Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare microsfere di acido polilattico-co-glicolico (PLGA) per somministrare composti di interesse a isolotti pancreatici interi coltivati, al fine di studiare gli effetti di singoli composti sulla proliferazione delle cellule beta pancreatiche adulte. Questo metodo può essere impiegato per testare una varietà di composti somministrati localmente in modo a rilascio prolungato agli isolotti interi. Il principale vantaggio di questo metodo è che può essere facilmente adattato a diversi biomateriali per la somministrazione, composti di interesse e saggi finali.

Questo metodo ha anche il potenziale di consegnare composti di interesse in concomitanza con il trapianto di isolotti in vivo. A mostrare come preparare le microsfere di PLGA sarà Taylor Kavanaugh, lo studente laureando del mio laboratorio. Iniziare aggiungendo un milligrammo del composto di interesse marcatore fluorescente a 100 microlitri di acqua deionizzata per formare la prima fase acquosa.

Successivamente, sciogliere 65 milligrammi di PLGA in 750 microlitri di diclorometano in un vial per scintillazione ed esporre la miscela ad ultrasuoni per 10-30 secondi a 160 watt per sciogliere completamente il PLGA. Questo costituisce la fase oleosa. Aggiungere tutta la prima fase acquosa alla fase oleosa in maniera goccia a goccia.

Quindi, utilizzare un omogeneizzatore portatile per emulsionare la soluzione a 20.000 giri al minuto per 30 secondi, formando la prima fase acqua-olio. Successivamente, aggiungere tutta la prima fase acqua-olio goccia a goccia in 15 millilitri di soluzione di PVA all'1% ed emulsionare come appena illustrato. Successivamente, trasferire l'intero volume dell'emulsione in un pallone rotondo da 200 millilitri ed utilizzare un evaporatore rotante per rimuovere il solvente, generando così la fase acquosa sotto vuoto di 635 millimetri di mercurio per un'ora.

Aliquotare un millilitro della fase acquosa in ciascuna di 14 provette per microcentrifuga e pellettizzare i microsfera mediante centrifugazione. Al termine della centrifugazione, utilizzare una micropipetta per rimuovere 900 microlitri di soluzione acquosa da ciascuna provetta, avendo cura di non disturbare i pellet. Lavare i microsfera con un millilitro di acqua deionizzata, seguito dalla rimozione accurata di 900 microlitri del soprannatante.

Quindi aggiungere 900 microlitri di acqua deionizzata ai restanti 100 microlitri dei soprannatanti. Successivamente, vortexare brevemente e sottoporre a sonica per risospendere i pellet. Dopo aver isolato gli isolotti dagli animali sperimentali di interesse, seminare 40 isolotti con dimensioni visivamente corrispondenti in un pozzetto di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti, in 200 microlitri di mezzo di coltura per isolotti.

La mattina successiva, risospendere un'aliquote di microsfere nel mezzo pre-essai, in modo che la concentrazione finale del composto di interesse nel tubo sia di 10 nanogrammi per microlitro, e sottoporre le microsfere a sonificazione in un bagno di ghiaccio e acqua per 10 minuti a 160 watt con impulsi della durata di 10 secondi a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere con attenzione 100 microlitri di mezzo di coltura degli isolotti da ogni pozzetto senza staccare gli isolotti, e incubare le colture con 100 microlitri di mezzo d'assay contenente le microsfere. Dopo tre giorni, scartare con cura il mezzo d'assay da tutti i pozzetti senza disturbare gli isolotti e lavare delicatamente gli isolotti due volte con 200 microlitri di PBS.

Le isole aderiscono in modo solo leggero a una piastra a 96 pozzetti. Pertanto, è fondamentale rimuovere con delicatezza il mezzo e il PBS da ciascun pozzetto per evitare che le isole vengano accidentalmente smosse e scartate. Dopo il secondo lavaggio, immergere delicatamente le isole in 100 microlitri di soluzione di tripsina-EDTA per tre minuti a temperatura ambiente, eseguendo una pipettatura delicata dopo due minuti.

Trasferire l'intero volume di ogni pozzetto in provette microcentrifuga individuali e aggiungere 400 microlitri di mezzo di coltura per gli isolotti in ciascuna provetta per arrestare la dissociazione. Dopo aver raccolto gli isolotti trattati con microsfera mediante centrifugazione, utilizzare una micropipetta per rimuovere delicatamente i soprannatanti e risospendere i pellet in 200 microlitri di mezzo di coltura per isolotti fresco. Successivamente, centrifugare gli isolotti dissociati su vetrini carichi utilizzando un citocentrifugo.

Dopo l'essiccazione all'aria, disegnare una scatola attorno agli isolotti utilizzando una penna marcante idrofobica e fissare le cellule in 75 microlitri di paraformaldeide al quattro percento a temperatura ambiente per 10 minuti, seguiti da due lavaggi con 75 microlitri di PBS. Dopo il secondo lavaggio, permeabilizzare le cellule con 75 microlitri di Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 10 minuti, seguiti da un lavaggio finale con 75 microlitri di PBS. Per l'immunomarcatura degli isolotti, iniziare posizionando i vetrini con il lato delle cellule rivolto verso l'alto in una camera umida ed eliminare il PBS.

Successivamente, bloccare il legame non specifico con 75 microlitri di siero di asino normale a temperatura ambiente. Dopo un'ora, sostituire il siero con 75 microlitri dell'anticorpo primario di interesse per un'ulteriore ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aspirare con attenzione la soluzione dell'anticorpo primario e lavare i campioni con lavaggi di PBS da 375 microlitri.

Quindi incubare le isole con 75 microlitri dell'anticorpo secondario marcato con immunofluorescenza appropriato per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente, protette dalla luce. Al termine dell'incubazione, sostituire la soluzione di anticorpo secondario con 75 microlitri di Dappy per tre minuti, seguiti da un risciacquo di cinque minuti in acqua deionizzata. Al termine del lavaggio, depositare una goccia di 100 microlitri di soluzione di montaggio a rapida essiccazione contenente un reagente anti-sbiadimento su un coprioggetto di vetro e capovolgere un vetrino, con il lato del campione rivolto verso il basso, sulla soluzione di montaggio.

La frazione più grande di microsfere avrà un diametro compreso tra 1 e 10 micron, anche se alcune microsfere possono essere più grandi. Dopo la dispersione delle isolotti trattati con microsfere di PLGA integre e il successivo immunomarcataggio, è comune osservare aree del campione prive di qualsiasi marcatura tra le cellule, causate da microsfere integre che non sono state completamente rimosse durante i passaggi di lavaggio. Dopo l'acquisizione delle immagini, la percentuale di cellule positive a Ki67 e all'insulina può essere quantificata mediante analisi dell'immagine con software oppure contando manualmente il numero totale di cellule marcate.

Il trattamento delle olociti intatte con microsfere di PLGA di fattore di crescita del tessuto connettivo umano ricombinante per tre giorni, come appena descritto, determina un aumento della proliferazione delle cellule beta, dimostrando che la proteina non perde alcuna funzionalità durante la generazione delle microsfere. Una volta padroneggiata, questa tecnica può produrre risultati in meno di una settimana se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che l'impatto sulla proliferazione delle cellule beta nel proprio esperimento varierà a seconda del composto di interesse e della cinetica di rilascio esatta delle microsfere generate.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la cotrapianto di microsfere cariche di composti insieme a isolotti pancreatici integri, per affrontare altre domande scientifiche, ad esempio se il composto di interesse possa indurre la proliferazione delle cellule beta in vivo. Il PLGA ha una lunga storia di utilizzo in dispositivi e sistemi di somministrazione di farmaci approvati dalla FDA, rappresentando quindi una scelta adeguata per ricercatori e clinici che desiderino consegnare un carico terapeutico a tessuti specifici per un periodo prolungato. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come generare microsfere di PLGA cariche di composti e somministrarle a isolotti integri in coltura.

Non dimenticare che lavorare con il paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare l'equipaggiamento di protezione personale appropriato, durante l'esecuzione di questa procedura.