asciugamani chirurgiche, garze, due piccoli pickup Adson, un driver ago, due paia di forbici, un morsetto, e 3 microclips, a 251 ° C per 20 minuti . </li><li> Preparare anestesia postoperatoria per i topi, da somministrare per via sottocutanea dopo l&#39;iniezione milza. Diluire 2-4 mg di buprenorfina in 500 ml di soluzione salina allo 0,9 normale per il mouse. </li><li> Preparare aliquote di 150 mg / 150 ml di luciferina lucciola per iniezioni intraperitoneali During i saggi di bioluminescenza. Conservare a -20 ° C e al riparo dalla luce. </li></ol> 2. Generazione di luciferasi / tdTomato-etichettati monoclonali linee cellulari 10,11 <ol><li> Scongelare e mantenere umani cellule del cancro del colon-retto e HCT116 293FT cellule renali di embrioni umani in DMEM con 10% FBS, 100 U / mL di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina. Mantenere in cultura al 5% di CO 2 e 37 ° C. </li><li> Produrre un lentivirus alto titolo. <ol><li> Su D 1, piastra di 10 - 12 x 10 6 293FT cellule tra il passaggio 3 e 10 a 15 cm piatti di coltura di cellule in 18 ml di DMEM completo (cDMEM) con il 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e acidi non essenziali amino 1% . Incubare a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Su D 2, trasfezione le cellule utilizzando la seguente soluzione trasfezione: <ol><li> Per ogni piatto, utilizzare il seguente: una miscela di DNA di 37,5 mg di pFUG vettori lentivirali inserito con la luciferasi (luc2) e tdTomatocostruisce 11 (un dono del Dr. Geoffrey Greene presso l&#39;Università di Chicago), 25 mg di pCMVΔ8.74, e 12,5 mg di pMD2.G risospese in un totale di 1.062 ml di H 2 O. sterili Aggiungere 188 ml di 2 M CaCl 2. </li><li> Aggiungere 1,250 ml di 2x Hepes-buffered saline (HBS, 50 mM Hepes, 1,5 mM Na 2 HPO 4, e 180 mM NaCl, pH 7.12) alla soluzione di DNA / CaCl 2, una goccia alla volta, mentre soffia bolle attraverso la soluzione con una pipetta. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 20 min, e quindi aggiungere 15,5 ml di RT cDMEM e clorochina per effettuare una concentrazione finale di 25 pM. </li></ol></li><li> Aspirare i media in ogni piatto di 293FT cellule e sostituirlo con la soluzione di trasfezione. Aggiungere 16 ml di soluzione di trasfezione lentamente, come le cellule placcato facilmente sloggiare. </li><li> Su D 3, dopo 8 - 16 ore, rimuovere la soluzione di trasfezione e lavare le cellule una volta con fosfato Dulbecco-Buffered Saline (DPBS), ancora una volta taking cura di non rimuovere le cellule. Sostituire il supporto con 18 ml di cDMEM fresca con 10 mM Hepes. NOTA: spostare lentamente piatti, aspirare la soluzione di trasfezione, e aggiungere i media attraverso la parete laterale di lastre in modo da non rimuovere le cellule. </li><li> Il D 4, a 48 h dal momento della transfezione, raccogliere i supporti dai piatti aspirando lentamente con una pipetta in modo da non staccare le cellule. Centrifuga i media raccolti a 300 xg per 5 minuti per far precipitare la grande detriti cellulari. </li><li> Filtrare il surnatante virale utilizzando un 0,45 micron a basso legame proteico beuta per filtrazione e centrifugare utilizzando un rotore SW-28 per 2 ore a 50.000 xg e 4 ° C. Decantare il surnatante immediatamente dopo la fine centrifugazione e asciugare l&#39;interno del tubo con tergicristalli. </li><li> Risospendere il pellet virale in 50 ml di siero ridotto Medium (RSM) con 1% FBS. Aliquote possono essere conservati a -80 ° C per un uso futuro (virale magazzino). </li></ol></li><li> Trasdurre il lentiviruses nelle cellule HCT116 e generano un pannello di cloni tdTomato-positivi. <ol><li> Piastra le cellule HCT116 ad una densità di 1 x 10 5 a 24 pozzetti 1 d prima dell&#39;infezione virale. </li><li> Diluire 40 ml di virus risospeso (da 2.2.7) in 4 mL di RSM (diluizione 1: 100) con 1% di penicillina / streptomicina e 8 mg / mL polibrene (CRSM). </li><li> Il giorno di infezione, lavare le cellule una volta con DPBS, e quindi aggiungere 250 ml di virus diluito dal punto 2.3.2 in ogni pozzetto. Incubare per 4 ore a 37 ° C e 5% CO 2, e quindi aggiungere 1 ml di cDMEM a ciascun pozzetto; incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per il 48 - 72 ore. </li><li> Risospendere le cellule con 1 ml di 0,05% tripsina e 0,53 mM EDTA, e poi aggiungere 1 ml di cDMEM per neutralizzare la tripsina. Trasferire le cellule in una provetta e pellet a 300 xg per 4 minuti. Lavare il 3x pellet in 1 ml di soluzione Hanks &#39;salina bilanciata (HBSS) più 2% FBS. </li><li> Risospendere il pellet dal punto 2.3.4con FACS tampone (2% FBCS e 2 mM EDTA in PBS) in una cella singola sospensione a 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Ordina le cellule HCT116 tdTomato-positivo con un cell sorter, gating per le cellule in PE-positivo (eccitazione / emissione: 556/585 nm). Far crescere le cellule raccolte in un piatto di 10 cm al 5% di CO 2 e 37 ° C per generare cellule HCT116 tdTomato-positivo parentali (Figura 1A). </li><li> Risospendere le cellule HCT116 tdTomato-positivi parentali da 2.3.6 con 8 mL di 0,05% tripsina e 0,53 mM EDTA da 3 - 5 minuti, e quindi aggiungere 8 mL di cDMEM per neutralizzare la tripsina. <ol><li> Trasferire le cellule in una provetta e pellet da 50 ml a 300 xg per 4 minuti. Rimuovere il surnatante e diluire le cellule HCT116 tdTomato-positivi genitori per 1 cella per 200 ml a cDMEM (Figura 1B). </li></ol></li><li> Piatto una singola cella (200 microlitri della diluizione) per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti a 5% di CO 2 e 37 ° C (Figura 1C). </li><li> Grow singoli monoclones in fusti al 5% di CO 2 e 37 ° C. (Figura 1D). </li></ol></li></ol> 3. Calibrazione di intensità del segnale fluorescente in funzione del numero di cellule <ol><li> Piastra le cellule HCT116 trasfettate, ora denominato HCT116-L2T, ad una densità di 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4 e 10 5 cellule / pozzetto in piastre da 96 pozzetti in triplicato per ogni densità. </li><li> Dopo 5 ore di incubazione, di quantificare le intensità fluorescenti tdTomato utilizzando IVIS 10. <ol><li> Fare clic sull&#39;icona del software di immagine sul desktop per avviare il software. Fare clic sul pulsante &quot;Initialize&quot; per inizializzare il sistema di imaging. Al termine di inizializzazione (che dura circa pochi minuti), selezionare, &quot;4 secondi&quot; il tempo di esposizione, binning &quot;fluorescenza&quot; &quot;Medium&quot;, &quot;2&quot; F / stop, &quot;535&quot; filtro di eccitazione,e &quot;580&quot; filtro per le emissioni. </li><li> Posizionare la piastra ben 96 nella stazione di imaging e clicca su &quot;Acquisire&quot; per avviare l&#39;imaging. Dopo che l&#39;immagine viene acquisita, fare clic su &quot;Strumenti ROI&quot; nella palette degli strumenti e selezionare 12 x 8 dall&#39;icona fessura. </li><li> Crea 12 x 8 fessure per coprire l&#39;area del segnale sul immagine della piastra da 96 pozzetti e fare clic sulla scheda misure. Osservare una finestra con una tabella di misurazioni ROI con le unità di fotoni per s per steradiante per centimetro quadrato (fotoni / s / sr / cm 2). </li></ol></li><li> Costruire una dispersione con l&#39;argomento (asse X) pari al numero di cellule e la funzione (asse Y) che rappresenta l&#39;intensità di segnale. Calcolare curve di regressione utilizzando un software di analisi dati per calcolare la quantità di cellule corrispondenti all&#39;unità di intensità fluorescente (Figura 2) 10. </li></ol> 4. modello animale di metastasi epatiche <ol><li> Una volta che le cellule HCT116-L2T raggiungono 70- 80% di confluenza, a prepararsi circa 1 h prima dell&#39;iniezione milza. Dissociare le cellule utilizzando 0,05% tripsina in 0,53 mM EDTA da 3 - 5 minuti, e poi neutralizzare con una quantità uguale di cDMEM. Assicurati di pipetta a fondo per evitare grumi. </li><li> Contare le cellule con un contatore di cellule automatica. </li><li> Risospendere le cellule in 1x DPBS ad una concentrazione di 1,2 - 2 x 10 6 cellule / 100 microlitri. Assicurati di pipetta e risospendere accuratamente le cellule per evitare grumi. </li><li> Mantenere le cellule in ghiaccio fino ad iniezione, talvolta li risospendere nel tubo. </li><li> Prima di anestetizzare i topi, fornire un anestetico preoperatoria e bolo fluido per via sottocutanea iniettando 500 ml di miscela buprenorfina descritto al punto 1.3. Somministrare la stessa dose di miscela buprenorfina aggiuntivo due volte al giorno fino a quando i segni di dolore (mobilità ridotta, statura curvo, il mancato sposo, la vocalizzazione quando gestito) hanno risolto. </li><li> Anestetizzare da 6 a 8 settimane-vecchio femmina topi nudi atimici con 2% isoflurano in ossigeno in una camera di anestesia. Verificare che i topi sono completamente sotto anestesia da pizzicare la coda. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Trasferire ogni topo anestetizzato a un musetto individuale per l&#39;iniezione milza. Prima di incisione ogni mouse dovrebbe essere coperto con un telo chirurgico sterile. </li><li> Identificare la milza come area viola visto dall&#39;esterno attraverso la pelle sul fianco sinistro dei topi nudi. Utilizzando le forbici microdissezione, fare un otto millimetri fianco sinistro incisione sulla pelle appena sopra la milza. <ol><li> Successivamente, sollevare la parete addominale e fare una piccola incisione. Consentire l&#39;aria nella cavità addominale in modo che gli organi interni si allontanano dal sito di incisione. Ingrandire l&#39;incisione della parete addominale di circa 5 mm. </li><li> Esporre la milza applicando delicatamente pressione intorno l&#39;incisione con un batuffolo di cotone. Se necessario, il grasso del pancreas può essere delicatamente uomoipulated per aiutare con esposizione in modo da non danneggiare la milza. </li></ol></li><li> Iniettare lentamente 100 ml di cellule utilizzando una siringa da 1 ml con un ago G 27 nella punta della milza esposto. Iniettare lentamente, nell&#39;arco di un periodo di almeno 30 - 60 s, per evitare tumori extra-epatiche. </li><li> Inserire un microclip sulla milza prima di rimuovere l&#39;ago al termine dell&#39;iniezione per evitare fuoriuscite di sospensione cellulare iniettato. </li><li> Lasciare il microclip sul posto per 5 min. </li><li> 5 min dall&#39;iniezione, eseguire una splenectomia utilizzando un dispositivo di cauterizzazione portatile per emostasi. Sezionare il ilo della milza, a partire dal lato anteriore. Quando dissezione navi di grandi dimensioni, pre-coagulare il lato prossimale dei vasi con tessuto adiposo adiacente, utilizzando cauterizzazione per evitare un eccessivo sanguinamento. NOTA: I metodi per emostasi: coagulano il punto di sanguinamento direttamente con cauterizzazione, applicare una pressione al punto di sanguinamento per 3-5 minuti, o di sutura-legare il punto sanguinante con una cravatta di seta 5-0. </li&gt; <li> Chiudere l&#39;incisione fianco di ogni topo in due strati. Innanzitutto, chiudere la parete addominale con una sutura 5-0 assorbibile intrecciata (es, Vicryl) in un punto singolo orizzontale. Successivamente, chiudere la pelle con un 4-0 non assorbibile sutura monofilamento (ad esempio, prolene), ancora con una sola cucitura orizzontale. </li><li> Pulire tutti gli strumenti a spruzzo 70% di isopropanolo per mantenere condizioni di sterilità tra ogni procedura. NOTA: Assicurarsi che gli animali sono riscaldati mentre si svegliano dall&#39;anestesia. Monitorare tutti i mouse dopo l&#39;intervento fino a quando diventano ambulatoriale e tornare alla normale attività. Tipicamente, il tempo di recupero è circa 3 - 5 min. Non lasciare gli animali incustoditi fino a che non hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato. </li></ol> 5. In Vivo Bioluminescent Imaging <ol><li> Eseguire l&#39;imaging suuna volta alla settimana per misurare e quantificare i cambiamenti in bioluminescenza nel corso del tempo. </li><li> Inserire topi in una camera di anestesia e anestetizzare con 2% isoflurano in ossigeno. Verificare che i topi sono completamente sotto anestesia da pizzicare le code. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Successivamente, per via intraperitoneale iniettare ogni mouse con 150 ml di preprepared lucciola luciferina dal punto 1.4. </li><li> Posizionare il mouse in un IVIS con i singoli coni naso somministrazione di isoflurano. Posizionare il mouse in posizione supina con distanziali intermedi per minimizzare il segnale di topi adiacenti. Un massimo di cinque topi può essere ripreso in una sola volta. </li><li> Misurare e analizzare intensità bioluminescenti 3 minuti dopo l&#39;iniezione luciferina. <ol><li> Dopo l&#39;inizializzazione del IVIS come descritto al punto 3.2.1, selezionare &quot;luminescenti&quot;, &quot;1 secondo&quot; tempo di esposizione, e binning &quot;Medium&quot;. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Ripresa&quot; per avviare Imaging. Assicurarsi di eseguire ogni immagini alla volta coerente (3 min) dopo l&#39;iniezione luciferina. </li><li> Dopo che l&#39;immagine viene acquisita, apparirà una finestra di immagine e tavolozza degli strumenti. Fai clic su &quot;Strumenti ROI&quot; e selezionare &quot;1&quot;, &quot;2&quot;, &quot;3&quot;, &quot;4&quot;, o &quot;5&quot; dall&#39;icona cerchio, corrispondente al numero di topi creata l&#39;immagine. </li><li> Per definire regioni di interesse (ROI), il giro l&#39;area del segnale luminescente nella cavità addominale del mouse del segnale, e quindi fare clic su &quot;misure&quot; del ROI come unità arbitraria di efficienza radiante ((fotoni / s / cm 2 / steradiante) / (W / cm 2)). Assicurarsi di avere un cerchio ROI ulteriore dello sfondo. </li></ol></li><li> A quattro settimane dopo l&#39;iniezione e prima del sacrificio animale, eseguire Diffuse luminescenti Imaging Tomografia (DLIT) utilizzando IVIS per valutare il carico tumorale e la diffusione tramite ricostruzione 3D in tempo reale di intensità bioluminescenti di colonie tumorali singole. <ol&gt; <li> Anestetizzare i topi e iniettare luciferina, come descritto al punto 5.2.4. DLIT viene eseguita su un mouse alla volta. </li><li> Dopo l&#39;inizializzazione del IVIS, come descritto al punto 3.2.1, selezionare &quot;Wizard Imaging&quot;, &quot;bioluminescenza&quot; e fare clic su &quot;Avanti&quot;. Selezionare &quot;DLIT&quot; e fare clic su &quot;Avanti&quot;. Selezionare sonde &quot;Firefly&quot; e fare clic su &quot;Avanti&quot;. Selezionare &quot;mouse&quot; immagine del soggetto, l&#39;esposizione parametro &quot;Auto&quot;, campo &quot;C-13 cm&quot; di vista, e &quot;0.5 cm&quot; altezza soggetto, e fare clic su &quot;Avanti&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Ripresa&quot; per avviare l&#39;imaging. </li><li> Dopo che l&#39;immagine viene acquisita, selezionare la scheda &quot;DLIT 3D Reconstruction&quot; e la &quot;Analizza&quot; scheda e fare clic su &quot;Ricostruire&quot; per generare l&#39;immagine ricostruzione 3D. </li><li> Fai clic su &quot;Strumenti&quot; e &quot;Animazione 3D&quot;. Selezionare &quot;Spin CCW su Y&quot; nella finestra di animazione 3D. Fai clic su &quot;Record&quot; e &quot;Salva&quot; in un file in formato .mov. </li></ol></li></ol> Imaging 6. Ex Vivo fluorescente <ol><li> Sacrificare i topi da dislocazione cervicale mentre anestetizzato, o secondo le linee guida istituzionali a 4 - 6 settimane dopo le iniezioni milza. </li><li> Raccolto il fegato. Effettuare una incisione orizzontale da sinistra a fianco destro. Afferrando il processo xifoideo con un pick-up, sezionare il falciforme, la vena epatica, e la vena cava inferiore. <ol><li> Sezionare il legamento destra epato-renale, il legamento epatoduodenale, e il legamento epato-renale sinistra, facendo attenzione a non danneggiare il lobo caudato mentre sezionare il legamento epatoduodenale. Dopo la raccolta il fegato, rimuovere la colecisti, in quanto questo verrà visualizzato autofluorescenza. Prendere nota di eventuali tumori ulteriori extra-epatiche presenti. </li></ol></li><li> Prendere nota dei numeri e le dimensioni dei tumori al fegato presente macroscopicamente, e posizionare i fegati raccolte in DPBS. NOTA: I tumori sono macroscopicamente visibili ad occhio nudocome tumori bianche (per un esempio rappresentativo, vedere la Figura 4). </li><li> Prima di posizionamento sul foglio di imaging, prendere ogni fegato e rimuovere delicatamente il liquido in eccesso tamponando su un tovagliolo di carta. </li><li> Misurare le intensità fluorescenti da ogni colonia tumore utilizzando il IVIS. <ol><li> Selezionare &quot;fluorescenza&quot;, &quot;4 secondi&quot; il tempo di esposizione, binning &quot;Medium&quot;, &quot;2&quot; F / stop, &quot;535&quot; filtro di eccitazione, e filtro per le emissioni &quot;580&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Ripresa&quot; per avviare l&#39;imaging. </li><li> Dopo aver acquisito l&#39;immagine, individuare la finestra dell&#39;immagine e tavolozza degli strumenti. Fai clic su &quot;Strumenti ROI&quot; e selezionare &quot;1&quot; dall&#39;icona cerchio. Per definire ROI, cerchio l&#39;area di singole colonie tumorali sull&#39;immagine del segnale, e quindi fare clic su &quot;misure&quot; del ROI come unità arbitraria di efficienza radiante ((fotoni / s / cm 2 / steradiante) / (W / cm 2) ). Assicurarsi di avere un cerchio ROI ulteriore dello sfondo. </li></ol&gt; </li><li> Calcolare il volume totale del tumore ipotizzando che sia una sfera. Volume del tumore = 4 x π XR 3/3 (r = raggio). Calcolare la frazione di cellule formanti colonie tumorali (Fc) come il numero di tumori nel fegato diviso per il numero di cellule splenically iniettato. </li><li> Calcolare il numero totale di cellule per colonia (= X) dal approssimazione lineare dal punto 3.3. Calcolare il numero di divisioni cellulari (= Y) come Y = log 2 X e la Td come Td (giorno) = 28 / Y. </li></ol>

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<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Khodarev, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1+pathway+mediates+amplification+of+metastatic+potential+and+resistance+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy.</a> PLoS One. 4 (6), e5821(2009).</li>
<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-organ+microenvironment+interactions+in+the+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis.</a> Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-+and+polymetastatic+progression+in+lung+metastasis%28es%29+patients+is+associated+with+specific+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs.</a> PLoS One. 7 (12), e50141(2012).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+characterizes+oligometastasis%28es%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es).</a> PLoS One. 6 (12), e28650(2011).</li>
<li>Calon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+colorectal+cancer+on+a+TGF-beta-driven+program+in+stromal+cells+for+metastasis+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation.</a> Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).</li>
<li>Vanharanta, S., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+metastatic+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of metastatic traits.</a> Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).</li>
<li>Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways%3A+Interferon%2FStat1+Pathway%3A+Role+in+the+tumor+resistance+to+genotoxic+stress+and+aggressive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth.</a> Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-stimulated+gene+15+%28ISG15%29+is+a+trigger+for+tumorigenesis+and+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).</li>
<li>Evans, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mice+to+men%3A+Murine+models+of+colorectal+cancer+for+use+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il modello animale presentato nella presente relazione si basa su due approcci principali. In primo luogo, al fine di assicurare la capacità di osservare cloni metastatici con differenti inclinazioni di colonizzare e proliferare nel fegato, un pannello di linee cellulari monoclonali altamente eterogenei è stato istituito, piuttosto che una consolidata linea cellulare di tumore non frazionata 12,13. L&#39;approccio monoclonale per lo sviluppo di metastasi è giustificato dai recenti dati genomici 14 ...

I pazienti con metastasi epatiche da tumori colorettali primari (CRC) sono caratterizzate da una prognosi infausta. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni per i primari non metastatici CRC (fasi I - III) è stimato in 75-88% 3,4, mentre i pazienti con metastasi epatiche (stadio IV) hanno un tasso di sopravvivenza a 5 anni di solo l&#39;8 - 12% 5 , 6. Tuttavia, i pazienti metastatici rappresentano un gruppo eterogeneo, che presenta con diverso numero di metastasi e diversi tempi di ricorrenza. Osservazioni cliniche indicano che il numero di metastasi (che può essere proporzionale alla capacità colonizzazione o la frequenza di colonizzazione) e la dimensione di ogni singola metastasi (proporzionale al tasso di crescita locale) sono fattori prognostici indipendenti 1,7. In altre parole, il successo di cloni metastatici che colonizzano il fegato dipende da due importanti caratteristiche: la loro capacità di crescere e la loro capacità di diffondere e sopravvivere nel microambiente del fegato. Il designmodelli di successo clinici con la capacità di catturare e quantificare le proprietà di cloni metastatiche può migliorare drasticamente la nostra comprensione di fegato metastasi biologia e fornire uno strumento efficace per la progettazione di potenziali approcci terapeutici. Tutti i modelli di metastasi epatiche sperimentale sono stati precedentemente segnalati 8,9, ma nessuno dei due fornito la capacità di catturare e descrivere le caratteristiche dei singoli cloni metastatici sia in vivo e ex vivo quantitativamente. Qui, vi presentiamo un nuovo, modello avanzato di metastasi epatiche che include la generazione di cloni tumorali con diverse efficienze di colonizzazione del fegato e proprietà di crescita. Abbiamo utilizzato una combinazione di dual-etichettatura delle cellule tumorali con luciferasi e proteina fluorescente tdTomato con la generazione di linee cellulari monoclonali che hanno differenze intrinseche nella capacità metastatica. In questo modello sperimentale, i dati indicano che lo sviluppo dimetastasi epatiche possono essere descritti in termini di frequenza di colonizzazione e tempo di raddoppio (Td), che è coerente con osservazioni cliniche. La natura quantitativa di questo modello lo rende facilmente adottabile per la scoperta di nuovi farmaci e la diagnostica.

<table><tbody><tr><td>Sistema di imaging IVIS Spectrum In Vivo</td><td>Calibro per > Life Sciences</td><td>124262</td><td>In Vivo</em</td></tr><tr><td>Software LivingImage 4.0</td><td>Software</td> per 128165 <td>Life Sciences Software per</td><td>l'imaging</td></tr><tr><td>VAD-MGX Macchina per anestesia di ricerca</td><td>Vetamac</td><td>VAD-MGX</td><td>Macchina per anestesia per inalazione</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>Reagenti per colture cellulari</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco 14190250</td><td></td><td>Reagenti per colture cellulari</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina, liquido (10.000 unità penicillina; 10.000 &mu; g streptomicina)</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>Reagenti per colture cellulari</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>24020117</td><td>Reagenti per colture cellulari</td></tr><tr><td>Buprenex Injection (0.3 mg/mL)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>Buprenorfina cloridrato</td></tr><tr><td>Gemini Cautery System</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Cauterio portatile per splenectomia</td></tr><tr><td>Micro Clip; Diritto; 70 grammi di pressione; Larghezza clip 1,5 mm; 10 mm di lunghezza della ganascia</td><td>Roboz Strumento chirurgico</td><td>RS-5426</td><td>Hemoclip: Strumenti per emostasi dopo l'iniezione di milza</td></tr><tr><td>D-luciferina, sale di potassio</td><td>Tecnologia Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td>Luciferin sale di potassio</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero ridotto</td><td>Medium Gibco</td><td>31985062</td><td>Siero ridotto</td></tr><tr><td>Medium TC20 Contatore cellulare automatizzato</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td>Contatore automatico di cellule</td></tr><tr><td>Software JMP10</td>Software di <td>analisi dati</td> <td>SAS Institute</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II selezionatore cellulare</td><td>BD Biocsiences</td><td></td><td>Selezionatore cellulare</td></tr></tbody></table>

avanzato modello animale di colorettale metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

I pazienti con un numero limitato di metastasi epatiche e dei tassi di lenti di progressione possono essere trattati con successo con trattamento locale approcci 1,2. Tuttavia, poco si sa circa l&#39;eterogeneità delle metastasi epatiche, e sono necessari modelli animali in grado di valutare lo sviluppo delle singole colonie metastatiche. Qui, vi presentiamo un modello avanzato di metastasi epatiche che offre la possibilità di visualizzare quantitativamente lo sviluppo dei singoli cloni tumorali nel fegato e stimare la cinetica di crescita e l&#39;efficienza colonizzazione. Abbiamo generato un gruppo di derivati ​​monoclonali di cellule tumorali del colon-retto umano HCT116 stabile etichettati con luciferasi e tdTomato e che presentano caratteristiche diverse di crescita. Con un&#39;iniezione splenica seguita da una splenectomia, la maggioranza di questi cloni sono in grado di generare metastasi epatiche, ma con differenti frequenze di colonizzazione e tassi di crescita variabili. Utilizzando il Syste imaging in vivom (IVIS), è possibile visualizzare e quantificare lo sviluppo di metastasi con luminescenti in vivo ed ex vivo di imaging fluorescente. Inoltre, Diffuse Luminescent Imaging Tomografia (DLIT) fornisce una distribuzione 3D di metastasi epatiche in vivo. Ex vivo l&#39;imaging fluorescente fegati raccolte fornisce misurazioni quantitative delle singole colonie metastatiche epatiche, consentendo la valutazione della frequenza di colonizzazione fegato e la cinetica di crescita di metastasi. Dal momento che il modello è simile a metastasi epatiche clinicamente osservati, può servire come una modalità per la rilevazione di geni associati con metastasi epatiche e per testare potenziali trattamenti ablativi o coadiuvanti per la malattia metastatica epatica.

L&#39;obiettivo di questo esperimento era di stabilire un modello animale coerente e facilmente riproducibile con il potenziale per la quantificazione di serie del carico tumorale metastatica in vivo e per la stima della frequenza di colonizzazione e cinetica di crescita di sviluppare metastasi epatiche. Figure 2-6, con le leggende, sono forniti dalla nostra precedente pubblicazione sotto una licenza creative Commons CC-BY 10. <p class="jove_step"...

La capacità dei cloni metastatici di colonizzare siti distanti dipende dalla loro capacità di proliferazione e/o dalla loro capacità di sopravvivere nel microambiente ospite senza una proliferazione significativa. Qui, presentiamo un modello animale che consente la visualizzazione quantitativa di entrambi i tipi di colonizzazione del fegato da parte di cloni metastatici.

Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

L'obiettivo generale di questo approccio è modellare la colonizzazione del fegato da parte di cloni tumorali metastatici generati da tumori del colon-retto, e utilizzare questo modello per migliorare la diagnosi e la terapia delle metastasi epatiche. Le osservazioni cliniche indicano l'eterogeneità della malattia metastatica. Il nostro modello consente di catturare questa eterogeneità al fine di identificare geni associati a malattia oligometastatica e polimetastatica.E utilizzare questa conoscenza per migliorare la diagnosi precoce e il trattamento delle metastasi. Il principale vantaggio della nostra tecnica è che utilizziamo linee cellulari monoclonali doppio-etichettate derivate da pazienti con cancro del colon-retto, permettendo di osservare lo sviluppo di metastasi epatiche sia in vivo che ex vivo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una terapia delle malattie metastatiche.Ci consente di testare qualsiasi farmaco potenziale con una stima quantitativa del numero di lesioni metastatiche e della cinetica di crescita di ciascuna lesione. Dopo aver generato cellule HCT116 marcate con luciferasi e tdTomato e aver preparato il mezzo, i reagenti e gli strumenti, seco

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Due tecniche possono essere usate per stabilire questo modello: l'iniezione di una sospensione di cellule tumorali nella parete del cieco o il trapianto di un pezzo di tumore sottocutaneo sul cieco. Questo modello è utile per studiare la naturale progressione del tumore del colon-retto e test nuovi agenti terapeutici contro il cancro del colon-retto.

Topo Modello ortotopico di cancro colorettale

Questo articolo descrive una procedura per l'induzione di tumori al fegato ortotopico bioluminescenti nei topi, e la successiva analisi di crescita del tumore confinato al fegato utilizzando vivere tutto l'imaging luminescenza corpo.

Bioluminescent modello murino epatica Tumori

I modelli animali sono spesso utilizzati per studiare metastasi alle ossa. In questo protocollo si descrivono due metodi comuni di inoculo del tumore per gli studi di metastasi ossee e descrivere brevemente alcune delle analisi utilizzati per monitorare e quantificare questi modelli.

Modelli di metastasi ossee

Questo video descrive il protocollo per stabilire un modello murino di metastasi spontanee di xenotrapianti derivati da pazienti con cancro del colon-retto o PDX. Questi modelli di xenotrapianto imitano parzialmente le caratteristiche dei carcinomi umani e comprendono gli aspetti critici delle neoplasie maligne umane, tra cui l'invasione e le metastasi.

Modelli murini di metastasi spontanee: una piattaforma per studiare il potenziale metastatico delle cellule di cancro colorettale iniettate ortotopicamente

Un preclinico, modello murino di metastasi epatiche effettuato tramite una tecnica di iniezione hemispleen.

Un preclinici Modello murino di metastasi epatiche

È stata sviluppata una procedura chirurgica per fornire cellule tumorali mammarie al fegato murino tramite iniezione nella vena porta. Questo modello consente di studiare le fasi avanzate delle metastasi epatiche in un ospite completamente immune competente, tra cui lo stravaso delle cellule tumorali, la semina, la sopravvivenza e la crescita metastatica nel fegato.

Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

Descriviamo la creazione di tumori colorettali ortotopici attraverso l'iniezione di cellule tumorali o organoidi nel cecum dei topi e il successivo isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da questo modello.

Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

Questo protocollo descrive la generazione di modelli di xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente infondendo inmodo vesicalmente cellule carcinoma a cellule urotemaliali o cellule di cancro colorettale intra-rettale in diabete/grave non obesi immunodeficienza (NOD/SCID) per la crescita primaria del tumore e metastasi spontanee sotto l'influenza delle cellule stromali del linfonodo, che imitano la progressione delle malattie metastatiche umane.

Modelli di Xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente per carcinoma a cellule uroteliali umane e crescita del tumore del tumore colorettale e metastasi spontanea

Descriviamo in dettaglio un modello tumorale del cancro colorettale clinicamente rilevante (CRLM) e l'influenza della reperfusione di ischemia epatica (I/R) nella crescita tumorale e nella metastasi. Questo modello può aiutare a comprendere meglio i meccanismi alla base della promozione metastatica del fegato indotta da un intervento chirurgico.

Modello Murine dei tumori metastatici del fegato nell'impostazione della lesione alla riperfusione dell'ischemia

L'approccio descritto combina saggi sperimentali di metastasi della vena della coda con immagini animali vive in vivo per consentire il monitoraggio in tempo reale della formazione e della crescita della metastasi del cancro al seno, oltre alla quantificazione del numero e delle dimensioni delle metastasi nei polmoni.

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

L'iniezione della vena porta di organoidi del cancro del colon-retto (CRC) genera metastasi epatiche ricche di stroma. Questo modello murino di metastasi epatiche CRC rappresenta uno strumento utile per studiare le interazioni tumore-stroma e sviluppare nuove terapie dirette dallo stroma come le terapie geniche mediate da virus adeno-associate.

Iniezione di vena porta di organoidi del cancro del colon-retto per studiare le metastasi epatiche Stroma

Scopri un modello animale avanzato per studiare la colonizzazione epatica da cloni tumorali metastatici del cancro colorettale. Questa tecnica consente la visualizzazione quantitativa in vivo ed ex vivo per migliorare diagnostica e terapia.

Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni

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