Microglia come un biosensore surrogato per determinare nanoparticelle neurotossicità

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere un biosensore surrogato in vitro per testare la risposta microgliale alle nanoparticelle. Determineremo quindi la neurotossicità a seguito dell'esposizione a terreni condizionati da microglia stimolata con nanoparticelle. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come vengono sottoposte a screening attivo le nanoparticelle per la neurotossicità.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che il nostro modello fornisce la capacità di attivare direttamente la microglia e determinare se i fattori secretivi sono neurotossine senza l'uso di costosi studi sui roditori a lungo termine. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla morte cellulare indotta dalla microglia in seguito all'esposizione a microparticelle. Può anche essere applicato ad altri modelli di malattie neurodegenerative nel contesto della sperimentazione di potenziali inquinanti ambientali neurotossici.

Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con la fase di filtrazione dei mezzi di condizionamento. Perché l'efficienza di filtrazione può variare a seconda delle dimensioni, della forma e della concentrazione delle nanoparticelle. In preparazione, scaldare il DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di PSN a 37 gradi Celsius.

Quindi prendere le cellule microgliali BV2 congelate ottenute dai passaggi 18 25 e scongelarle rapidamente a 37 gradi Celsius. Successivamente, trasferire delicatamente le cellule scongelate in un pallone ventilato di 75 centimetri quadrati contenente 10 millilitri di terreno e incubare il pallone. Dopo 24 ore sostituire il terreno e continuare a far crescere le cellule fino a raggiungere una confluenza del 70-80%A questo punto aspirare il terreno e aggiungere 500 microlitri di soluzione tiepida 1 ex tripsina EDTA.

Dopo aver lasciato incubare il pallone per qualche altro minuto, utilizzare un raschietto per raccogliere le cellule in 5 millilitri di DMEM caldo. Quindi filtrare le cellule dal pallone utilizzando un colino da 70 micron. Ripetere questa filtrazione tre volte utilizzando lo stesso filtro e raccogliere le cellule in una provetta da 50 millilitri.

Una volta filtrate, contare le cellule e quindi seminare una piastra di fondo trasparente a parete nera con 8000 cellule per pozzetto in 200 microlitri di DMEM integrato. Dopo 24 ore di incubazione, sostituire il terreno nei pozzetti con DMEM privo di siero per affamare la microglia. Dopo altre 24 ore di incubazione, procedere all'attivazione della microglia.

Per fare ciò, diluire prima le nanoparticelle d'argento in DMEM privo di siero alla concentrazione di lavoro desiderata. Quindi sostituire 100 microlitri di terreno con il composto di trattamento. Assicurati di includere un controllo negativo della soluzione del veicolo diluita senza le nanoparticelle.

Ora continuate l'incubazione per 24 ore e procedete con l'analisi. Per iniziare, raccogli 200 microlitri di terreno surnatante da ogni piastra e caricalo su un filtro che rimuoverà le nanoparticelle poste su una provetta da microcentrifuga. È importante ricordare che quando si filtrano le nanoparticelle, le loro dimensioni, forma e concentrazione sono un fattore per l'efficienza della fusione.

Quindi è consigliabile testare preventivamente la filtrazione. Ora gira i tubi a 14000 g a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi scartare il flusso che contiene le nanoparticelle e posizionare i filtri capovolti in nuove provette di raccolta.

Girare i filtri a testa in giù a 1000 g per due minuti per raccogliere il terreno condizionato concentrato contenente citochine. Successivamente, aumentare il volume della raccolta a 400 microlitri con DMEM supplementare appena fatto e conservare i tubi in ghiaccio. Per garantire che le nanoparticelle di zolfo residue vengano rimosse dai terreni filtrati, preparare standard di nanoparticelle non filtrate con un intervallo di concentrazione da un bianco a 0,2 microgrammi per millilitro in DMEM privo di siero.

Quindi aliquotare 50 millilitri dei campioni filtrati e di ciascuno standard in una piastra di fondo trasparente a parete nera e misurare l'assorbanza da 390 a 410 nanometri. Per misurare la concentrazione di TNF-alfa nei campioni, utilizzare metà del loro volume rimanente in un kit disponibile in commercio. Per questo test stabilire cellule ipotalamiche da ceppi congelati.

Utilizzando gli stessi metodi descritti per stabilire colture microgliali. Infine, usatele per seminare piastre a fondo chiaro con pareti nere con 5000 cellule per pozzetto in 200 microlitri di DMEM integrato. Dopo 24 ore di coltura, rimuovere 100 microlitri di terreno e sostituirlo con 100 microlitri di terreno filtrato e concentrato raccolto dalle colture cellulari microgliali attivate, quindi incubare la piastra per 24 ore in condizioni standard.

Il giorno successivo aggiungere 22 microlitri di reagente di resazurina a ciascun pozzetto e continuare l'incubazione per 20 minuti. Quindi, con uno spettrofotometro multimodale, prendere una misura di florescenza per stimare la vitalità delle cellule in termini di unità di fluorescenza relativa. Con il protocollo delineato, la funzione della microglia può essere utilizzata come biosensore surrogato per la risposta del cervello alle nanoparticelle.

La secrezione di TNF-alfa da parte della microglia è risultata significativamente aumentata in seguito all'esposizione a nanoparticelle di schegge. Quando i neuroni ipotalamici sono stati esposti al mezzo condizionato dalla microglia attivata da nanoparticelle d'argento, la vitalità dei neuroni è stata significativamente ridotta. In linea di principio, l'esposizione alle nanoparticelle d'argento ha attivato la microglia in uno stato pro-infiammatorio M1.

Quindi le citochine pro-infiammatorie rilasciate contribuiscono alla morte cellulare circostante. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la microglia come biosensore surrogato per testare la risposta alle nanoparticelle e se questa risposta è neurotossica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro giorni se eseguita correttamente.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la profilazione di altre citochine secrete in seguito all'attivazione microgliale, al fine di fenotipizzare gli stati di attivazione microgliale.