Name: Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo Ex Vivo Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Scopri come utilizzare microsfere di PLGA per la somministrazione sostenuta di composti a isole pancreatiche intatte di topo, studiando la proliferazione delle cellule beta. Questo metodo versatile supporta la ricerca sul diabete.

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Gli autori ringraziano Bethany Carboneau (Vanderbilt University) per la lettura critica di questo manoscritto. Ringraziamo anche Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) per l'isolamento delle isole, e il Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) e il Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) per l'uso della loro centrifuga e della loro struttura di coltura dei tessuti. Questa ricerca ha comportato l'uso del nucleo di approvvigionamento e analisi delle isole del Vanderbilt Diabetes Research and Training Center, supportato da sovvenzioni NIH DK20593. Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato dell'American Heart Association (14POST20380262) a RCP e da sovvenzioni dalla Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592) e dal Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) a M.A.G.

Tutte le procedure sono state approvate e eseguite in conformità con il Comitato cura e l&#39;uso Vanderbilt Istituzionale Animal. 1. Etichettatura COI con Fluoroforo (opzionale) <ol><li> Scegliere un colorante fluorescente che reagisce con un&#39;ammina primaria libera (ad esempio, su una proteina), come esteri o derivati succinimidyl fluoresceina, per visualizzare microsfere carico. Sciogliere 8x eccesso molare (rispetto alla moli di COI) di fluoroforo in 200 ml di dimetilsolfossido (DMSO). </li><li> Risospendere 50 mg di COI fino ad un volume finale di 800 microlitri in una soluzione veicolo (concentrazione finale di 62,5 ng / ml). La soluzione di veicolo varierà a seconda della fonte del COI. NOTA: veicolo tipico soluzioni includono tampone fosfato salino (PBS) o DMSO. </li><li> Aggiungere tutta la soluzione fluoroforo / DMSO dal punto 1.1 e risospendere il COI. Vortex notte a 4 ° C. In alternativa, agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente(RT) per 4 ore. </li><li> Dopo la reazione di marcatura, rimuovere l&#39;eccesso fluoroforo utilizzando una colonna dissalazione. <ol><li> Scolare buffer di storage da colonna dissalazione e risciacquare con 16 ml di acqua deionizzata. Gettare tutto il flusso attraverso. </li><li> Aggiungere il COI fluorescente alla colonna di dissalazione. Eluire con 1,2 ml di acqua deionizzata e raccogliere il flusso attraverso. </li><li> step eluizione Ripetere altre quattro volte, ogni volta aggiungendo 1,2 ml di acqua deionizzata e di raccolta del flusso attraverso come campione separato. </li><li> Congelare tutto il flusso raccolte attraverso i campioni a -80 ° C e liofilizzare secondo le istruzioni del produttore per 24 ore. </li></ol></li></ol> 2. COI-caricato microsfere Preparazione tramite l&#39;acqua acqua-in-olio-in-emulsione di solventi evaporazione Metodo <ol><li> Aggiungere 1 mg di fluorescente COI a 100 ml di acqua deionizzata per formare la prima fase acquosa (W1). </li><li> Sciogliere 65 mg di poli (aci lattico-co-glicolicod) (50:50 Lactide: Glycolide, peso molecolare 54.000 - 69.000) in 750 ml di diclorometano in una provetta. Ultrasonicate per 10 - 30 sec (a 160 W) per sciogliere completamente il PLGA. Ciò costituisce la fase olio (O). </li><li> Aggiungere tutti fase W1 generato nel passaggio 2.1 alla fase O in maniera goccia a goccia. Emulsionare usando un omogeneizzatore portatile a 20.000 rpm per 30 secondi per formare la fase W1 / O. </li><li> Aggiungere tutti fase / O W1 in maniera goccia a goccia a 15 ml di una soluzione all&#39;1% (PVA) (peso / volume) poli acquosa (vinil alcool) ed emulsionare usando un omogeneizzatore portatile a 20.000 rpm per 30 sec . </li><li> Trasferire tutto dell&#39;emulsione generato nel passaggio da 2.4 a 200 ml pallone a fondo tondo e soggetto ad un 635 millimetri Hg di vuoto usando un evaporatore rotante per 1 ora per rimuovere il solvente e generare la fase acquosa. </li><li> Aliquota 1 ml di fase acquosa generati in fase di 2,5 a quattordici provette da microcentrifuga. La centrifugazione della soluzione acquosa in tubi da microcentrifuga a 7.500xg per 8 min. NOTA: A questo punto, le microsfere sono presenti nella soluzione acquosa rimanente e si concentrano sul fondo della provetta. </li><li> Rimuovere con cautela 900 ml di soluzione acquosa dai tubi microcentrifuga con una micropipetta, pipettaggio in modo da non disturbare le microsfere sul fondo della provetta. <ol><li> Lavare le microsfere di un eccesso di PVA con l&#39;aggiunta di 1 ml di acqua deionizzata ad ogni provetta. Centrifugare a 7500 xg per 8 minuti, e ancora rimuovere con cautela 900 ml di soluzione acquosa dai tubi microcentrifuga con una micropipetta, pipettaggio in modo da non disturbare le microsfere sul fondo della provetta. NOTA: La soluzione acquosa 100 microlitri rimanente contiene microsfere generate. </li></ol></li><li> Congelare la soluzione acquosa microsfera generato nel passaggio 2,7 a -80 ° C. </li><li> microsfere lyophilize utilizzando un liofilizzatore secondo il fornitore dile istruzioni e conservare a -20 ° C. NOTA: Misura efficienza carico del COI sciogliendo completamente microsfere di PLGA e determinare la concentrazione di proteine rispetto ad una curva standard della proteina free 7. </li><li> Come controllo negativo, genera una serie di microsfere &quot;in bianco&quot; (di seguito denominati microsfere di controllo). NOTA: La generazione di microsfere di controllo è identica alla generazione di idrofili microsfere COI caricati, senza aggiunta COI a 800 microlitri della soluzione di veicolo in fase 1.2. particelle di controllo Partita a concentrazione di massa di PLGA rispetto a microsfere PLGA COI-caricati per il saggio mitogeno β-cellule. </li></ol> 3. Preparazione di Islet cultura dei media e media pre-test <ol><li> Preparare 200 ml media per la cultura di isole di topo intatte: RPMI 1640 multimediale integrato con 11 mm di glucosio, il 10% siero di cavallo, 100 U / ml di penicillina G e 100 mg / ml di streptomicina (di seguito indicato come èlasciare terreni di coltura). NOTA 1: A differenza di siero fetale bovino (FBS), siero di cavallo manca lattogeno placentare, un induttore della proliferazione β-cellule, che confonde l&#39;analisi del saggio di proliferazione. NOTA 2: Poiché le microsfere di PLGA non vengono sterilizzati prima dell&#39;uso, l&#39;aggiunta di antibiotici ai terreni di coltura è fondamentale per evitare contaminazione microbiologica. </li><li> Rimuovere 25 ml di terreni di coltura isolotto con una pipetta elettronica e posto in un tubo conico da 50 ml. Supplemento 25 ml di mezzo di coltura isolotto nel tubo conico 50 ml con una concentrazione finale di 0,2 mM EGTA per generare il supporto pre-test. NOTA: L&#39;aggiunta di EGTA allenta leggermente contatti cellula-cellula nelle isole senza alterare l&#39;architettura isolotto. Questo aiuta a garantire la COI può raggiungere le cellule interne del isolotto e aiuta a prevenire la necrosi del isolotto centrale. </li></ol> 4. coltura di Intact isole di topo <ol><li> Isolare isolotti intatti da un ceppo preselezionato, il sesso, age, e il genotipo di topi dopo una digestione collagenasi di routine del 8,9 pancreas. Pool insieme isolotti da come campioni. </li><li> Aliquota 40 isolotti in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti in 200 ml di terreni di coltura isolotto. Visivamente isolotti size-partita per bene (una precisa valutazione di equivalenza isolotto (IEQ) tra i campioni non è necessario). Riempire i pozzi vuoti immediatamente adiacenti ai pozzi con isolotti con 200 ml di acqua sterile per fornire un buffer di evaporazione. Culture isolotti in mezzi notte a 37 ° C in atmosfera di 95% CO aria e 5% 2. </li></ol> 5. risospensione del COI-caricati e Controllo PLGA microsfere <ol><li> Dopo il recupero isolotto overnight, microsfere risospendere aggiungendo supporti pre-test per un&#39;aliquota di liofilizzati microsfere di PLGA COI caricati tale che la concentrazione finale del COI nella provetta è di 10 ng / ml (la quantità di COI presente in una data quantità di le micro generatiatmosfere sono stati determinati in fase 2.9). Sonicare le microsfere COI-caricati risospeso in un bagno di acqua ghiacciata per 10 minuti a 160 W con impulsi lunghi 10 sec a 4 ° C. </li><li> controllo Risospendere PLGA microsfere aggiungendo lo stesso volume di supporti pre-test per un&#39;uguale massa di controllo liofilizzato microsfere di PLGA. Sonicare i risospesa microsfere di controllo PLGA in un bagno di acqua ghiacciata per 10 minuti a 160 W con impulsi lunghi 10 sec a 4 ° C. </li><li> Visivamente confermano microsfere sono dispersi pipettando 2 ml di microsfere risospese tra due vetrini. Visualizza microsfere utilizzando un obiettivo 40X su un microscopio a epifluorescenza o campo chiaro. </li><li> Se significativa aggregazione delle microsfere è ancora visibile, ultrasuoni in un bagno di acqua ghiacciata per altri 10 minuti a 160 W con impulsi lunghi 10 sec a 4 ° C e la visualizzazione di ripetizione di microsfere risospesa. </li></ol> 6. Il trattamento di isolotti con COI-caricati o controllo PLGA microsfere &lt;/ P&gt; <ol><li> Per ciascun pozzetto da trattare con microsfere COI-caricati, preparare supporti dosaggio diluendo il 10 ng / ml di microsfere COI risospesa con mezzi di pre-test per un volume finale di 100 microlitri e una concentrazione finale predeterminata. NOTA: La concentrazione finale ottimale della proteina può variare per ogni COI impiegato per questo dosaggio. Idealmente, un intervallo di concentrazioni finali sono testati. </li><li> Per ogni bene per essere usato come controllo, preparare il controllo dei media dosaggio diluendo il controllo microsfere risospesa PLGA generati al passo 5.2 con lo stesso volume di diluizione utilizzato per diluire le microsfere COI-caricati al punto 6.1. NOTA: Isolotti trattati con mezzi saggio di controllo serviranno come controllo negativo per consentire l&#39;individuazione di eventuali effetti delle microsfere vuote possono avere sui risultati sperimentali. </li><li> Rimuovere con cautela 100 ml di terreni di coltura isolotto da ogni pozzetto con una micropipetta tale che non isolotti sono sloggiati dai pozzi. Delicatamente aggiungere 100 μl di mezzi di analisi o 100 ml di mezzi saggio di controllo in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare isolotti a 37 ° C in atmosfera di 95% CO aria e 5% 2 per tre giorni. </li></ol> 7. Dispersione Isolotti intatte Onto vetrini da microscopio <ol><li> Dopo tre giorni, utilizzare una micropipetta per rimuovere con attenzione e gettare i media saggio da tutti i pozzetti in modo da non rimuovere isolotti. Delicatamente aggiungere 200 ml di PBS a isolotti di lavarle dei mezzi di test. Rimuovere con cautela e scartare PBS con una micropipetta e lavare delicatamente isolotti di nuovo con altri 200 ml di PBS. </li><li> Rimuovere e gettare PBS con una micropipetta e aggiungere 100 ml di 0,025% tripsina, 2 mM EDTA soluzione. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Pipettare isolotti nella soluzione tripsina-EDTA su e giù ogni 2 minuti fino a quando isolotti sono confermati visivamente di essere disperso nelle singole cellule (si noti che alcuni piccoli grumi di cellule possono essere ancora presenti) utilizzando un microscopio ottico. Trasferire l&#39;intero volume di ciascun pozzetto singolamente in microprovette labeled-. </li><li> Aggiungere 400 ml di terreni di coltura isolotto a ciascuna provetta per fermare la dissociazione delle cellule tripsina-mediata. </li><li> campioni di centrifugazione per 5 min a 100 xg a 4 ° C a pellet cellule insulari al fondo dei tubi microcentrifuga. </li><li> Rimuovere delicatamente il surnatante con una micropipetta, e risospendere pellet in 200 terreni di coltura isolotto ml fresca. </li><li> Utilizzando un cito-centrifuga, centrifuga dissociato isolotti a 140 xg per 3 minuti su vetrini da microscopio cariche. </li><li> Air diapositive a secco a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi disegnare una casella intorno agli isolotti dissociate con un pennarello idrofoba. </li><li> Fissare le cellule con 75 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) a temperatura ambiente per 10 min. Rimuovere 4% PFA e lavare delicatamente le cellule in 75 ml di PBS due volte. Dopo il lavaggio, permeabilize cellule con 75 microlitri 0,2% Triton X-100 in PBS per 10 min. Quindi, lavare le cellule con 75 ml di PBS. Attenzione: PFA è noto per essere allergenico, cancerogeno e tossico. </li></ol&gt; 8. immunofluorescenza Etichettatura di dissociato isolotti per l&#39;insulina e la proliferazione cellulare Marker, Ki67 <ol><li> Preparare una camera umida posizionando due asciugamani di carta bagnata sul fondo di una scatola vetrino da microscopio capacità 100 diapositiva. </li><li> Collocare i vetrini piatto verso il basso (cellule verso l&#39;alto) in camera umida. Preparare i campioni per l&#39;etichettatura aspirando il PBS dalla fase di lavaggio precedente utilizzando una micropipetta e l&#39;aggiunta di 75 ml di soluzione bloccante (5% Normal Donkey Serum (NDS) in PBS) per ogni diapositiva per bloccare legame non specifico di anticorpi contro i campioni. Incubare i vetrini in soluzione bloccante per 1 ora a RT. </li><li> Delicatamente aspirato soluzione bloccante utilizzando una micropipetta e aggiungere 75 ml di soluzione di anticorpo primario contenente cavia anti-insulina e coniglio anticorpi anti-Ki67, diluito 1 mg / ml a 5% NDS in PBS. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. NOTA: gli indicatori alternativi di proliferazione delle cellule proliferanti includono l&#39;antigene nucleare delle cellule (PCNA) e phosphohistone H3 (PH3), </li><li> Aspirare delicatamente soluzione di anticorpo primario con una micropipetta e lavare le cellule con 75 ml di PBS. Aspirare PBS usando una micropipetta e lavare le cellule due volte, ogni volta con 75 ml di PBS. Incubare ciascun campione con l&#39;anticorpo secondario 75 microlitri anti-guinea pig Cy5 e anti-rabbit Cy3 anticorpo secondario diluito a 2 ug / ml in soluzione bloccante per 1 ora a RT. NOTA: non utilizzare anticorpi secondari marcati con lo stesso o spettralmente sovrapposizione fluoroforo che è stato già utilizzato per etichettare le microsfere. </li><li> soluzione di anticorpo secondario Aspirare utilizzando una micropipetta e incubare in 75 ml di 300 nM DAPI in PBS per 3 minuti a RT. Aspirare DAPI utilizzando una micropipetta e sciacquare in acqua deionizzata per 5 min. </li><li> Aspirare delicatamente l&#39;acqua da campioni utilizzando una micropipetta. Spot una goccia (circa 100 ml) di soluzione di montaggio rapida essiccazione contenente antifade reagente su un vetrino di vetro. Invertire il lato del microscopio del campione scivolo verso il basso, onto la soluzione di montaggio. Premere delicatamente il vetrino contro il vetrino con una punta di pipetta per rimuovere le bolle e spazzare via il liquido in eccesso con un panno di pulizia morbido. Lasciare coprioggetto asciugare per una notte a temperatura ambiente. </li></ol> 9. Acquisizione di immagini e analisi <ol><li> Utilizzare un microscopio a epifluorescenza con una fotocamera collegata per l&#39;acquisizione delle immagini. Per ogni fluoroforo, determinare il momento ottimale di esposizione (in genere 20 msec per DAPI, 40 - 80 msec per l&#39;insulina, e 250 msec per Ki67). Assicurarsi parametri di acquisizione delle immagini sono uguali per tutti i campioni. </li><li> Per ogni campione, contare manualmente 3.000 cellule insulino-positive e di quelle contare quante sono anche Ki67-positivi. contare soltanto cellule insulino-positive che hanno un nucleo ben definito e ben visibile. Calcolare la percentuale di proliferazione cellule beta per ogni campione dividendo il numero di cellule Ki67-positive / insulino-positive per il numero totale di cellule insulino-positive e moltiplicando per 100. </li><li> dopo determining la percentuale di proliferazione cellule beta per ciascun campione, determinare se una differenza statisticamente significativa nella proliferazione delle cellule β-esiste tra controllo e campioni sperimentali, analizzando i risultati con un one-way ANOVA utilizzando il software statistico disponibile in commercio. </li></ol>

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<li>Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pH-+and+temperature-responsive+microparticles+for+protein+delivery+to+ischemic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues.</a> Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).</li>
<li>Poole, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo studio della proliferazione β-cellule in coltura è tipicamente ostacolato da diverse difficoltà. In primo luogo, le linee β-cellule immortalati sono caratterizzati da elevati livelli di proliferazione di quello che si trova in endogene cellule beta nelle isole dal vivo. Inoltre, queste linee cellulari immortalizzate mancano della normale architettura critica per la normale funzione β-cellule. Questi due fatti rendono difficile determinare se i risultati ottenuti utilizzando immortalati linee β-cellule terrà vero dura...

Pancreatiche beta-cellule sono le uniche cellule che producono insulina nel corpo e sono fondamentali per mantenere l&#39;omeostasi del glucosio nel sangue. Mentre gli individui sani hanno massa β-cellule sufficienti e la funzione di regolare correttamente il glucosio nel sangue, le persone con diabete sono caratterizzati da massa β-cellule insufficiente e / o la funzione 1,2. E &#39;stato proposto che induce la proliferazione delle cellule β-in ultima analisi può aumentare la massa β-cellulare e ripristinare l&#39;omeostasi del glucosio nei soggetti con diabete 3. Tuttavia, la valutazione e la validazione di potenziali composti proliferative β-cellule in isolotti intatto è necessario, prima di terapie efficaci possono essere sviluppate. Il trapianto di isole umane cadavere in individui con diabete di ripristinare l&#39;omeostasi del glucosio nel sangue per un certo tempo, ma la disponibilità e il successo di questa procedura sperimentale è ostacolato da una carenza di isole umane disponibili per il trapianto e la morte delle cellule beta nelle isole di poppaER trapianto 4. Anche con la scoperta di fattori che inducono la moltiplicazione delle cellule che producono insulina, una sfida importante esiste ancora nella realizzazione di questi fattori per siti rilevanti in vivo. Una strategia per la consegna locale sostenuto di composti proliferative β-cellule è il poli (lattico-co-glicolico) Acido (PLGA). PLGA ha una storia di uso in prodotti approvati dalla FDA di consegna della droga a causa della sua elevata sicurezza, biodegradabilità, e cinetica di rilascio prolungato 5. In particolare, PLGA è un copolimero di lattide e glicolide che degrada per idrolisi con acqua in vivo o in coltura in acido lattico e acido glicolico, che sono naturalmente presenti metaboliti nel corpo. Il composto farmaco incapsulato può essere rilasciato nell&#39;ambiente circostante sia diffusione e / o meccanismi di rilascio di degradazione controllata. Incapsulamento di COI fornisce protezione contro la degradazione enzimatica, migliorando la biodisponibilità del reagente rispetto a unencapsulaTed COI 5. Si consiglia di microsfere di PLGA può essere utilizzato per amministrare composti candidati a isolotti intatti nella cultura, e in ultima analisi in vivo. Testare l&#39;efficacia di PLGA per amministrare mitogeni β-cellule di isolotti ex vivo è fondamentale prima di protocolli di trapianto sono esplorate. Attualmente, non esiste una tecnica per misurare la proliferazione β-cellule di animali vivi. Gli esperimenti per valutare l&#39;efficacia di potenziali composti proliferative in vivo quindi richiedere la somministrazione di questi composti per animali vivi, con successiva dissezione e lavorazione di pancreas per immunomarcatura. Tali protocolli sono costosi e laboriosi e richiedono il composto deve essere somministrato per via sistemica, senza alcuna garanzia che raggiungeranno gli isolotti. Viceversa, diverse linee β-cellulari immortalizzate sono disponibili per lo studio delle cellule che producono insulina in coltura, ma queste linee cellulari mancano l&#39;architettura isolotto e environment trovato negli organismi viventi 6. Linee β-cellulari immortalizzate sono anche caratterizzati come aventi un più alto grado di replicazione di endogene beta cellule in vivo, complicando l&#39;analisi di composti che inducono la proliferazione così. In questo studio, si descrive un protocollo che utilizza isolotti intatti isolati da topi adulti. A differenza di linee di β-cellule, isolotti intatti conservano normale architettura isolotto. Allo stesso modo, a differenza di esperimenti condotti in vivo, il funzionamento composti proliferative direttamente isolotti intatti coltura riduce significativamente la quantità di reagenti che è necessario misurare con precisione la proliferazione β-cellule. L&#39;attuale studio utilizza PLGA per amministrare un COI, in questo esempio, fattore ricombinante umano del tessuto connettivo della crescita (rhCTGF). Il metodo qui descritto conferisce un vantaggio significativo rispetto la somministrazione del composto grezzo di isolotti coltivate in quanto consente un rilascio continuo di composto in the media. In particolare, questo dosaggio può essere modificato per gestire un&#39;ampia varietà di proteine ​​e anticorpi di interesse per isolette intatte. Effetti su altri tipi di cellule endocrine, tra cui alfa-cellule, possono anche essere analizzati.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 Acido carbossilico, estere succinimidilico, isomero 6</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>Per l'etichettatura del COI con fluoroforo</td></tr><tr><td>DMSO Dimetil solfossido</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Per la dissoluzione del fluoroforo nella fase 1</td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione PD-10 monouso</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Colonna di desalinizzazione utilizzata nella fase 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, Poli(D,L-lattide-co-glicolide), terminato con estere, peso molecolare 54.000 - 69.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Utilizzato nella generazione di microsfere nella fase 2</td></tr><tr><td>Peso molecolare del poli(alcol vinilico) 89.000 - 98.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Utilizzato nella generazione di microsfere nella fase 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>Per la coltura di isole</td></tr><tr><td>Destrosio anidro</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Integratore per terreni insulari</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antibiotici per terreni insulari</td></tr><tr><td>Siero di cavallo normale</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Supplemento per terreni insulari</td></tr><tr><td>Piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Per la coltura di isole</td></tr><tr><td>Glico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'acido tetraacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Integratore per terreni insulari pre-saggio</td></tr><tr><td>Citocentrifuga Cytospin 4</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>Per la rotazione di cellule su vetrini da microscopio</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>Per la rotazione di cellule su vetrini da microscopio</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Utilizzato nella dissociazione delle isole</td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Per il fissaggio delle cellule</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>Per la permeabilizzazione delle cellule</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Reagenti bloccanti per l'immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Ki67</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>Per l'immunofluorescenza Ki67</td></tr><tr><td>Cavia policlonale Anti-insulina</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>Per l'immunofluorescenza dell'insulina</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Asino Anti-Coniglio</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Per l'immunofluorescenza Ki67</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>Per l'immunofluorescenza dell'insulina</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Per la visualizzazione dei nuclei in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Mezzi di montaggio ad asciugatura rapida</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &deg; C 4,5 Litri Cascade Banco Liofilizzazione</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>Per la liofilizzazione di microsfere</td></tr></tbody></table>

amministrazione sostenuta di mitogeni β-cellule per intact isole di topo<em&gt; ex vivo</em&gt; uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) microsfere

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Lo sviluppo di biomateriali ha aumentato significativamente il potenziale per la consegna mirato di farmaci ad una varietà di tipi di cellule e tessuti, incluse le cellule beta del pancreas. Inoltre, biomateriale particelle, idrogel, e ponteggi offrono anche l&#39;opportunità unica di amministrare sostenuta, controllabile somministrazione di farmaci ai beta-cellule in coltura e nei modelli di tessuto trapiantato. Queste tecnologie permettono lo studio dei fattori di proliferazione candidato β-cellule utilizzando isolotti intatti e un sistema di traslazione rilevante. Inoltre, determinare l&#39;efficacia e la fattibilità di fattori candidati per stimolare la proliferazione delle cellule β-in un sistema di coltura è fondamentale prima di andare avanti a modelli in vivo. Qui, si descrive un metodo di co-coltura isole di topo intatte con composti biodegradabili di interesse (COI) poli MOLLA (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) microsfere al fine di valutare gli effetti della sostenuta in situ rilascio ofattori mitogeni F sulla proliferazione β-cellule. Questa tecnica viene descritto in dettaglio come generare microsfere di PLGA contenenti un carico desiderato utilizzando reagenti commercialmente disponibili. Mentre la tecnica descritta utilizza fattore ricombinante umano connettivo crescita tissutale (rhCTGF), come esempio, potrebbe essere facilmente utilizzata un&#39;ampia varietà di COI. Inoltre, questo metodo utilizza piastre a 96 pozzetti per minimizzare la quantità di reagenti necessarie per valutare la proliferazione β-cellule. Questo protocollo può essere facilmente adattato per usare biomateriali differenti e altre caratteristiche cellulari endocrine come la sopravvivenza delle cellule e lo stato di differenziazione.

La figura 1 è una rappresentazione visiva delle microsfere generate utilizzando il protocollo di cui sopra. Il protocollo qui descritto produce microsfere rhCTGF-caricati di varie dimensioni. La frazione più grande di microsfere sarà compreso tra 1 e 10 micron di diametro, anche se alcune microsfere possono essere più grandi (Figura 2). Se lo si desidera, dimensioni microsfere può essere sintonizzato ed ottimizzato sulla base di parametr...

Qui, presentiamo la metodologia per generare e somministrare composti di microsfere di acido poli(lattico-co-glicolico) caricate con interessi (PLGA) a isole di topo intatte in coltura con successiva analisi di immunofluorescenza della proliferazione delle cellule β. Questo metodo è adatto per determinare l'efficacia dei mitogeni a cellule β candidate.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare microsfere di acido polilattico-co-glicolico (PLGA) per somministrare composti di interesse a isolotti pancreatici interi coltivati, al fine di studiare gli effetti di singoli composti sulla proliferazione delle cellule beta pancreatiche adulte. Questo metodo può essere impiegato per testare una varietà di composti somministrati localmente in modo a rilascio prolungato agli isolotti interi. Il principale vantaggio di questo metodo è che può essere facilmente adattato a diversi biomateriali per la somministrazione, composti di interesse e saggi finali.Questo metodo ha anche il potenziale di consegnare composti di interesse in concomitanza con il trapianto di isolotti in vivo. A mostrare come preparare le microsfere di PLGA sarà Taylor Kavanaugh, lo studente laureando del mio laboratorio. Iniziare aggiungendo un milligrammo del composto di interesse marcatore fluorescente a 100 microlitri di acqua deionizzata per formare la prima fase acquosa.Successivamente, sciogliere 65 milligrammi di PLGA in 750 microlitri di diclorometano in un vial per scintillazione ed esporre la miscela ad ultrasuoni per 10-30 secondi a 160 watt per sciogliere completamente il PLGA. Questo costituisce la fase oleosa. Aggiungere tutta la prima fase acquosa alla fase oleosa in maniera goccia a goccia.Quindi, utilizzare un omogeneizzatore portatile per emulsionare la soluzione a 20.000 giri al minuto per 30 secondi, formando la prima fase acqua-olio. Successivamente, aggiungere tutta la prima fase acqua-olio goccia a goccia in 15 millilitri di soluzione di PVA all'1% ed emulsionare come appena illustrato. Successivamente, trasferire l'intero volume dell'emulsione in un pallone rotondo da 200 millilitri ed utilizzare un evaporatore rotante per rimuovere il solvente, generando così la fase acquosa sotto vuoto di 635 millimetri di mercurio per un'ora.Aliquotare un millilitro della fase acquosa in ciascuna di 14 provette per microcentrifuga e pellettizzare i microsfera mediante centrifugazione. Al termine della centrifugazione, utilizzare una micropipetta per rimuovere 900 microlitri di soluzione acquosa da ciascuna provetta, avendo cura di non disturbare i pellet. Lavare i microsfera con un millilitro di acqua deionizzata, seguito dalla rimozione accurata di 900 microlitri del soprannatante.Quindi aggiungere 900 microlitri di acqua deionizzata ai restanti 100 microlitri dei soprannatanti. Successivamente, vortexare brevemente e sottoporre a sonica per risospendere i pellet. Dopo aver isolato gli isolotti dagli animali sperimentali di interesse, seminare 40 isolotti con dimensioni visivamente corrispondenti in un pozzetto di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti, in 200 microlitri di mezzo di coltura per isolotti.La mattina successiva, risospendere un'aliquote di microsfere nel mezzo pre-essai, in modo che la concentrazione finale del composto di interesse nel tubo sia di 10 nanogrammi per microlitro, e sottoporre le microsfere a sonificazione in un bagno di ghiaccio e acqua per 10 minuti a 160 watt con impulsi della durata di 10 secondi a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere con attenzione 100 microlitri di mezzo di coltura degli isolotti da ogni pozzetto senza staccare gli isolotti, e incubare le colture con 100 microlitri di mezzo d'assay contenente le microsfere. Dopo tre giorni, scartare con cura il mezzo d'assay da tutti i pozzetti senza disturbare gli isolotti e lavare delicatamente gli isolotti due volte con 200 microlitri di PBS.Le isole aderiscono in modo solo leggero a una piastra a 96 pozzetti. Pertanto, è fondamentale rimuovere con delicatezza il mezzo e il PBS da ciascun pozzetto per evitare che le isole vengano accidentalmente smosse e scartate. Dopo il secondo lavaggio, immergere delicatamente le isole in 100 microlitri di soluzione di tripsina-EDTA per tre minuti a temperatura ambiente, eseguendo una pipettatura delicata dopo due minuti.Trasferire l'intero volume di ogni pozzetto in provette microcentrifuga individuali e aggiungere 400 microlitri di mezzo di coltura per gli isolotti in ciascuna provetta per arrestare la dissociazione. Dopo aver raccolto gli isolotti trattati con microsfera mediante centrifugazione, utilizzare una micropipetta per rimuovere delicatamente i soprannatanti e risospendere i pellet in 200 microlitri di mezzo di coltura per isolotti fresco. Successivamente, centrifugare gli isolotti dissociati su vetrini carichi utilizzando un citocentrifugo.Dopo l'essiccazione all'aria, disegnare una scatola attorno agli isolotti utilizzando una penna marcante idrofobica e fissare le cellule in 75 microlitri di paraformaldeide al quattro percento a temperatura ambiente per 10 minuti, seguiti da due lavaggi con 75 microlitri di PBS. Dopo il secondo lavaggio, permeabilizzare le cellule con 75 microlitri di Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 10 minuti, seguiti da un lavaggio finale con 75 microlitri di PBS. Per l'immunomarcatura degli isolotti, iniziare posizionando i vetrini con il lato delle cellule rivolto verso l'alto in una camera umida ed eliminare il PBS.Successivamente, bloccare il legame non specifico con 75 microlitri di siero di asino normale a temperatura ambiente. Dopo un'ora, sostituire il siero con 75 microlitri dell'anticorpo primario di interesse per un'ulteriore ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aspirare con attenzione la soluzione dell'anticorpo primario e lavare i campioni con lavaggi di PBS da 375 microlitri.Quindi incubare le isole con 75 microlitri dell'anticorpo secondario marcato con immunofluorescenza appropriato per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente, protette dalla luce. Al termine dell'incubazione, sostituire la soluzione di anticorpo secondario con 75 microlitri di Dappy per tre minuti, seguiti da un risciacquo di cinque minuti in acqua deionizzata. Al termine del lavaggio, depositare una goccia di 100 microlitri di soluzione di montaggio a rapida essiccazione contenente un reagente anti-sbiadimento su un coprioggetto di vetro e capovolgere un vetrino, con il lato del campione rivolto verso il basso, sulla soluzione di montaggio.La frazione più grande di microsfere avrà un diametro compreso tra 1 e 10 micron, anche se alcune microsfere possono essere più grandi. Dopo la dispersione delle isolotti trattati con microsfere di PLGA integre e il successivo immunomarcataggio, è comune osservare aree del campione prive di qualsiasi marcatura tra le cellule, causate da microsfere integre che non sono state completamente rimosse durante i passaggi di lavaggio. Dopo l'acquisizione delle immagini, la percentuale di cellule positive a Ki67 e all'insulina può essere quantificata mediante analisi dell'immagine con software oppure contando manualmente il numero totale di cellule marcate.Il trattamento delle olociti intatte con microsfere di PLGA di fattore di crescita del tessuto connettivo umano ricombinante per tre giorni, come appena descritto, determina un aumento della proliferazione delle cellule beta, dimostrando che la proteina non perde alcuna funzionalità durante la generazione delle microsfere. Una volta padroneggiata, questa tecnica può produrre risultati in meno di una settimana se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che l'impatto sulla proliferazione delle cellule beta nel proprio esperimento varierà a seconda del composto di interesse e della cinetica di rilascio esatta delle microsfere generate.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la cotrapianto di microsfere cariche di composti insieme a isolotti pancreatici integri, per affrontare altre domande scientifiche, ad esempio se il composto di interesse possa indurre la proliferazione delle cellule beta in vivo. Il PLGA ha una lunga storia di utilizzo in dispositivi e sistemi di somministrazione di farmaci approvati dalla FDA, rappresentando quindi una scelta adeguata per ricercatori e clinici che desiderino consegnare un carico terapeutico a tessuti specifici per un periodo prolungato. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come generare microsfere di PLGA cariche di composti e somministrarle a isolotti integri in coltura.Non dimenticare che lavorare con il paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare l'equipaggiamento di protezione personale appropriato, durante l'esecuzione di questa procedura.

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Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Questo protocollo dimostra l'isolamento delle isole murine e la semina su un impalcatura decellulare. Isole supportate da ponteggi sono state trapiantate nel pad di grasso epididimo di topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ). Isole sopravvissute al sito di trapianto e invertite la condizione iperglicemica.

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

È stato introdotto un metodo per il trapianto omentale di isolotti in un mouse. Gli isolotti isolati sono mescolati con idrogel e la miscela viene inserita nel sacchetto omentale di un topo diabetico. Quindi, il glucosio nel sangue è controllato e viene eseguita l'analisi immuno-istochimica.

Un metodo per il trapianto dell'isolotto al omento in Mouse

Trapianto di isole pancreatiche è un modo per raggiungere normoglycemia in diabete di tipo 1. Questo articolo si concentra sulla tecnica di trapianto attraverso il percorso intraportal per mantenere i livelli normali del glucosio nei topi diabetici.

Intraportal trapianto di isole pancreatiche nel modello del topo

Qui, presentiamo un protocollo per la convalida in vivo della terapia cellulare basata su idrogel, illustrata dall'esempio del trapianto di insule pancreatiche. h-omentale isolotto di Matrix (hOMING) l'impianto di riempimento permette l'impianto di una miscela di cella-idrogel tra gli strati omentale, vicino ai vasi sanguigni, per massimizzare l'attecchimento in un ambiente metabolico adeguato.

Utilizzo di trapianto dell'isolotto intra-omentale di riempimento Matrix isolotto h-omentale (hOMING)

In questo protocollo, viene descritto un metodo di isolamento murine ilet e trapianto nel tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale. Le isole di murine singeniche isolate vengono trapiantate in un recipiente murino utilizzando un idrogel di membrana sotterranea. Viene monitorato il livello di glucosio nel sangue dei destinatari e viene eseguita l'analisi istologia degli innesti di islet.

Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)

Qui presentiamo procedure chirurgiche raffinate sull'esecuzione con successo del trapianto intraportale di isole, una procedura chirurgica clinicamente rilevante ma tecnicamente impegnativa, nei topi.

Ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Forniamo un protocollo minimamente invasivo per il trapianto intramuscolare di isolotti di cellule staminali pancreatiche derivate da cellule staminali umane in topi immunodeficienti per l'impianto in vivo e l'analisi a valle.

Trapianto intramuscolare di cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane nei topi

Scopri come utilizzare microsfere di PLGA per la somministrazione sostenuta di composti a isole pancreatiche intatte di topo, studiando la proliferazione delle cellule beta. Questo metodo versatile supporta la ricerca sul diabete.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo Ex Vivo Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere (Video) | JoVE Journal

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo

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