Name: Rimozione di Drosophila Tessuto muscolare da larvali Filetti per lanalisi di immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e cellule epidermiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Impara a rimuovere il tessuto muscolare da larve di Drosophila per migliorare l'immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e delle cellule epidermiche. Questo metodo aumenta il rapporto segnale-rumore e consente la microscopia a super-risoluzione.

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Ringraziamo Gary Laevsky per le discussioni utili su microscopia. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concede R01GM061107 e R01GM067758 di ERG

Nota: La procedura per la rimozione muscolare (Figura 1) è una modifica di metodi precedentemente descritti per la preparazione di filetti larvale. Le fasi che precedono e seguono la rimozione del muscolo sono descritti brevemente e si rinvia al precedente lavoro 10, 11 per una descrizione più dettagliata. 1. Dissect Larva a Saline freddo <ol><li> Preparare una diluizione di lavoro di freddo HL3.1 salina 15 o Ca 2+ freddo -free HL3.1 salina 11 (Tabella 1). Posizionare la larva in un elastomero siliconico piatto con sufficiente soluzione salina fredda per coprire il fondo del piatto. NOTA: Si veda la discussione per quanto riguarda la scelta di soluzione salina. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1x HL3.1 salina (pH 7,2) </td></tr><tr><td> 5 mM HEPES </td></tr><tr><td> 70 mM NaCl </td></tr><tr&gt; <td> 5 mM KCl </td></tr><tr><td> 1,5 mm CaCl 2 (omettere per Ca 2+ salina-free) </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM NaHCO 3 </td></tr><tr><td> 5 mM trealosio </td></tr><tr><td> 115 mm di saccarosio </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> imita Composizione insetti emolinfa: Nota </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Composizione del freddo Saline. <ol start="2"><li> Posizionare la larva con il lato ventrale. La superficie ventrale della larva può essere identificato dalle cinture dentical addominali e dal lato dorsale dai tubi tracheali larvali primarie in esecuzione da anteriore a posteriore. Allungare la larva in direzione antero-posteriore e il pin la testa e la coda a unelastomero di silicone dissezione piatto con perni di insetti. Utilizzare forbici dissezione fini per tagliare lungo la linea mediana ventrale, cominciando ad un&#39;estremità e procedendo verso l&#39;altro. NOTA: Questo orientamento conserva il cluster dorsale comunemente studiate di DA neuroni. </li><li> Dopo la larva è tagliato aperto, appuntare i quattro angoli al piatto dissezione come se l&#39;apertura di un libro. Utilizzare pinze per afferrare e rimuovere gli organi interni, tra cui il sistema nervoso centrale, intestino, e la trachea. Regolare i perni di insetti in modo che il filetto è tesa, ma non al massimo allungato. NOTA: I muscoli sono ancorati alla parete del corpo ai confini dei singoli settori. Sebbene muscoli coprono la maggior parte della parete del corpo, sono assenti in una stretta regione vicino alla linea mediana dorsale. </li></ol> Rimozione 2. muscolare <ol><li> Individuare la linea mediana dorsale della larva, dove il tessuto muscolare è assente. Posizionare una singola pinza polo tale da poter essere inserito sotto il tessuto muscolare nella piatta orientamento possibile. </li><li> A partire dalinea mediana dorsale, vicino al confine anteriore del segmento, far scorrere con attenzione la pinza polo tra il muscolo e dell&#39;epidermide, avendo cura di minimizzare il contatto tra le pinze e dell&#39;epidermide. </li><li> Estrarre la pinza verso l&#39;alto per rompere l&#39;attacco del muscolo alla parete del corpo in un punto di ancoraggio. Ripetere questo processo per il restante emi-segmento (s) di interesse. NOTA: Questo protocollo ottimizza preservazione posteriore di ciascun campo dendrite da neurone. Per preservare la parte anteriore del campo dendrite, è preferibile inserire il polo pinza alla estremità posteriore di ciascun segmento. </li><li> Riadattare perni insetti tale che il filetto larvale è massimamente stirato in tutte le direzioni. </li><li> Fissare il filetto mentre è ancora bloccato al piatto dissezione con freddo, preparati al momento formaldeide 4% in PBS per 25 min. </li><li> Lavare 5 volte in PBS. </li><li> Utilizzare pinze per estrarre delicatamente via il tessuto muscolare dai punti di ancoraggio restanti, avendo cura di ridurre al minimo contact con l&#39;epidermide. </li><li> Sblocca e rimuovere il filetto dal piatto dissezione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Eseguire tutte le successive di lavaggio, il blocco, e passi immunofluorescenza, come descritto in precedenza 11. </li></ol> 3. Montare il larvale Filetto <ol><li> Prima rimuovere la testa e la coda con le forbici dissezione sottili al fine di rendere il campione più piatta possibile. Montare il filetto su un vetrino in antifade di montaggio con la superficie interna del raccordo di fronte al vetrino. </li><li> Posizionare un vetrino da microscopio sul vetrino e premere delicatamente per disperdere la soluzione di montaggio. Capovolgere il vetrino da microscopio sopra e sigillare il vetrino sul vetrino utilizzando smalto. Diapositive possono essere conservati a -20 ° C per almeno un mese. </li></ol>

<ol><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui un protocollo è descritto per la rimozione manuale del tessuto muscolare da Drosophila filetti larvale. Questo protocollo modifica precedentemente descritto tecniche di dissezione larvali 10,11. Dopo la larva è sezionato in un piatto elastomero siliconico, la linea mediana dorsale si trova. Una singola pinza polo, nella sua più piatto possibile orientamento, è attentamente inserito tra il tessuto muscolare e l&#39;epidermide, vicino alla linea mediana dorsale. Le pinze sono delicatamente tirati v...

Larvali arborizzazione dendritica (DA) neuroni Drosophila forniscono un modello valido per lo studio dello sviluppo neuronale a causa della loro riconducibilità alla manipolazione genetica e la facilità con cui possono essere esposte. Questi neuroni sensoriali sono state fondamentali per l&#39;identificazione di numerosi sentieri che controllano dendrite morfogenesi 1-3. Quattro classi di Da neuroni (classe I - IV) innervare l&#39;epidermide larvali. Questi neuroni si trovano tra la membrana basale e l&#39;epidermide, con i loro dendriti formazione di matrici sostanzialmente bidimensionali 4,5. Dei quattro classi, la classe IV DA neuroni hanno le pergole più altamente ramificata e, come i neuroni sensoriali di altri animali, l&#39;elaborazione di questi pergole richiede fattori intrinseci come pure spunti da tessuti vicini, in particolare l&#39;epidermide, per il loro sviluppo 6-9 . Gli studi per determinare come tale neuronale e infatti extra-neuronaleors controllare beneficio morfogenesi dei dendriti dalla capacità di rilevare l&#39;espressione della proteina in situ mediante immunofluorescenza. La cuticola esterno della larva è impenetrabile agli anticorpi, ma questo impedimento è facilmente superabile dalla preparazione di filetti larvale attraverso metodi dissezione consolidati 10,11. Tuttavia, il tessuto muscolare parete del corpo che si trova appena interno alla membrana basale presenta varie sfide verso visualizzazione DA neuroni e cellule epidermiche. Innanzitutto, il tessuto muscolare, quali linee maggior parte della parete del corpo, oscura notevolmente segnali fluorescenti provenienti da tessuto neuronale o epidermico. Questo riduce notevolmente il rapporto segnale-rumore nel campione. Secondo, molte proteine ​​rilevanti possono essere espressi nel tessuto muscolare e nei neuroni o dell&#39;epidermide. Questo segnale di fluorescenza muscolare derivato probabilmente ancora rilevamento oscura di un segnale di fluorescenza dal neurone o epidermide. Infine, i progressi nelle tecnologie di microscopia nol&#39;imaging permesso w di campioni con risoluzione sub-diffrazione e può essere particolarmente utile nel discernere la localizzazione delle proteine che vengono espresse in neuroni e cellule epidermiche circostanti 12,13. Tuttavia, l&#39;imaging via super-risoluzione benefici microscopia da un forte rapporto segnale-rumore e la vicinanza del campione al vetrino. Oltre a ridurre il rapporto segnale rumore, la parete del corpo larvali distanze muscolari DA neuroni dal vetrino, limitando così la risoluzione dell&#39;immagine migliorata che può essere ottenuto con metodi di microscopia super-risoluzione. Oltre le sfide per l&#39;analisi di immunofluorescenza, tessuto muscolare presenta una barriera alla registrazione elettrofisiologica da neuroni sensoriali nella parete del corpo larvale. La sua rimozione beneficia pertanto manipolazione neurofisiologica dei neuroni sensoriali 14. Qui un metodo per la rimozione manuale di Drosophila tessuto muscolare larvale è descritto. Abbiamo dimostrato che il nostro protocollo permits immagini immunofluorescenza di proteine ​​che sono altrimenti oscurata da tessuto muscolare, migliora il rapporto segnale-rumore per la visualizzazione di classe IV DA neuroni, e consente l&#39;utilizzo della microscopia super-risoluzione per discriminare meglio relazioni spaziali di proteine ​​e strutture cellulari in DA neuroni e l&#39;epidermide.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 pinzette</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>Micro forbici, 8 cm, dritte, lame da 5 mm, punte da 0,1 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit di elastomeri siliconici</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>per piastre da dissezione</td></tr><tr><td>Perni per insetti Austerlitz, 0,1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa Fostec 8375</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield supporto di montaggio antisbiadimento</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>per microscopia confocale</td></tr><tr><td>Prolong Diamond antifade mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>per microscopia a illuminazione strutturata</td></tr><tr><td>Micro vetro di copertura, 22 x 22 mm, n. 1,5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio Superfrost Plus, 25 x 75 x 1,0 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Coracle di topo</td><td>Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank</td><td>C615.16</td><td>surnatante, diluito 1:50</td></tr><tr><td>Mouse anti-Discs large antibody</td> Studi <td>sullo sviluppo Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>surnatante, diluito 1:50</td></tr><tr><td>Coniglio anticorpo anti-dsRed</td><td>Clontech</td><td></td><td>632496 diluito 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 568 coniugato</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific A-11011</td><td>diluito 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-topo di capra, Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>diluito 1:500</td></tr></tbody></table>

rimozione di<em&gt; drosophila</em&gt; tessuto muscolare da larvali filetti per l&#39;analisi di immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e cellule epidermiche

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Larvali arborizzazione dendritica (DA) neuroni Drosophila sono un modello popolare per lo studio dei meccanismi di morfogenesi neuronale. Da neuroni sviluppano in comunicazione con le cellule epidermiche che innervano e quindi le loro prestazioni di analisi da in situ visualizzazione di entrambe le proteine neuronally e epidermally espresse mediante immunofluorescenza. I metodi tradizionali di preparazione di filetti larvale per esperimenti di immunofluorescenza lasciano intatto il tessuto muscolare che copre la maggior parte della parete del corpo, che presenta diverse sfide per l&#39;imaging neuronale e epidermiche proteine. Qui si descrive un metodo per la rimozione di tessuto muscolare dalla Drosophila filetti larvale. Questo protocollo permette l&#39;imaging di proteine ​​che sono altrimenti oscurata da tessuto muscolare, migliora il rapporto segnale rumore, e facilita l&#39;utilizzo della microscopia super-risoluzione per studiare da sviluppo neurone.

Dimostriamo l&#39;utilità della procedura di rimozione del muscolo per migliorare rapporto segnale-rumore in esperimenti di immunofluorescenza di co-visualizzare le proteine ​​di derivazione settate Coracle (Cora) e dischi-grandi dimensioni (DLG) insieme con classe IV DA neuroni marcati con il marcatore di membrana CD4- tdTomato. Cora è stato utilizzato in precedenza per identificare tratti dove DA dendriti dei neuroni sono racchiusi da cellule epidermiche ed...

Studi di morfogenesi neuronale utilizzando Drosophila larvale arborizzazione dendritiche (bis) i neuroni beneficiano di visualizzazione situ delle proteine neuronali e epidermiche mediante immunofluorescenza. Descriviamo una procedura che migliora l&#39;analisi di immunofluorescenza di DA neuroni e cellule epidermiche circostanti, rimuovendo il tessuto muscolare dalla parete del corpo larvale.

Rimozione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuto muscolare da larvali Filetti per l&#39;analisi di immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e cellule epidermiche

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rimuovere il tessuto muscolare da una larva di drosophila per prepararla all'analisi di immunofluorescenza delle arborizzazioni dendritiche larvali o dei neuroni di tipo da e del tessuto epidermico. Oggi illustreremo un metodo che migliora la visualizzazione di fattori neuronali ed extraneuronali coinvolti nella morfogenesi dei dendriti. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di eseguire imaging di immunofluorescenza di proteine che altrimenti sarebbero oscurate dal tessuto muscolare, migliorando il rapporto segnale-rumore e consentendo l'uso della microscopia a super risoluzione.Per iniziare, aggiungere una quantità sufficiente di soluzione salina fredda in una capsula in elastomero di silicone in modo da coprire la superficie inferiore. Aggiungere la larva oggetto di studio nella capsula e posizionarla sotto il microscopio stereoscopico. Assicurarsi un corretto posizionamento della luce.Posizionare la larva con il lato ventrale rivolto verso l'alto, che può essere identificato dalle fasce di denticoli addominali. Stendere la larva nella direzione anteriore-posteriore e, utilizzando spilli per insetti, fissare la testa e la coda al fondo della piastra. Con un paio di forbici da dissezione fini, effettuare un taglio lungo la linea mediana ventrale della larva da un'estremità all'altra.Aprire la larva e fissare il tessuto della cuticola agli angoli con puntine da dissetto in modo che giaccia piatto. Utilizzando pinzette, rimuovere gli organi interni, compresi il sistema nervoso centrale, l'intestino e la trachea. Regolare le puntine da dissetto in modo che il preparato sia teso ma non completamente stirato.Individuare la linea mediana dorsale della larva, dove non è presente tessuto muscolare, quindi posizionare una punta della pinzetta all'interno di questo limite. Far scivolare la punta tra il muscolo e l'epidermide, avendo cura di minimizzare il contatto con l'epidermide. Per ridurre al minimo i danni all'epidermide, utilizzare punte della pinzetta il più piatte possibile e provare a dissezionare in soluzione salina contenente calcio. Questo potrebbe aiutare a creare spazio tra il muscolo e l'epidermide.Successivamente, tirare verso l'alto la pinzetta per staccare il muscolo dalla parete corporea in uno dei punti di ancoraggio. Ripetere questa procedura per i restanti segmenti muscolari di interesse. Riassestare i perni che fissano l'insetto in modo da allungare al massimo i filetti larvali in tutte le direzioni.Per fissare il filet, rimuovere prima la soluzione salina, quindi aggiungere 4% di formaldeide appena preparata e fredda in PBS, in quantità sufficiente a coprire il fondo della piastra. Incubare a temperatura ambiente per 25 minuti. Risciacquare il filet cinque volte in PBS per rimuovere l'eccesso di formaldeide.Successivamente, utilizzare una pinzetta per staccare con attenzione il tessuto muscolare dai punti di ancoraggio residui. Ancora una volta, ridurre al minimo il contatto con l'epidermide. Infine, rimuovere i perni e prelevare il filetto dalla bacinella per dissezioni.Posizionarlo in una provetta pulita da microcentrifuga da 1,5 millilitri. I successivi lavaggi, il bloccaggio e l'immunomarcatura devono essere eseguiti in questa provetta. Per montare il filetto per l'analisi microscopica, rimuovere il campione dalla provetta da microcentrifuga e posizionarlo con la superficie interna rivolta verso il basso su un'immersione in una goccia di PBS.Tagliare la testa e la coda. Quindi rimuovere il PBS assorbendolo con un panno da laboratorio. Aggiungere una goccia di Antifade Mountant.Posizionare un vetrino coprioggetti sul vetrino portaoggetti, quindi premere delicatamente con un tovagliolo da laboratorio per distribuire il mezzo di montaggio. Girare il vetrino e applicare dello smalto trasparente su ciascun bordo per sigillare il coprioggetti. Queste immagini confocali mostrano esperimenti di immunofluorescenza per visualizzare la proteina delle giunzioni settate, Coracle, o Cora, e i neuroni di tipo da.Qui, sono state acquisite immagini di tessuti con muscolo rimosso e con muscolo integro nelle stesse condizioni di potenza del laser. Nel tessuto con muscolo integro, la potenza del laser è stata aumentata per compensare l'interferenza muscolare e produrre un'immagine comparabile. Nelle immagini ottenute da filetti con muscolo rimosso, cora è stato chiaramente rilevato ai margini delle cellule epidermiche in tratti intermittenti lungo le dendriti dei neuroni di classe quattro.E delimitando il neurone, il soma. Al contrario, la localizzazione di cora in questi domini era appena rilevabile nel muscolo sui campioni. Qui, cora è stata principalmente visualizzata nel muscolo, nella trachea e nelle giunzioni neuromuscolari, e la fluorescenza proveniente da questi tessuti ha oscurato la maggior parte della cora epidermica.I campioni sono stati inoltre analizzati mediante microscopia a illuminazione strutturata 3D per determinare se la rimozione del muscolo avesse migliorato la visualizzazione a risoluzione più elevata. Anche in questo caso, i campioni con muscolo integro hanno richiesto una visualizzazione con potenza e tempo di esposizione aumentati per compensare l'interferenza muscolare. La risoluzione dell'immagine risultava più nitida nei campioni senza muscolo, sono stati osservati meno artefatti e la colorazione con cora dei tratti dei dendriti è stata risolta con maggiore facilità.Le membrane dei dendriti possono essere misurate anche a 114 nanometri nella condizione di muscolo spento. Mentre sembrano larghe 272 nanometri nei filetti di muscolo acceso. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante limitare il numero di larve dissezionate prima della fissazione, in modo che il tempo trascorso non superi i 25 minuti.Dopo aver visionato questo video, dovreste avere una buona comprensione di come rimuovere il tessuto muscolare da una larva di Drosophila. Questo protocollo sarà utile per l'analisi mediante immunofluorescenza dei neuroni sensoriali larvali e delle cellule epidermiche da essi innervate. Grazie per aver seguito il video e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Drosophila larvali NMJ Dissection

Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

Questo video descrive come preparare i filetti larvali utilizzati per visualizzare i neuroni dell'arborizzazione dendritica sensoriale (da) e le cellule epidermiche associate. Il protocollo presentato mostra in dettaglio come rimuovere il tessuto muscolare dalla parete corporea preservando la morfologia delle cellule, il che migliora l'immunocolorazione e la visualizzazione dei neuroni da e delle cellule epidermiche altrimenti oscurate.

Preparazione del filetto larvale: un metodo per visualizzare i neuroni sensoriali intatti e le cellule epidermiche associate

I muscoli di volo della Drosophila sono utilizzati come sistema modello per lo sviluppo muscolare e la fisiologia. Questo video descrive la muscolatura di volo degli adulti e mette in evidenza un protocollo per sezionare lo sviluppo di muscoli di volo indiretti adatti al sequenziamento dell'RNA dalle pupe.

drosofila Dissezione del muscolo del volo indiretto (IFM) della pupa tardiva: un metodo per la raccolta di tessuti ad alto rendimento

In questo video, le fibre nervose delle larve di Drosophila sono immerse in un colorante FM, che si lega ai lipidi della membrana cellulare. Il microelettrodo di aspirazione e gli impulsi elettrici stimolano il processo di endocitosi, incorporando il colorante FM nelle vescicole endocitiche di nuova formazione. Questo metodo, che visualizza le fasi presinaptiche della neurotrasmissione, è utile per studiare la funzione sinaptica e il rilascio di neurotrasmettitori.

Carico e scarico del colorante FM mediato da microelettrodi nelle cellule nervose delle larve di Drosophila

L'immunocolorazione è una tecnica efficace per visualizzare specifici tipi di cellule e proteine all'interno dei tessuti. Utilizzando la sonicazione, il protocollo qui descritto allevia la necessità di sezionare i tessuti di Drosophila melanogaster da embrioni e larve in fase avanzata prima dell'immunocolorazione. Forniamo una metodologia efficiente per l'immunocolorazione di larve intere di montatura fissate con formaldeide.

Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuti<em&gt; In Situ</em

Le strutture adulte di Drosophila derivano da strutture simili a sacche chiamate dischi immaginali. L'analisi di questi dischi fornisce informazioni su molti processi di sviluppo, tra cui la determinazione dei tessuti, la definizione dei confini compartimentali, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare e la polarità cellulare planare. Questo protocollo viene utilizzato per preparare i dischi immaginali per la microscopia ottica/fluorescente.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster

Il muscolo di volo della Drosophila è un modello potente per studiare la regolazione trascrizionale, lo splicing alternativo, il metabolismo e la meccanobiologia. Vi presentiamo un protocollo per la dissezione del muscolo di volo con etichettafluere fluorescente dalle pupe vive per generare campioni altamente arricchiti ideali per la proteomica e il sequenziamento profondo. Questi campioni possono offrire importanti approfondimenti meccanicistici su diversi aspetti dello sviluppo muscolare.

Dissezione dei muscoli di volo di Drosophila melanogaster per gli approcci Omics

Questo rapporto fornisce una nuova procedura di preparazione del campione per la visualizzazione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila . Questo metodo è più efficace nel prevenire l'arricciamento dei campioni rispetto al metodo tradizionale ed è particolarmente utile per l'analisi ultrastrutturale della giunzione neuromuscolare della Drosophila .

Ottimizzazione del processo di preparazione dei campioni per la microscopia elettronica a trasmissione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per visualizzare le reti di microtubuli nelle giunzioni neuromuscolari e nelle cellule muscolari. In combinazione con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l'analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.

Utilizzo della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari della Drosophila per visualizzare la rete di microtubuli

La Drosophila è un potente modello per comprendere i meccanismi fondamentali della miogenesi. Questo protocollo per la dissezione e la preparazione di emisezioni toraciche, consente l'analisi al microscopio del muscolo del volo indiretto sia dallo stadio pupale che da quello adulto. Questo protocollo consente l'imaging confocale della morfologia cellulare, della localizzazione delle proteine, della struttura muscolare e di molti altri aspetti della miogenesi.

Dissezione dei muscoli di volo indiretti di Drosophila melanogaster per approcci di microscopia

Impara a rimuovere il tessuto muscolare da larve di Drosophila per migliorare l'immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e delle cellule epidermiche. Questo metodo aumenta il rapporto segnale-rumore e consente la microscopia a super-risoluzione.

Rimozione di Drosophila Tessuto muscolare da larvali Filetti per lanalisi di immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e cellule epidermiche (Video) | JoVE Journal

Rimozione di

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