Name: Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso Drosophila ovociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Impara a preparare ovociti di Drosophila per l'imaging della meiosi I. Questo metodo consente la visualizzazione dell'assemblaggio del fuso e dell'orientamento cromosomico tramite immunofluorescenza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Christian Lehner per aver fornito l'anticorpo CENP-C e Eric Joyce per le raccomandazioni sulla FISH. Il lavoro nel laboratorio McKim è stato finanziato da una sovvenzione del NIH (GM101955).

Nota: Le procedure sono eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato. incubatori a temperatura controllata sono utilizzati per mantenere temperature per volare allevamento e attraversa se non diversamente specificato. 1. preparati <ol><li> Preparare mosche. <ol><li> Prometafase arricchito collezioni ovocita. <ol><li> Cancella adulto vola da sani, giovani stock o trasversali culture. bottiglie di età per due giorni a 25 ° C. NOTA: Generalmente due bottiglie sani sarà sufficiente, anche se più può essere necessaria per alcune culture trasversali. </li><li> Dopo due giorni, raccogliere ~ 100 a 300 femmine (che vanno da 0 a 2 giorni di età, a questo punto) dalle bottiglie. Le femmine non hanno bisogno di essere vergini. Aggiungere una piccola quantità di pasta di lievito al lato di una fiala e inserire 30 femmine e 10 a 15 maschi ciascuno nelle fiale yeasted. fiale di età per due giorni a 25 ° C. </li></ol></li><li> Metafase-arricchito ovociti Collezioni. <ol><li> Raccogliere ~ 100 a 300 femmine a magazzino o cross cultures. Aggiungere una piccola quantità di pasta di lievito al lato di una fiala e posizionare 30 femmine ogni (senza maschi aggiunti) nelle fiale yeasted. fiale di età per tre-cinque giorni a 25 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Preparare soluzioni. Nota: Le soluzioni possono essere conservate indefinitamente a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. <ol><li> Preparare Modified Buffer di Robb (5x): 500 mM HEPES, 500 mM di saccarosio, 275 mM acetato di sodio, acetato di potassio 200 mM, 50 mM di glucosio, 6 mM cloruro di magnesio, cloruro di calcio e 5 mM. Utilizzare 10 N 11: 8 idrossido di sodio: idrossido di potassio per portare il pH a 7,4. Sterilizzare per filtrazione; Non sterilizzare in autoclave. Conservare a -20 ° C. Scongelare come necessario per preparare ~ 200 ml di 1x Robb per ovocita prep. </li><li> Soluzioni fissazione. <ol><li> Opzione # 1: Preparare la formaldeide / fissazione eptano. Preparare Fixation Buffer: soluzione salina 1x tampone fosfato (PBS) più 150 mM saccarosio. Per utilizzare, rendere fresco con 687,5 ml Fixation Buffer e 312,5 ml 16% di formaldeideper ovocita prep. ATTENZIONE: Indossare guanti durante l&#39;utilizzo di soluzioni di formaldeide in una cappa aspirante. Smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali. </li><li> Opzione # 2: Preparare la formaldeide / fissazione cacodilato. Preparare Mix Fix: 250 mm saccarosio, 100 mM acetato di potassio (pH 7,5), 25 mM di sodio acetato (pH 7,0), e 25 mM EGTA (pH 8,0). Per utilizzare, fare fresco con 400 ml Fix Mix, 100 cacodilato ml di potassio (1 M, pH 7,2), e 500 microlitri di formaldeide al 16% per ovocita prep. ATTENZIONE: cacodilato potassio contiene arsenico. </li></ol></li><li> Preparare PBS / Triton X-100: 1x PBS + 1% o 0,05% Triton X-100. Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w / v), e 0,1% Tween-20. Può essere conservato a 4 ° C per una settimana. </li><li> Ibridazione in situ fluorescente (FISH) Solutions. <ol><li> Preparare 20X Sodio cloruro-sodio citrato (SSC): 3 M di cloruro di sodio e 0,3 M di sodio citrato. </li><li> Preparare 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC più 0,1% di Tween-20. Fare freschi, ~ 20 ml per ovocita prep. </li><li> Preparare soluzioni formammide: 2x SSC, 0,1% Tween-20, più formammide. Fare fresco, 1 ml 20% formammide, 0,5 ml 40% formammide, e 2 ml di 50% formammide per ovocita prep. ATTENZIONE: Indossare guanti durante l&#39;utilizzo di soluzioni formammide in una cappa aspirante. Smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali. </li><li> Preparare la soluzione di ibridazione: 2x SSC, 50% formammide, e il 10% di solfato di destrano (w / v). Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Sonde pesce. <ol><li> Ordine oligonucleotidi (vedi Tabella 1 per le sequenze) con la purificazione HPLC e desiderato 5 modifica &#39;fluorescente (per esempio, Cy3 o Cy5). Risospendere in Tris-EDTA (TE) a 50 ng / ml. NOTA: Proteggere oligonucleotidi da esposizione alla luce in ogni momento. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Raccolta di ritardo-fase di Drosophila ovociti <ol><li> Come <em&gt; ovociti Drosophila con membrane intatte si attacca alla plastica e vetro, pre-rivestire l&#39;interno di un tubo 5 ml e una pipetta Pasteur per ovocita preparazione con PTB. </li><li> Anestetizzare tutti ~ 100 a 300 mosche yeasted con anidride carbonica e aggiungere ad un frullatore contenente ~ 100 ml di 1x tampone di Robb. Pulse tre volte (~ 1 sec ciascuno). Mantenere gli ovociti in Robb di per &lt;20 min per evitare l&#39;attivazione. NOTA: In alternativa, gli ovociti possono essere sezionati a mano dalle femmine. Il vantaggio di questo metodo è che richiede meno femmine. Tuttavia, la cura deve essere presa per limitare l&#39;esposizione al biossido di carbonio a solo pochi minuti per evitare artefatti associata con ipossia 7. </li><li> Filtrare maglie larghe (~ 1.500 micron) in 250 ml bicchiere per rimuovere grandi parti del corpo. Se molti addomi intatte rimangono ancora sul materiale della maglia, ri-macinare con ulteriore buffer di Robb, e filtro. Lasciare riposare ~ 2 min, poi aspirare al largo strato superiore, eliminando come molti dei grandi parti del corpo il più possibile. </li><li> Filtro attraverso piccoli mesh (~ 300 micron) in un becher da 250 ml. Risciacquare rimanenti ovociti su primo bicchiere usando aggiuntivo di Robb e rivestito Pasteur pipetta. Lasciare riposare ~ 3 min; ovociti si depositerà fuori. Aspirare fuori tutti ma ~ 10 ml. </li><li> Versare la maggior quantità di 10 ml, come si inserisce nel tubo rivestito da 5 ml. Lasciare riposare, rimuovere il liquido, e ripetere con resto. Risciacquare ovociti rimanenti di coppa con ulteriore Pasteur pipetta di Robb e rivestito. Lasciate stabilirsi in 5 ml di tubo per ~ 3-5 minuti. </li></ol> 3. Trattamenti farmacologici (Opzionale) <ol><li> Coat un secondo tubo 5 ml con PTB per ogni preparazione ovocita. Aggiungere solvente appropriato (controllo) o farmaco per 1 ml di Robb ciascuno per ogni prep ovocita (Tabella 2). </li><li> ovociti diviso in seconda rivestito tubo 5 ml. Lasciare riposare, rimuovere il liquido e aggiungere 1 ml di Robb più solventi in un tubo e 1 ml di Robb più farmaco nel secondo tubo. Nutate un&#39;adeguata quantità di tempo per il trattamento farmacologico (Tabella 2). Let stabilirsi. </li></ol> 4. Fissazione <ol><li> Aspirare fuori tutto il liquido e subito aggiungere 1 ml Fix. </li><li> Opzione # 1: Formaldeide / eptano fissazione (fissazione Buffer più 5% di formaldeide). <ol><li> Fix per 2,5 minuti su un nutator. Aggiungere 1 ml di eptano e vortex 1 min. Lasciare riposare ~ 1 min. </li><li> Rimuovere tutto il liquido, e quindi aggiungere 1 ml di PBS 1x. Vortex 30 sec. Lasciare riposare ~ 1 min. </li><li> Rimuovere tutto il liquido, e quindi riempire il tubo con PBS 1x. NOTA: Gli oociti possono essere utilizzati immediatamente o conservare sul nutator per diverse ore a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Opzione # 2: la fissazione Formaldeide / cacodilato (Fix Mix più 8% di formaldeide e 100 mm cacodilato). <ol><li> Fix per 6 minuti su un nutator. Lasciare riposare 2 minuti. Rimuovere il liquido, e quindi riempire il tubo con PBS 1x. NOTA: Gli oociti possono essere utilizzati immediatamente o conservare sul nutator per diverse ore a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 5. Rimozione Membrane ( &quot;Rolling&quot;) <ol><li> Utilizzando rivestito pipetta Pasteur, aggiungere ~ 500 a 1.000 ovociti alla parte (sabbiato) smerigliato di un vetrino. Rimuovere tutte le parti del corpo e dei materiali con pinze estranei. Non lasciate che gli ovociti asciugare; aggiungere 1x PBS come necessario. </li><li> Posizionare un vetrino in cima degli ovociti e delicatamente ovociti &quot;Roll&quot;, fino tutte le membrane vengono rimossi (trascinando il bordo del vetrino attraverso gli ovociti funziona meglio.) Controllare periodicamente i progressi sotto il microscopio, l&#39;aggiunta più 1x PBS, se necessario. Fare attenzione a come troppa pressione distruggerà gli ovociti. NOTA: Per immunofluorescenza solo continuare con il passo 6. Per il pesce (con o senza immunofluorescenza), passare al punto 7. </li></ol> 6. Anticorpo colorazione di Drosophila ovociti <ol><li> Estrazione e Blocco <ol><li> Risciacquare ovociti arrotolato in un tubo da 15 ml contenente ~ 15 ml di PBS / 1% Triton X-100. ovociti Nutate in questa soluzione per non meno di 1,5 ore e non più di 2 ore.Questo passaggio consente la penetrazione degli anticorpi. </li><li> Lasciate ovociti stabilirsi ~ 2 min. Rimuovere il liquido insieme con il maggior numero possibile di membrane, quindi aggiungere PBS / 0,05% Triton X-100. NOTA: Le membrane si depositerà più lento di ovociti laminati. </li><li> Lasciate ovociti depositano ~ 2 minuti, quindi rimuovere tutti tranne ~ 1 ml di liquido. ovociti Trasferire graduato da 1,5 ml di tubo e rimuovere il liquido restante. Aggiungere 1 ml PTB per il blocco e nutate per 1 ora. </li></ol></li><li> colorazione degli anticorpi <ol><li> Pre-assorbimento di anticorpi secondari contro embrioni. NOTA: Questo passaggio elimina la colorazione di fondo da non specifici anticorpi interazioni con le proteine di Drosophila. <ol><li> Raccogliere e risolvere embrioni di Drosophila (~ 25 microlitri) per procedura tipica 8. Conservare in metanolo a -20 ° C. </li><li> Rimuovere metanolo da embrioni, aggiungere 800 ml di metanolo più 200 ml 1x PBS, e nutate per 15 min. Togliere 500 ml di surnatante e sostituire con 500 microlitri PBS 1x. Poi nutate per 15 min. Ripetere due volte (per un totale di ~ 1 ora di lavaggi) e quindi completare in PTB. NOTA: Gli embrioni possono essere utilizzati immediatamente o mantenimento in nutator per diverse ore a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere liquido, riempire con PTB a 200 ml per ovocita di preparazione, e aggiungere anticorpi secondari fluorescenza marcata in opportune diluizioni (tenendo presente che il volume finale sarà di 300 ml;. Vedi punto 7.4) Nutate a 4 ° C per una notte (preferibile) oa temperatura ambiente per 3 a 4 ore. NOTA: Gli anticorpi pre-assorbito saranno utilizzati nel passaggio 6.2.4. NOTA: I campioni al buio per quanto possibile, una volta sono stati aggiunti anticorpi fluorescenti. </li></ol></li><li> Rimuovere il liquido da ovociti, riempire con PTB a 300 ml, e aggiungere anticorpi primari a diluizioni appropriate. Nutate a 4 ° C per una notte (preferibile) oa temperatura ambiente per 3 a 4 ore. </li><li> Lavare ovociti quattro volte per 15 minuti ciascuno con 1 ml PTB. </li><li> Rimuovereliquido da ovociti, aggiungere 200 ml di surnatante da embrioni (pre-assorbito anticorpi secondari). Poi riempire con PTB a 300 ml. Nutate a temperatura ambiente per 3 a 4 ore (preferibile) sia a 4 ° C durante la notte. </li><li> Lavare ovociti una volta per 15 minuti con 1 ml PTB, rimuovere il liquido. Quindi aggiungere 0,5 ml Hoechst 33342 e 500 microlitri PTB e nutate per 7 minuti. </li><li> Lavare ovociti due volte per 15 minuti ciascuno con 1 ml PTB. NOTA: ovociti possono essere montati su una slitta immediatamente o possono essere conservati in PTB a 4 ° C fino al momento imaging. </li></ol></li></ol> 7. FISH (continuare dal punto 5 di cui sopra) <ol><li> Risciacquare ovociti laminati in un tubo da 15 ml contenente 15 ml ~ 2x SSCT. Lasciate ovociti stabilirsi ~ 2 min. Rimuovere tutti ma ~ 0,5 ml di liquido lungo con il maggior numero possibile di membrane. NOTA: Le membrane si depositerà più lento di ovociti laminati. </li><li> Trasferimento ovociti a 0,5 ml di tubo e rimuovere il liquido restante. Successivamente aggiungere e rimuovere 500 microlitri20%, 40%, e 50% formammide soluzioni, oscillante per 10 min in ciascuna soluzione. NOTA: Gli oociti si depositerà più lento con percentuali più elevate di formammide. </li><li> Rimuovere il liquido, quindi aggiungere soluzione formammide 500 microlitri 50%, e nutate a 37 ° C per 1 a 5 ore. NOTA: più lunga incubazione si traducono in una migliore penetrazione della sonda. </li><li> Rimuovere il liquido, lasciando non più di ~ 100 microlitri oociti, e aggiungere la soluzione di ibridazione 36 microlitri più 2 ml di sonda (50 ng / ml) e 2 ml di acqua o 2 microlitri di una sonda 2 nd (Tabella 1). </li><li> Incubare a 91 ° C per 3 min (solo FISH) o 80 ° C per 20 min (FISH più immunofluorescenza), seguita da incubazione in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C durante la notte. NOTA: Questi passaggi possono essere eseguite in un termociclatore. </li><li> Non rimuovere il liquido. Aggiungere 500 microlitri soluzione al 50% formammide e nutate a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Lasciare riposare, rimuovere il liquido, aggiungere la soluzione formammide 500 microlitri 50%, und nutate a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Lasciare riposare, rimuovere il liquido, aggiungere la soluzione formammide 500 microlitri 20%, e nutate a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Eseguire tre lavaggi rapidi in 500 microlitri 2x SSCT (lasciare riposare, eliminare e aggiungere liquido, capovolgere diverse volte, ripetere.) Lasciare riposare, rimuovere il liquido, quindi aggiungere 500 microlitri PTB e nutate per 4 ore. </li></ol> 8. colorazione degli anticorpi dopo la FISH <ol><li> Rimuovere il liquido da ovociti, riempire con PTB a 300 ml e aggiungere 10 ml di anticorpi anti-α-tubulina coniugato con FITC. In alternativa, altri anticorpi possono essere utilizzati, seguendo il protocollo sopra. Nutate a temperatura ambiente per una notte. </li><li> Lavare ovociti una volta per 15 minuti con 500 microlitri PTB, rimuovere il liquido, quindi aggiungere 0,5 ml Hoechst 33342 e 500 microlitri PTB e nutate per 7 minuti. </li><li> Lavare ovociti due volte per 15 minuti ciascuno con 500 microlitri PTB. NOTA: Gli oociti possono essere montati su una slitta immediatamente o possono essere conservati in PTB a 4 ° C fino al momentoimaging. Mantenere ovociti al buio per quanto possibile, una volta sono stati aggiunti anticorpi fluorescenti. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Ripetere Nome </td><td fo:width="1in"> Cromosoma </td><td> Oligo Sequenza * </td></tr><tr><td> 359 </td><td> X </td><td> GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC </td></tr><tr><td> AACAC </td><td> 2 </td><td> AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC </td></tr><tr><td> dodeca </td><td> 3 </td><td> CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT </td></tr><tr><td> 1.686 </td><td> 2 + 3 </td><td> AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG </td></tr><tr><td> AATAT </td><td> 4 (+ Y) </td><td> AATATAATATAATATAATATAATATAATAT </td></tr><tr><td colspan="3"> * 359 sequenza di Eric Joyce, comunicazione personale, altre sequenze di Sullivan et al. 8 </td&gt; </tr></tbody></table> Tabella 1: sonde FISH per Drosophila ripete centromeriche. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Droga </td><td> Solvente </td><td> la concentrazione della </td><td> concentrazione finale </td><td> Tempo di trattamento </td><td> Effetto </td></tr><tr><td> colchicina </td><td> etanolo </td><td> 125 mm </td><td> 150 pM </td><td> 10 min o 30 min </td><td> destabilizzare non cinetocore (10 min) 9 o tutti i microtubuli (30 min) </td></tr><tr><td> paclitaxel </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 minuti </td><td> stabilizzare microtubules </td></tr><tr><td> Binucleine 2 </td><td> DMSO </td><td> 25 mM </td><td> 25 micron </td><td> 20 min </td><td> inibire Aurora B chinasi 10 </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Trattamento farmacologico.

<ol><li>Bridges, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-disjunction+as+proof+of+the+chromosome+theory+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity.</a> Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+assembly+in+Drosophila+females%3A+behavior+of+nonexchange+chromosomes+and+the+effects+of+mutations+in+the+nod+kinesin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein.</a> J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).</li>
<li>Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtubule-destabilizing+kinesin+motor+regulates+spindle+length+and+anchoring+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes.</a> J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86 (1), 135-146 (1996).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gilliland, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+transiently+sequesters+mps1+and+polo+to+collagenase-sensitive+filaments+in+Drosophila+prometaphase+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes.</a> PLoS One. 4 (10), e7544(2009).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+and+End-On+Kinetochore+Attachments+Are+Coordinated+to+Achieve+Bi-orientation+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).</li>
<li>Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleine+2%2C+an+isoform-specific+inhibitor+of+Drosophila+Aurora+B+kinase%2C+provides+insights+into+the+mechanism+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis.</a> ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+gamma-tubulin+in+the+acentriolar+female+meiotic+spindle+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila.</a> EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).</li>
<li>Endow, S. A., Komma, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+dynamics+during+meiosis+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes.</a> J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).</li>
<li>Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthies%2C+HJ+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).</li>
<li>Colombié, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+Incenp+crucial+to+the+assembly+of+the+acentrosomal+metaphase+spindle+in+female+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis.</a> Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Messa in scena Drosophila ovociti Anche se un cariosoma allungata è spesso visto in ovociti prometafase, utilizzando cariosoma forma di distinguere prometafase da ovociti in metafase può essere problematico. Durante prometafase, il cariosoma inizia come una forma rotonda, si allunga, e poi si ritrae ad una forma rotonda come l&#39;ovocita si avvicina l&#39;arresto metafase. Ciò significa che molti ovociti prometafase non hanno un cariosoma allungata. Inoltre, se gli...

Lo studio della meiosi è talvolta descritto come la "genetica della genetica". Questo perché le proprietà fondamentali dell'ereditarietà cromosomica e dell'assortimento indipendente vengono svolte attraverso la segregazione dei cromosomi durante la produzione di gameti. Un'importante dimostrazione della teoria cromosomica dell'ereditarietà venne nel 1916 dal lavoro di Calvin Bridges in Drosophila melanogaster1. Questo e altri studi di genetica classica sulla Drosophila hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione della genetica. L'esame citologico dei cromosomi meiotici negli ovociti di Drosophila, tuttavia, è stato impegnativo. Ciò è dovuto principalmente al fatto che l'immunofluorescenza degli ovociti di Drosophila in fase avanzata, quando il fuso si assembla e i cromosomi sono orientati per la segregazione, è ostacolata dalla presenza di membrane che rendono l'ovocita impenetrabile agli anticorpi.
Nonostante questa sfida, gli ovociti di Drosophila rimangono un modello attraente per lo studio del comportamento cromosomico e dell'assemblaggio del fuso. Ciò è dovuto ai potenti strumenti genetici disponibili in Drosophila, ma anche perché gli ovociti si arrestano nella metafase I, quando i cromosomi sono orientati e il fuso è completamente formato. Ciò facilita la raccolta e l'esame di un gran numero di ovociti in questa importante fase della divisione cellulare. Inoltre, un semplice organismo modello suscettibile di manipolazione genetica per lo studio della segregazione cromosomica degli ovociti può fornire un importante contributo alla nostra comprensione della salute riproduttiva umana. Gli errori nel numero cromosomico sono la principale causa genetica di aborto spontaneo e difetti alla nascita nell'uomo2. La maggior parte di questi errori può essere ricondotta all'ovocita e sono correlati con l'aumento dell'età materna. L'età media delle madri negli Stati Uniti è in aumento, il che lo rende un grave problema di salute pubblica.
Descriviamo qui i metodi per l'esame citologico degli ovociti di Drosophila, inclusa una dimostrazione di come rimuovere le membrane degli ovociti. Questi metodi sono modifiche di protocolli descritti per la prima volta da Theurkauf e Hawley3, Zou et al.4, e Dernburg et al.5. Includiamo anche metodi per l'arricchimento di diversi stadi di ovociti, basati su un protocollo descritto per la prima volta da Gilliland et al.6. Infine, aggiungiamo le istruzioni per il trattamento farmacologico degli ovociti di Drosophila. Insieme, questi metodi consentono l'indagine citologica della segregazione cromosomica degli ovociti e dell'assemblaggio del fuso in Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Tubi conici da 15 ml</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% formaldeide</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>PERICOLOSO; una volta aperto, scartare dopo un mese</td></tr><tr><td>becher da 250 ml</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubi da 5 ml</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lieviti attivi secchi</td><td>Vari</td><td></td><td>miscelare con acqua per ottenere una pasta della consistenza del burro di arachidi</td></tr><tr><td>anticorpo anti-alfa--tubulina coniugato al clone FITC</td><td>Sigma</td><td>F2168</td><td>DM1A</td></tr><tr><td>Binucleina 2</td><td>Sigma</td><td>B1186</td><td>PERICOLOSO</td></tr><tr><td>frullatore</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siero bovino albumina</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio Vari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>colchicina</td><td>Sigma</td><td>C-9754</td><td></td></tr><tr><td>PERICOLOSO vetrini coprioggetti</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>No. 1 1/2</td></tr><tr><td>destrano solfato</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Etanolo vario</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Varie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinze</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5622</td><td>Dumont pinzette di alta precisione grado stile 5</td></tr><tr><td>formamide</td><td>Sigma</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>vetrini VWR</td><td></td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>glucosio</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubi graduati da 1,5 ml</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>disponibili da diversi venditori</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloruro di magnesio</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Varie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>maglie di grandi dimensioni (~1.500 &micro; m)</td><td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>varietà di formati e altri fornitori, 12 o 14 maglie</td></tr><tr><td>a maglia piccola (~300 &300 &; m)</td><td>Spectrum labs</td><td>146 424</td><td>varietà di formati, es., 146 422 o 146 486</td></tr><tr><td>nutator</td><td>Varie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette di Pasteur</td><td>Varie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetato di potassio</td><td>Varie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido cacodilico</td><td>Sigma</td><td>C0125</td><td>PERICOLOSO; in alternativa, il cacodilato di sodio può essere sostituito dal</td></tr><tr><td>potassio Idrossido</td><td>Vari acetato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>di sodio</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>citrato di sodio</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>idrossido di sodio</td><td>Vari</td> saccarosio Vari <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Taxolo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vari (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T1912</td><td>PERICOLOSO</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>vortex</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tecniche di imaging prometafase e metafase della meiosi i nel fisso<em&gt; drosophila</em&gt; ovociti

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

La segregazione cromosomica negli ovociti umani è soggetta a errori, con conseguente aneuploidia, che è la principale causa genetica di aborto spontaneo e difetti alla nascita. Lo studio del comportamento cromosomico negli ovociti di organismi modello è molto promettente per scoprire le basi molecolari della suscettibilità degli ovociti umani alle aneuploidia. La Drosophila melanogaster è suscettibile di manipolazione genetica, con oltre 100 anni di ricerca, comunità e sviluppo di tecniche. La visualizzazione del comportamento cromosomico e dell'assemblaggio del fuso negli ovociti di Drosophila presenta sfide particolari, tuttavia, principalmente a causa della presenza di membrane che circondano l'ovocita che sono impenetrabili agli anticorpi. Descriviamo qui i protocolli per la raccolta, la preparazione e l'imaging dell'assemblaggio del fuso della meiosi I e del comportamento cromosomico negli ovociti di Drosophila, che consentono la dissezione molecolare della segregazione cromosomica in questo importante organismo modello.

I metodi che abbiamo descritto qui comporterà la raccolta di fase tardo-ovociti Drosophila che rappresentano tre fasi della meiosi (Figura 1). Gli ovociti in profase si distinguono per la presenza della membrana nucleare, che è visibile dalla mancanza di segnale di tubulina nella regione circostante il cariosoma (Figura 1A). Prometafase è il periodo dopo la rottura membrana nucleare durante il quale le assembla mandrino. Durante prometafase, il ...

Presentiamo protocolli per la raccolta, la preparazione e l'imaging di ovociti maturi di Drosophila. Questi metodi consentono la visualizzazione del comportamento cromosomico e dell'assemblaggio e della funzione del fuso durante la meiosi.

Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso<em&gt; Drosophila</em&gt; ovociti

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare gli oociti di Drosophila per l'esame citologico dell'assemblaggio del fuso e dell'orientamento dei cromosomi durante la meiosi I. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della meiosi, come ad esempio come viene stabilita la bipolarità del fuso e come i cromosomi assumono un orientamento biorientato in assenza di centrosomi. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che le membrane dell'oocita, che ostacolano la penetrazione degli anticorpi, vengono efficacemente rimosse, permettendo così l'immunofluorescenza. Per iniziare, rivestire internamente un tubo da cinque millimetri e una pipetta Pasteur con PTB per evitare che gli oociti aderiscano alle superfici.Aggiungere 100 millilitri di buffer ROB in un frullatore, quindi aggiungere da 100 a 300 moscerini anestetizzati e azionare l’apparecchio a impulsi per tre volte, per un secondo ciascuna. Filtrare la sospensione ottenuta in un becher da 250 millilitri attraverso una maglia larga con pori di circa 1.500 micrometri. Lasciare decantare il filtrato per circa due minuti, quindi aspirare lo strato superiore, rimuovendo il maggior numero possibile di parti corporee di grandi dimensioni.Filtrare nuovamente la sospensione in un becher da 250 millilitri, attraverso una maglia più fine con una dimensione dei pori di 300 micrometri. Risciacquare il primo becher utilizzando ulteriore tampone nella pipetta rivestita per raccogliere gli oociti rimanenti. Lasciare decantare la sospensione per tre minuti, quindi aspirare tutto tranne i 10 millilitri inferiori.Versare nella provetta da cinque millilitri rivestita la maggior quantità possibile dei 10 millilitri. Lasciare decantare la sospensione per circa due minuti, quindi rimuovere con attenzione il liquido. Aggiungere il resto dei 10 millilitri di sospensione e lasciare decantare nuovamente la miscela prima di rimuovere il liquido.Risciacquare eventuali ovociti rimanenti dal becher utilizzando ulteriore tampone nella pipetta rivestita. Lasciare sedimentare il risciacquo nel tubo da cinque millilitri per tre-cinque minuti. Per fissare le ovaie, aspirare prima tutta la parte liquida dai tessuti e aggiungere immediatamente un millilitro di miscela di fissaggio.Posizionare i tessuti su un nutatore per 2 minuti e mezzo. Successivamente, aggiungere un millilitro di eptano, vortexare il tubo per un minuto e quindi lasciare sedimentare gli ovociti per un ulteriore minuto. Rimuovere tutto il liquido dal tessuto sedimentato, quindi aggiungere un millilitro di PBS 1x.Vortexare il tubo per 30 secondi, quindi lasciare sedimentare gli oociti per un minuto. Successivamente, rimuovere tutto il liquido dal tubo e riempirlo con cinque millilitri di PBS 1x. Utilizzando la pipetta rivestita, aggiungere circa da 500 a 1.000 oociti su un vetrino in vetro smerigliato.Rimuovere eventuali parti corporee o materiali estranei utilizzando pinzette. Posizionare un coprioggetto sopra il tessuto e arrotolare delicatamente gli oociti fino a quando tutte le membrane sono state rimosse. Trascinare il bordo del coprioggetto sugli oociti si rivela efficace.Controllare periodicamente l'avanzamento della rimozione della membrana al microscopio. Una pressione eccessiva distruggerà gli oociti. La rimozione più efficace della membrana dell'ocita si ottiene combinando la massima quantità di movimento degli oociti con la minima pressione possibile.Usare una pressione leggera e movimenti rapidi per trascinare il bordo del coprioggetto sugli oociti. Per iniziare l'estrazione e il bloccaggio, aggiungere 15 millilitri di PBS 1% Triton X-100 in un tubo da 50 millilitri. Risciacquare gli oociti arrotolati in questo tubo e agitare delicatamente per un periodo compreso tra un'ora e mezza e due ore.Dopo aver lasciato sedimentare gli oociti per due minuti, rimuovere il liquido insieme al maggior numero possibile di membrane e aggiungere 50 millilitri di PBS 0.05% Triton X-100. Lasciare sedimentare gli oociti per altri due minuti, quindi rimuovere tutto il liquido tranne circa un millilitro. Trasferire gli oociti in una provetta graduata da 1,5 millilitri e rimuovere il liquido rimanente.Aggiungere un millilitro di PTB per il blocco e incubare in agitazione lenta per un'ora. Rimuovere il liquido dagli oociti e quindi aggiungere 300 microlitri di PTB. Successivamente, aggiungere l'anticorpo primario di interesse al diluizione appropriata, avendo cura di proteggere i campioni trattati con anticorpi fluorescenti dalla luce.Incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Lavare gli oociti con un millilitro di PTB per quattro volte, ciascuna per 15 minuti. Rimuovere il liquido e aggiungere 200 microlitri di surnatante proveniente dagli embrioni trattati con l'anticorpo secondario.Filtrare fino al segno di 300 microlitri con PTB, quindi agitare delicatamente per tre o quattro ore a temperatura ambiente. Lavare gli oociti una volta per 15 minuti con un millilitro di PTB. Successivamente, rimuovere il liquido e aggiungere 0,5 microlitri di Hoechst 33342 e 500 microlitri di PTB.Impostare su movimento nutante per sette minuti. Utilizzare un millilitro di PTB per lavare gli oociti due volte, per 15 minuti ciascuno. I campioni possono ora essere montati e analizzati immediatamente mediante tecniche standard di microscopia confocale, oppure conservati in PTB a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.Qui sono mostrate immagini di oociti in stadio avanzato ottenute mediante la tecnica dimostrata, che catturano tre stadi diversi della meiosi. Gli oociti in profase si distinguono per la presenza dell'involucro nucleare, visibile a causa dell'assenza del segnale di tubulina nelle regioni circostanti il cariosoma. È stata inoltre osservata la caratteristica allungamento del cariosoma in prometafase, e i cromosomi quattro risultano separati dalla massa del cariosoma.La metafase è stata inoltre catturata e il chiasma appare ritratto in una forma rotonda. Qui, l'immunomarcatura con diversi anticorpi evidenzia il fuso, i centromeri e il fuso centrale in ovociti fissati con formaldeide ed eptano. Gli ovociti trattati con il farmaco colchicina hanno mostrato fenotipi non standard con l'eliminazione della maggior parte dei microtubuli non cinetocorici, con conseguente contatto di tutti i microtubuli con il DNA al centromero marcato da Phocyde.Il trattamento con Paclitaxel ha prodotto ovociti con microtubuli eccessivi nel citoplasma. Infine, gli ovociti trattati con Binucleina 2 per inibire la chinasi Aurora B hanno mostrato una perdita completa dei microtubuli del fuso. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non affrettarsi nella rimozione della membrana dell'ovocita, poiché il successo del protocollo dipende da questo passaggio.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché la rimozione delle membrane richiede pazienza e pratica. Questa tecnica è quindi preferibile apprenderla osservando qualcuno che la esegue con successo. Una volta padroneggiata, l'arrotolamento degli oociti può essere completato in cinque-dieci minuti.Tuttavia, è possibile attendere fino a 30 minuti senza compromettere la qualità dei risultati. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come preparare oociti di Drosophila in stadio avanzato per l'analisi mediante imaging dell'assemblaggio del fuso mitotico, dell'organizzazione del fuso, dei movimenti cromosomici e della bi-orientazione cromosomica. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

techniques-for-imaging-prometaphase-metaphase-meiosis-i-fixed

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo protocollo descrive l'uso di microiniezione e di imaging ad alta risoluzione...

Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale

Ovociti sono inclini a aneuploidia a causa di errori nella segregazione dei cromosomi durante la maturazione meiotica. Uova aneuploidi può causare infertilità, aborti o disturbi dello sviluppo, come la sindrome di Down. Qui, descriviamo i metodi per introdurre materiali di scelta in ovociti e metodi per lo studio maturazione meiotica e valutare ploidia.

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Il cinetocore è dove il SAC inizia il suo segnale di controllo della segregazione mitotica dei cromatidi fratelli. Un metodo è descritto per visualizzare il reclutamento e il fatturato di una delle proteine ​​cinetocoro e il suo coordinamento con il movimento dei cromosomi...

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni sinciziale

L'immunocolorazione degli ovociti in fase avanzata di Drosophila può rivelarsi difficile a causa delle membrane circostanti degli ovociti. Questo video descrive un metodo ad alto rendimento per ottenere ovociti, la loro fissazione e la rimozione delle membrane per l'immunocolorazione. Il protocollo presentato dimostra queste tecniche con ovociti in fase avanzata utilizzati per visualizzare diversi stadi della meiosi.

Preparazione di ovociti di Drosophila fissati per l'immunocolorazione: un metodo ad alto rendimento per fissare e rimuovere la membrana esterna

Imaging di proteine ​​centrosomica durante Drosophila spermatogenesi è un metodo efficace per identificare nuove proteine ​​critiche per la biologia cntrosoma nonché per chiarire la particolare funzione di giocatori noti in questo processo.

I centrosomi Imaging in Fly Testicoli

Metodi per isolare e preparare Drosophila testicoli campioni (vivere e fissa) per l'imaging dal contrasto di fase e microscopia a fluorescenza sono descritte qui.

L&#39;analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicoli

Questo manoscritto presenta un metodo dettagliato per la generazione di X-cromosoma braccio sonde e performanti in situ ibridazione di fluorescenza (pesce) per esaminare lo stato della sorella coesione cromatidio in prometafase e metafase sono arrestato  Drosofila ovociti. Questo protocollo è adatto a determinare se la coesione meiotica braccio è intatto o perturbato in differenti genotipi.

Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila

Come le varianti genetiche associate con la malattia umana cominciano a diventare scoperto, sta diventando sempre più importante sviluppare sistemi con cui valutare rapidamente il significato biologico di quelle varianti identificate. Questo protocollo descrive i metodi per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi femminile che usando i oocytes del mouse.

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Gli errori meiotici nelle sinapsi e nella ricombinazione sono comuni agli ovociti dei mammiferi. Un'analisi rigorosa delle proteine coinvolte in questi processi è essenziale per capire come e perché l'oogenesi spesso va male. Le tecniche qui presentate consentono un monitoraggio completo della ricombinazione e delle sinapsi per valutare la qualità degli ovociti nei topi.

Preparazione di diffusioni cromosomiche meiotiche da ovociti di topo per la valutazione della sinapsi e della ricombinazione

Mesoscopici fluorescenza tomografia opera oltre i limiti di penetrazione del tessuto-sezionamento microscopia a fluorescenza. La tecnica è basata su multi-proiezione di illuminazione e una descrizione di trasporto fotone. Abbiamo dimostrato in vivo di tutto il corpo visualizzazione 3D della morfogenesi della GFP che esprimono ala dischi immaginale...

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila</em

Impara a preparare ovociti di Drosophila per l'imaging della meiosi I. Questo metodo consente la visualizzazione dell'assemblaggio del fuso e dell'orientamento cromosomico tramite immunofluorescenza.

Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso

Esplora altri video