Name: Microglia come un biosensore surrogato per determinare nanoparticelle neurotossicità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Scopri come utilizzare le microglia come biosensore surrogato per valutare la neurotossicità delle nanoparticelle in vitro. Questo metodo riduce la necessità di studi su roditori a lungo termine.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento degli Affari dei Veterani degli Stati Uniti BLR&D IK2 BX001686 (a TAB), e sovvenzioni dall'Università del Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (a CMD, JPN, e TAB) e dalla Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (a TAB). Ringraziamo i dottori Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) e Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) per aver fornito la linea cellulare BV2.

1. microglia Manutenzione Cell Culture <ol><li> terreno di coltura cellulare Warm (Dulbecco Modified Eagle Medium; DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina / neomicina (PSN) a 37 ° C. </li><li> Ottenere Stock Frozen di cellule microgliali BV2 al passaggio 18 - 25 da stoccaggio a -80 ° C. Rapidamente scongelare le cellule a 37 ° C bagnomaria. </li><li> Trasferire delicatamente le cellule in un pallone ventilato 75 centimetri 2 terreni di coltura contenente 10 ml di cellule. </li><li> Incubare pallone in 5% di CO 2 a 37 ° C. mezzi Aspirare dopo 24 ore e sostituire con mezzi freschi. Crescere le cellule fino a circa 70 - 80% di confluenza. </li></ol> 2. Conteggio e cellule placcatura <ol><li> In un bagno d&#39;acqua a 37 ° C, DMEM caldo e soluzione 1x-tripsina-EDTA. </li><li> supporti Aspirare dalle cellule e aggiungere 500 ml di tripsina. Incubare a 37 ° C per 2 - 5 min. </li><li> Utilizzando un raschietto, rimuovere le cellule dal pallone e sospendere in 5 mldi DMEM. Passare cellule attraverso un filtro 70 micron in un tubo da 50 ml tre volte. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e sementi 8.000 cellule / pozzetto in un nero murate piastra inferiore chiara in un volume finale di 200 microlitri DMEM supplementato con 10% FBS e 1% PSN. Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore. </li><li> Rimuovere la vecchia DMEM e sostituirlo con 200 ml di DMEM riscaldato integrato con 1% PSN al siero morire di fame microglia. Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore. </li></ol> 3. Attivazione microglia <ol><li> In tubi separati, diluire AGNPS (0,01, 0,05 o 0,1 mg / ml) e controllo del veicolo / neutro (citrato di sodio, 0,04 mM) in DMEM senza siero addizionato con 1% PSN a concentrazioni finali di lavoro. </li><li> Togliere 100 ml di mezzi di ogni bene e sostituirlo con 100 ml di composto trattamento appropriato. </li><li> Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore. </li></ol> 4. Filtraggio media condizionata <ol><li> Raccogliere 200 ml di surnatante dei media da ogni pozzetto e trasferire in un filtro (cutoff peso molecolare di 10 kDa) con tubo di raccolta (1,5 a 2 ml). </li><li> Centrifugare a 14000 xg a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Gettare il flow-through (surnatante con particelle) e inserire il filtro a testa in giù in un nuovo tubo di raccolta. </li><li> Centrifugare a 1000 xg a temperatura ambiente per 2 min. NOTA: I media filtrato risultante (contenente citochine secrete) è concentrata per sei volte. </li><li> Portare il volume di concentrato a 400 ml con DMEM fresco supplementato con 10% FBS e 1% PSN e memorizzare sul ghiaccio. NOTA: Per assicurare AGNPS residui vengono rimossi dal supporto filtrati, genera una concentrazione AgNP sulla base del picco caratteristico a circa 390-420 nm 10. In breve, preparare aliquote di AGNPS non filtrati (0, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, e 0.2 mg / ml come descritto al punto 3.1) e filtratacontrollo del veicolo (citrato di sodio, 0,04 mM) in DMEM senza siero. Aliquota 50 ml di campioni e degli standard filtrati in un nero murate piastra inferiore chiaro. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare l&#39;assorbanza a 390-410 nm e confrontare le letture per la curva di concentrazione AgNP. Se i campioni filtrati hanno lo stesso valore di assorbanza del campione di controllo del veicolo, si può presumere AGNPS residui vengono rimossi. </li><li> Utilizzare la metà dei mezzi filtrati per determinare secrezione TNF-α seguenti istruzioni da un kit disponibile in commercio. </li></ol> 5. ipotalamico Manutenzione Cell Culture <ol><li> Warm mezzo di coltura cellulare DMEM supplementato con 10% FBS e 1% PSN a 37 ° C. </li><li> Ottenere Stock Frozen di ipotalamo (mHypo-A1 / 2) le cellule a passaggio 18 - 25 conservati a 80 ° C. Rapidamente scongelare le cellule a 37 ° C bagnomaria. </li><li> Trasferire delicatamente le cellule in un pallone ventilato 75 centimetri 2 terreni di coltura contenente 10 ml di cellule. </li><li> Incubare pallone in 5% di CO 2 </sub&gt; a 37 ° C. mezzi Aspirare dopo 24 ore e sostituire con mezzi freschi. Crescere le cellule fino a circa a 70 - 80% di confluenza. </li></ol> 6. Determinazione ipotalamica cellulare Tossicità <ol><li> DMEM caldo e la soluzione 1x-tripsina-EDTA in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> supporti Aspirare dalle cellule ipotalamiche e aggiungere 500 ml di tripsina. Incubare a 37 ° C per 2 - 5 min. Rimuovere le cellule dal pallone con un raschietto come sopra descritto al punto 2. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e piastra cellule ipotalamiche a 5.000 cellule / pozzetto in un nero murate piastra inferiore chiara in un volume finale di 200 microlitri DMEM supplementato con 10% FBS e 1% PSN e incubare durante la notte in 5% CO 2 a 37 ° C . </li><li> Togliere 100 ml di vecchi media con un pipetter multicanale e aggiungere 100 ml di mezzi condizionati concentrati filtrati, ad una concentrazione finale di 1x. </li><li> Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore. </li><li> Aggiungere 221; l di reagente resazurina e incubare per 20 min piastra in 5% CO 2 a 37 ° C. </li><li> Utilizzando uno spettrofotometro multimodale, registrare la fluorescenza (560 nm EX / 590 nm EM) per misurare la vitalità cellulare. Riportare i risultati come unità di fluorescenza relativa (RFU). </li></ol>

<ol><li>Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution%3A+mechanisms+of+neuroinflammation+and+CNS+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease.</a> Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Studi recenti sostengono che l'esposizione ambientale contribuisce all'obesità e ad altre malattie neurodegenerative 11,12. Tuttavia, le tecniche utilizzate negli studi precedenti richiedono tempo e denaro. Considerazioni economiche, sistemi di somministrazione fisiologicamente rilevanti, questioni etiche con l'uso estensivo di modelli animali in vivo e difficoltà a tradurre i risultati in consigli sanitari significativi sono alcune delle principali sfide che hanno ostacolato i progressi nello studio ...

Inquinamenti ambientali, in particolare quelle della gamma di nanoparticelle (NP) (1 - 20 nm di diametro), sono stati collegati a obesità e altre malattie neurodegenerative dovute alla capacità di attraversare la barriera emato-encefalica 1-3. L&#39;esposizione elevata a inquinamento può indurre l&#39;infiammazione del sistema nervoso centrale, tra cui l&#39;ipotalamo 1. Un potenziale meccanismo in cui questo si verifica potrebbe essere attraverso nanoparticelle indotta attivazione di microglia (cellule immunitarie del cervello) 4. Studi precedenti hanno usato modelli in vivo per studiare gli effetti delle NP sulla salute del cervello che sono in termini di tempo, costosa, e non direttamente rispondere alla domanda di come NP influenzano microglia. Microglia svolgono un ruolo poliedrico nel sistema nervoso centrale, compreso il mantenimento del microambiente cerebrale e comunicante con circostanti neuroni tramite il rilascio di fattori secreti e citochine. A seconda degli stimoli, microglia può essere attivato per un pr M1o-infiammatorie o uno stato antinfiammatorio M2. Ad esempio, M1 attivato microglia rilasciano citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), mentre M2 attivato rilascio microglia citochine anti-infiammatorie comprese interleuchina-4 (IL-4). Per convalidare la nostra surrogata in vitro biosensore per la determinazione neurotossicità degli inquinanti atmosferici, abbiamo misurato la risposta della microglia a 20 nm nanoparticelle d&#39;argento (AGNPS). L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di descrivere come una linea di cellule microgliali in vitro può essere utilizzato come marcatore surrogato biosensore per testare la risposta della microglia murina di NP e come microglia attivazione colpisce le cellule ipotalamiche. Il lungo termine destinato applicazione di questo modello convalidato è quello di testare gli effetti delle sostanze inquinanti del mondo reale per la salute del cervello e le malattie neurodegenerative. Forniamo una descrizione dettagliata di un test in vitro formato da 96 pozzetti per la misura di attivazione della microglia e la sopravvivenza delle cellule ipotalamico dopo l&#39;esposizione del microfono<html> roglial mezzi condizionati. attivazione della microglia è stato determinato a seguito di esposizione AgNP utilizzando un enzima TNF-α linked immunosorbent assay (ELISA). Per determinare l&#39;effetto della microglia attivata su cellule ipotalamiche, i AGNPS sono stati rimossi dal surnatante microglia (mezzi condizionati) utilizzando un dispositivo di filtraggio. Il dispositivo di filtraggio mantiene citochine, escludendo i AGNPS in base alle dimensioni. Brevemente, surnatante dal microglia trattate con o senza AGNPS stato raccolto, aggiunto ai filtri, e centrifugato a 14.000 xg per 15 min. Siamo stati quindi in grado di determinare l&#39;influenza delle citochine secrete microgliali sulla vitalità delle cellule ipotalamo. Tossicità cellulare a seguito di esposizione ai media condizionata (contenenti citochine) è stata determinata mediante un saggio resazurin basato come precedentemente descritto 5,6. Metabolicamente attive cellule riducono resazurin e producono un segnale fluorescente proporzionale al numero di cellule vitali 7. nt &quot;&gt; Ci sono molti vantaggi di utilizzare questa tecnica rispetto ad altri (come co-coltura, messe a punto trans-bene, o esperimenti in vivo). Il nostro modello offre la possibilità di attivare direttamente microglia e determinare se i fattori secreti sono tossici per i neuroni 8 . L&#39;attuale protocollo utilizza immortalato microglia BV2 stimolato con le nanoparticelle di diametro 20 nm, e immortalato cellule ipotalamiche murine (designato mHypo-A1 / 2) 9 per la determinazione della risposta successiva. Anche se questo protocollo è stato ottimizzato per queste condizioni specifiche, i metodi possono essere alterato per essere utilizzato in altri modelli di morte cellulare indotta microgliali, o con altri tipi di cellule inclusi microglia primaria e neuroni.

<table><tbody><tr><td>Cells/Reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare microgliale di topo (BV2)Collezione</td> di <td>linee cellulari interlab (Genova, Italia)</td><td>ATL03001</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare di ipotalamo di topo adulto mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina/Neomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticelle d'argento (20 nm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>730793</td><td></td></tr><tr><td> PrestoBlue Cell Viability Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF- &alfa; ELISA Max Delux Biolegend</td><td></td><td>430904</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</ Piastra</td> di fondo ottico strong><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 W, polistirene nero, trattamento per colture cellulari, con coperchio,</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Unità filtrante centrifuga Ultra-0.5 sterile con membrana Ultracel-10</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate</td><td>Molecular Devices</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Centrifuga conica Tubi</td><td>Corning, Inc</td><td> 14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per celle Falcon 70 &mu; m</td><td>Corning, Inc</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo 5430</td><td>Eppendorf</td><td>22620560</td><td></td></tr></tbody></table>

microglia come un biosensore surrogato per determinare nanoparticelle neurotossicità

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Le nanoparticelle presenti negli inquinanti atmosferici possono alterare i profili dei neurotrasmettitori, aumentare la neuroinfiammazione e alterare la funzione cerebrale. Pertanto, il test qui descritto aiuterà a chiarire il ruolo della microglia nella neuroinfiammazione e nelle malattie neurodegenerative. L'uso delle microglia, cellule immunitarie residenti nel cervello, come biosensore surrogato fornisce nuove informazioni su come le risposte infiammatorie mediano gli insulti neuronali. Qui, utilizziamo una linea cellulare microgliale murina immortalizzata, designata BV2, e descriviamo un metodo per l'esposizione alle nanoparticelle utilizzando nanoparticelle d'argento (AgNP) come standard. Descriviamo come esporre la microglia alle nanoparticelle, come rimuovere le nanoparticelle dal surnatante e come utilizzare il surnatante dalla microglia attivata per determinare la tossicità, utilizzando la sopravvivenza delle cellule ipotalamiche come misura. Dopo l'esposizione ad AgNP, l'attivazione microgliale di BV2 è stata convalidata utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α). Il surnatante è stato filtrato per rimuovere l'AgNP e per consentire alle citochine e ad altri fattori secreti di rimanere nel terreno condizionato. Le cellule ipotalamiche sono state quindi esposte al surnatante della microglia attivata da AgNP e la sopravvivenza dei neuroni è stata determinata utilizzando un test fluorescente a base di resazurina. Questa tecnica è utile per utilizzare la microglia come biomarcatore surrogato della neuroinfiammazione e determinare l'effetto della neuroinfiammazione su altri tipi di cellule.

Abbiamo dimostrato che la funzione microglia come un biosensore surrogato per la risposta del cervello alle nanoparticelle utilizzando il protocollo di cui sopra. I nostri risultati includono la misurazione degli effetti tossici di attivazione della microglia sulla morte delle cellule neuronali a valle. La Figura 1 mostra un flusso di lavoro del protocollo per attivare la microglia e determinare se le citochine secrete ridurre la vitalità dei neuroni ipotalamici. Secrezi...

Le microglia (cellule immunitarie del cervello), vengono utilizzate come biosensore surrogato per determinare come le nanoparticelle influenzano la neurotossicità. Descriviamo una serie di esperimenti progettati per testare la risposta microgliale alle nanoparticelle e l'esposizione dei neuroni ipotalamici al surnatante della microglia attivata per determinare la neurotossicità.

Microglia come un biosensore surrogato per determinare nanoparticelle neurotossicità

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere un biosensore surrogato in vitro per testare la risposta delle microglia alle nanoparticelle. Successivamente, determineremo la neurotossicità a seguito dell'esposizione a mezzi condizionati provenienti da microglia stimolate con nanoparticelle. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come vengono attivamente selezionate le nanoparticelle per la neurotossicità.Il principale vantaggio di questa tecnica è che il nostro modello consente di attivare direttamente le microglia e determinare se i fattori secreti siano neurotossine, senza ricorrere a costosi studi a lungo termine su roditori. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla morte cellulare indotta da microglia in seguito all'esposizione a microparticelle, può essere applicato anche ad altri modelli di malattie neurodegenerative nel contesto della valutazione di potenziali inquinanti ambientali neurotossici.Generalmente, gli individui alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà nel passaggio di filtrazione del mezzo condizionato. Poiché l'efficienza della filtrazione può variare in base alle dimensioni, alla forma e alla concentrazione delle nanoparticelle. In preparazione, riscaldare il DMEM integrato con 10% di FBS e 1% di PSN a 37 gradi Celsius.Quindi prelevare cellule microgliali BV2 congelate ottenute dai passaggi 18-25 e scongelarle rapidamente a 37 gradi Celsius. Successivamente, trasferire delicatamente le cellule scongelate in un fiasco ventilato da 75 centimetri quadrati contenente 10 millilitri di mezzo e incubare il fiasco. Dopo 24 ore sostituire il mezzo e continuare a coltivare le cellule fino a quando non raggiungono una confluenza del 70-80%. A questo punto aspirare il mezzo e aggiungere 500 microlitri di soluzione di tripsina-EDTA 1x calda.Dopo aver lasciato incubare il matraccio per alcuni minuti aggiuntivi, utilizzare una spatola per raccogliere le cellule in 5 millilitri di DMEM caldo. Quindi filtrare le cellule dal matraccio attraverso un setaccio da 70 micron. Ripetere questa filtrazione tre volte utilizzando lo stesso setaccio e raccogliere le cellule in un tubo da 50 millilitri.Dopo aver filtrato, contare le cellule e quindi seminare una piastra con pareti nere e fondo trasparente con 8000 cellule per pozzetto in 200 microlitri di DMEM integrato. Dopo 24 ore di incubazione, sostituire il mezzo nei pozzetti con DMEM privo di siero per privare di nutrienti le microglia. Dopo ulteriori 24 ore di incubazione, procedere all'attivazione delle microglia.A tal fine, diluire innanzitutto le nanoparticelle d'argento nel DMEM senza siero alla concentrazione lavorativa desiderata. Successivamente, sostituire 100 microlitri di mezzo con il composto da trattare. Assicurarsi di includere un controllo negativo costituito dalla soluzione veicolare diluita senza le nanoparticelle.Ora proseguire l'incubazione per 24 ore e procedere con l'analisi. Per iniziare, raccogliere 200 microlitri di mezzo soprannatante da ciascun pozzetto della piastra e caricarlo su un filtro che rimuoverà le nanoparticelle, posizionato sopra una provetta per microcentrifuga. È importante ricordare che, durante la filtrazione delle nanoparticelle, le loro dimensioni, la forma e la concentrazione influiscono sull'efficienza di fusione.Pertanto, è consigliabile testare la filtrazione in anticipo. Ora centrifugare i tubi a 14000g a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi scartare il flusso passante, che contiene le nanoparticelle, e posizionare i filtri capovolti in nuovi tubi di raccolta.Centrifugare i filtri a testa in giù a 1000g per due minuti per raccogliere il mezzo condizionato concentrato contenente citochine. Successivamente, portare il volume del campione a 400 microlitri aggiungendo DMEM supplementato appena preparato e conservare le provette sul ghiaccio. Per assicurarsi che i residui di nanoparticelle di zolfo siano rimossi dal mezzo filtrato, preparare standard di nanoparticelle non filtrate in una serie di concentrazioni comprese tra un bianco e 0,2 microgrammi per millilitro in DMEM privo di siero.Quindi aliquotare 50 millilitri dei campioni filtrati e di ciascuno standard in una piastra trasparente con pareti nere e fondo chiaro e misurare l'assorbanza da 390 a 410 nanometri. Per misurare la concentrazione di TNF-alfa nei campioni, utilizzare metà del volume rimanente con un kit disponibile in commercio. Per questo saggio, stabilire cellule ipotalamiche da ceppi congelati.Utilizzando gli stessi metodi descritti per l'allestimento di colture di microglia. Utilizzarle infine per seminare piastre con fondo trasparente e pareti nere con 5000 cellule per pozzetto in 200 microlitri di DMEM integrato. Dopo 24 ore di coltura, rimuovere 100 microlitri di mezzo e sostituirli con 100 microlitri di mezzo filtrato e concentrato raccolto dalle colture di cellule microgliali attivate, quindi incubare la piastra per 24 ore in condizioni standard.Il giorno successivo aggiungere 22 microlitri di reagente resazurina in ogni pozzetto e proseguire l'incubazione per 20 minuti. Quindi, mediante un fotometro multimodale, effettuare una misura di fluorescenza per stimare la vitalità delle cellule in termini di unità di fluorescenza relativa. Con il protocollo descritto, la funzione dei microglia può essere utilizzata come biosensore surrogato della risposta cerebrale alle nanoparticelle.La secrezione di TNF-alfa da parte delle microglia è aumentata in modo significativo dopo l'esposizione a nanoparticelle d'argento. Quando i neuroni ipotalamici sono stati esposti al mezzo condizionato proveniente da microglia attivate da nanoparticelle d'argento, la vitalità dei neuroni è risultata significativamente ridotta. In linea di principio, l'esposizione alle nanoparticelle d'argento ha attivato le microglia verso uno stato M1 pro-infiammatorio.Successivamente, le citochine pro-infiammatorie rilasciate contribuiscono alla morte cellulare circostante. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare i microglia come biosensore surrogato per testare la risposta ai nanoparticelle e se tale risposta è neurotossica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro giorni se effettuata correttamente.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il profilo di altre citochine secrete in seguito all'attivazione dei microglia, al fine di definire gli stati di attivazione dei microglia.

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