Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni

L'obiettivo generale di questo approccio è modellare la colonizzazione del fegato da parte di cloni tumorali metastatici generati da tumori del colon-retto, e utilizzare questo modello per migliorare la diagnosi e la terapia delle metastasi epatiche. Le osservazioni cliniche indicano l'eterogeneità della malattia metastatica. Il nostro modello consente di catturare questa eterogeneità al fine di identificare geni associati a malattia oligometastatica e polimetastatica.

E utilizzare questa conoscenza per migliorare la diagnosi precoce e il trattamento delle metastasi. Il principale vantaggio della nostra tecnica è che utilizziamo linee cellulari monoclonali doppio-etichettate derivate da pazienti con cancro del colon-retto, permettendo di osservare lo sviluppo di metastasi epatiche sia in vivo che ex vivo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una terapia delle malattie metastatiche.

Ci consente di testare qualsiasi farmaco potenziale con una stima quantitativa del numero di lesioni metastatiche e della cinetica di crescita di ciascuna lesione. Dopo aver generato cellule HCT116 marcate con luciferasi e tdTomato e aver preparato il mezzo, i reagenti e gli strumenti, secondo il protocollo descritto, piastrare le cellule trasfettate alle seguenti densità per pozzetto, in triplice replicato, in piastre a 96 pozzetti. Dopo un'incubazione delle cellule di cinque ore, quantificare le intensità fluorescenti di tdTomato utilizzando un sistema IVIS, avviando il software di acquisizione immagini sul desktop.

Fare clic sul pulsante Inizializza per impostare il tempo di acquisizione, la binning del mezzo, due per il diaframma, 535 per il filtro di eccitazione e 580 per il filtro di emissione. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sulla stazione di acquisizione e fare clic su Acquisisci per iniziare l'acquisizione delle immagini. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, nella barra degli strumenti, fare clic su Strumenti di area di interesse (ROI) e selezionare 12x8 dall'icona della fessura.

Crea 12x8 fessure per coprire l'area del segnale nell'immagine della piastra a 96 pozzetti e fai clic sulla scheda Misure. Osserva una finestra con la tabella delle misurazioni delle aree di interesse (ROI) con unità di fotoni al secondo, per steradiante, per centimetro quadrato. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 70-80 percento, circa un'ora prima dell'iniezione nel milza, aggiungi tripsina allo 0,05 percento ed EDTA 0,53 millimolare alle cellule per dissocciarle.

Dopo aver incubato le cellule per tre-cinque minuti, utilizzare un volume equivalente di C-DMEM per neutralizzare la tripsina. Pipettare accuratamente le colture per evitare aggregazioni, quindi contare le cellule mediante un contatore cellulare automatico. Congelare le cellule in sospensione in 1x DBPS a una concentrazione di 1,2-2 x 10⁶ cellule per 100 microlitri, pipettando accuratamente per evitare aggregazioni.

Quindi, mantenere le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione, risospendendole occasionalmente nel tubo. Dopo aver somministrato analgesici e anestetizzato un topo nudo atimico femmina di sei-otto settimane secondo il protocollo descritto nel testo, identificare la milza come un'area violacea visibile esternamente attraverso la cute nel fianco sinistro e praticare un'incisione di otto millimetri nel fianco sinistro sulla cute appena sopra l'organo. Successivamente, sollevare la parete addominale ed effettuare una piccola incisione.

Lasciare entrare aria nella cavità addominale in modo che gli organi interni si allontanino dal sito dell'incisione. Successivamente, allargare l'incisione della parete addominale a circa cinque millimetri. I passaggi dimostrati per l'iniezione sono fondamentali per la procedura.

La fuoriuscita di cellule tumorali durante l'iniezione può portare a metastasi extraepatiche. L'iniezione deve essere eseguita lentamente, nell'arco di 30-60 secondi, con non più di 1,5 milioni di cellule per prevenire la trombosi venosa portale. Esporre la milza applicando delicatamente pressione intorno all'incisione con un bastoncino di cotone.

Se necessario, il grasso pancreatico può essere manipolato delicatamente per favorire l'esposizione, evitando di danneggiare la milza. Utilizzando una siringa da un millilitro con ago da 27 gauge, in un periodo di 30-60 secondi, iniettare 100 microlitri di cellule nella punta della milza esposta. Al termine dell'iniezione, posizionare un micro-clip sulla milza prima di rimuovere l'ago, per prevenire la fuoriuscita della sospensione cellulare iniettata, e lasciarlo in sede per cinque minuti.

Cinque minuti dopo l'iniezione, utilizzare un dispositivo diatermico manuale per eseguire una splenectomia a scopo emostatico. Iniziare dal ilo splenico sulla faccia anteriore, pre-coagulando il lato prossimale dei vasi insieme al tessuto adiposo adiacente. Possono verificarsi sanguinamenti splenici nel sito di iniezione.

Il microclip viene applicato sulla milza per prevenire la fuoriuscita di cellule tumorali e per controllare l'emorragia splenica. I metodi di emostasi possono includere la cauterizzazione, l'applicazione di pressione per tre-cinque minuti e la legatura con sutura, se necessario. Chiudere la parete addominale utilizzando un punto singolo orizzontale e una sutura intrecciata assorbibile 5.0.

Quindi, utilizzare un filo di sutura mono-filamento non assorbibile di calibro 4.0 per chiudere la cute, anch'esso con un singolo punto orizzontale. Monitorare l'animale nel periodo postoperatorio, secondo il protocollo indicato nel testo. Per eseguire l'imaging bioluminescente, dopo aver anestetizzato i topi secondo il protocollo indicato nel testo, iniettare intraperitonealmente negli animali 150 microlitri di luciferina della lucciola precedentemente preparata.

Posizionare i topi in posizione supina all'interno di un IVIS, inserendo distanziali tra un animale e l'altro per ridurre al minimo il segnale proveniente dai topi adiacenti. Tre minuti dopo l'iniezione di luciferina, dopo aver inizializzato l'IVIS, selezionare la modalità di luminescenza, un tempo di esposizione di un secondo e un binning medio. Fare clic sul pulsante Acquisisci per iniziare l'acquisizione, assicurandosi che l'acquisizione venga eseguita sempre tre minuti dopo l'iniezione di luciferina.

Dopo l'acquisizione dell'immagine, quando appare una finestra dell'immagine e una tavolozza degli strumenti, fare clic su strumenti ROI e selezionare un numero da uno a cinque dall'icona circolare corrispondente al numero di topi acquisiti. Per definire le ROI, tracciare un cerchio intorno all'area del segnale del segnale luminiscente nella cavità addominale del topo, quindi fare clic sulle misurazioni della ROI come unità arbitraria di radianza. Includere un ulteriore cerchio ROI per lo sfondo.

Quattro settimane dopo l'iniezione, per eseguire la tomografia di imaging luminiscente diffusa, o DLIT, dopo aver inizializzato l'IVIS, selezionare la Procedura guidata di imaging, Bioluminescenza e fare clic su Avanti. Selezionare DLIT e fare clic su Avanti. Selezionare Firefly Probes e fare clic su Avanti.

Selezionare Mouse come soggetto dell'immagine, Auto per i parametri di esposizione, C-13 Centimetro per il campo visivo e 0,5 Centimetro come tipo di soggetto, quindi fare clic su Avanti. Successivamente, fare clic sul pulsante Acquisisci per iniziare l'acquisizione dell'immagine. Dopo aver acquisito un'immagine, selezionare la scheda Ricostruzione 3D DLIT, nella scheda Analizza, e fare clic su Ricostruisci per generare l'immagine ricostruita in 3D.

Fare clic su Strumenti e Animazione 3D. Quindi, nella finestra Animazione 3D, selezionare Rotazione antioraria sull'asse Y. Fare clic su Registra e Salva per salvare il file in un file in formato mov.

Per eseguire l'imaging fluorescente ex vivo, dopo aver prelevato e dissezionato i fegati da topi secondo il protocollo descritto nel testo, misurare le intensità fluorescenti di ciascuna colonia tumorale utilizzando l'IVIS. Selezionare Fluorescenza, un tempo di esposizione di quattro secondi, binning medio, 2 per l'apertura del diaframma (F/Stop), 535 per il filtro di eccitazione e 580 per il filtro di emissione. Cliccare sul pulsante Acquire per avviare l'imaging.

Dopo aver acquisito l'immagine, individuare la finestra Image nella Tool Palette. Fare clic su ROI Tools e selezionare 1 dall'icona del cerchio. Per definire le ROI, tracciare un cerchio intorno all'area del segnale delle singole colonie tumorali nell'immagine.

Acquisire un ulteriore cerchio ROI dello sfondo, quindi fare clic su Misure dell'ROI come unità arbitraria di radianza. Acquisire un ulteriore cerchio ROI dello sfondo. Infine, eseguire i calcoli secondo il protocollo descritto nel testo.

Come mostrato qui mediante bioluminescenza, tre settimane dopo l'iniezione splenica, i cloni HCT116 L2T P1 e P2 presentavano un carico tumorale maggiore rispetto ai cloni O1 e O2. Questi dati indicavano che i cloni O1 e O2 possono mimare una malattia oligometastatica, mentre P1 e P2 rappresentano una colonizzazione metastatica epatica aggressiva e diffusa. La quantificazione della fluorescenza ex vivo del fegato, a quattro settimane dall'iniezione splenica, ha confermato che i fegati dei cloni P1 e P2 presentavano intensità fluorescenti più elevate rispetto a quelli dei cloni O1 e O2. L'etichettatura fluorescente dei cloni tumorali ha permesso di identificare il numero e le dimensioni delle singole colonie metastatiche nel fegato.

Nel complesso, le immagini fluorescenti ex vivo erano coerenti con i risultati macroscopici, ma le piccole colonie nascoste sotto la superficie sono state meglio rilevate mediante imaging fluorescente. Come illustrato qui, il numero e le dimensioni delle colonie metastatiche sono stati contati e misurati in ciascun fegato, ed è stato effettuato un imaging fluorescente ex vivo su ciascuna colonia metastatica per ogni monoclonale. Come mostrato in questi grafici, il numero totale di metastasi in P1 era maggiore rispetto a P2, O1 e O2, mentre la dimensione media delle singole colonie era maggiore in P2 rispetto a P1, O1 e O2. Il nostro modello fornisce un approccio per identificare nuovi geni di persuasione associati all'eterogeneità molecolare della metastasi.

Questi geni possono essere utilizzati come bersagli per nuovi approcci al trattamento delle metastasi. Il nostro modello può essere utilizzato anche per la validazione di diversi geni codificanti e non codificanti che emergono dai grandi database clinici attuali, ma che non sono ancora definiti funzionalmente nel contesto delle malattie metastatiche. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo incontreranno difficoltà a causa della delicatezza dell'intervento chirurgico sugli animali.

Tuttavia, con la pratica, è possibile ottenere buoni risultati in un breve lasso di tempo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di seguire le linee guida per la chirurgia animale, controllare attentamente l'emorragia e prevenire la fuoriuscita della sospensione di cellule tumorali.