Un metodo per l'RNA di misura
5 dicembre 2016
Un metodo di blotting nord modificato per misurare N 6 -methyladenosine (m 6 a) delle modifiche in RNA è descritto. L'attuale metodo in grado di rilevare le modifiche in diversi RNA e controlli sotto vari disegni sperimentali.
L'obiettivo generale della tecnica di northern blot modificata è misurare le modifiche di N6-metiladenosina, n6A, nell'RNA e rilevare tali modifiche in diversi tipi di RNA. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sul ruolo dell'epigenetica dell'RNA, come le modifiche della N6-metiladenosina. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una separazione efficace dell'RNA, una migliore standardizzazione dei disegni sperimentali e una chiara definizione delle modifiche n6A negli RNA.
Questo metodo può fornire informazioni sulle modifiche n6A nell'RNA e può essere applicato anche ad altre modifiche dell'RNA utilizzando diversi anticorpi di rilevamento. Per iniziare l'esperimento, spruzzare la soluzione di decontaminazione da ribonucleasi su tovaglioli di carta e pulire le pipette e le superfici del banco da laboratorio. Inumidire i tovaglioli di carta con acqua libera da nucleasi e pulire nuovamente le pipette e le superfici del banco da laboratorio.
Prelevare una soluzione per l'isolamento dell'RNA mantenuta a quattro gradi Celsius e aggiungere un millilitro di tale soluzione a circa 75 milligrammi di tessuto murino. Utilizzare un agitatore magnetico per omogeneizzare il tessuto. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di 1-Bromo-3-cloropropano o BCP per ogni millilitro di omogeneato del campione.
Agitare vigorosamente i tubi per 15 secondi ed eseguire l'isolamento dell'RNA totale. Utilizzando uno spettrofotometro, determinare la concentrazione di RNA rilevando l'assorbanza a 260 nanometri e 280 nanometri. Verificare la qualità del campione di RNA eseguendo un'elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8%.
Risciacquare tutta l'apparecchiatura per elettroforesi con acqua di dietilpirocarbonato o acqua DEPC. Combinare 2,5 grammi di agarosio e poi 215 millilitri di acqua DEPC in un matraccio Erlenmeyer e sciogliere completamente la miscela in un forno a microonde. Dopo che la soluzione è completamente fusa, aggiungere 12,5 millilitri di tampone MOPS 10X.
Aggiungere 22,5 millilitri di formaldeide al 37% al pallone. Quindi versare la soluzione nell'apparato di elettroforesi con un pettine dello spessore di 1,5 millimetri. Utilizzando un pettine pulito, spingere le bolle ai margini del gel.
Lasciare solidificare il gel a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzare il tampone di corsa MOPS 1X precedentemente preparato per risciacquare i pozzetti del gel ed eseguire una pre-corretta del gel. Caricare i campioni di RNA nei pozzetti del gel, quindi far correre il gel.
Il giorno successivo, esaminare e fotografare il gel sotto luce UV. Per preparare il trasferimento, tagliare il gel e rimuovere la porzione non utilizzata. Preparare 500 millilitri di tampone SSC 10X (saline sodium citrate).
Lavare il gel due volte con tampone SSC 10X. Ritagliare un foglio di carta filtro sufficientemente grande da coprire il gel. Ritagliare quattro pezzi di carta filtro delle stesse dimensioni del gel.
Successivamente, ritagliare un foglio di membrana di nylon carica positivamente delle stesse dimensioni del gel. Fare un intaglio sul gel e sulla membrana come riferimento per garantire l'orientamento corretto. Immergere la membrana nel buffer 2X SSC.
Versare 500 millilitri di tampone SSC 10X nel vassoio di trasferimento. Posizionare il foglio di carta filtro grande sulla lastra di vetro e inumidire la carta filtro con il tampone di trasferimento. Quindi utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali bolle d'aria.
Inzuppare due pezzi di carta filtro pre-tagliata nel buffer di trasferimento e posizionarli al centro della carta filtro. Rimuovere eventuali bolle d'aria. Quindi posare il gel, con il lato superiore rivolto verso il basso, sulla carta filtro e appoggiare la membrana sopra il gel, assicurandosi di allineare le tacche del gel e della membrana.
Successivamente, posizionare due pezzi di carta filtrante pre-tagliata sopra la membrana. Rimuovere eventuali bolle d'aria tra gli strati. Applicare della pellicola trasparente attorno al gel per assicurarsi che gli stracci assorbano solo il tampone che passa attraverso il gel e la membrana.
Quindi, impilare dei fogli di carta assorbente sopra la carta da filtro. Posizionare una lastra di vetro di dimensioni maggiorate sopra i fogli di carta assorbente e apporre un peso sulla sommità dell'impilaggio, lasciando che l'RNA migri dal gel alla membrana per tutta la notte. Al termine del trasferimento, mantenere la membrana umida in tampone 2X SSC.
Immergere due fogli di carta filtrante nel tampone SSC 10X, quindi posizionare i fogli nel cross-linker UV. Assicurarsi che il lato della membrana con l'RNA assorbito sia rivolto verso l'alto, quindi appoggiare la membrana sopra la carta filtrante. Selezionare la modalità di cross-linking automatico e premere il pulsante di avvio per iniziare l'irradiazione.
Esaminare la membrana e il gel con un sistema di imaging per gel UV per confermare il trasferimento dell'RNA dal gel alla membrana. Bloccare la membrana in una soluzione di latte scremato al 5% in tampone TBST a temperatura ambiente per un'ora. Incubare la membrana in soluzione di anticorpo anti-m6A durante la notte a quattro gradi Celsius.
Il giorno successivo, lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 minuti. Successivamente, incubare la membrana nella soluzione di anticorpo anti-coniglio prodotto in asino coniugato con HRP per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 minuti.
Applicare il substrato di chemiluminescenza potenziata. Raccogliere il segnale chemiluminescente mediante un sistema di imaging digitale. Infine, procedere alla quantificazione di m6A e misurare l'intensità chemiluminescente relativa di m6A utilizzando ImageJ. RNA di fegato di topo sono stati campionati a intervalli di quattro ore e analizzati mediante la tecnica di northern blot modificata.
La metilazione di rRNA, mRNA e piccoli RNA è stata chiaramente rilevata. Sono stati eseguiti blot rappresentativi per m6A su RNA totale e su RNA privo di rRNA ottenuto da fegati di topi di tipo selvaggio. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in quattro giorni se eseguita correttamente.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica dell'RNA per esplorare gli effetti sulla fisiologia umana legati al ritmo circadiano e all'obesità.
Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo di blotting norderno modificato per la rilevazione delle modifiche di N6-metiladenosina (m6A) nell'RNA. La tecnica consente la rilevazione di modifiche in diversi campioni di RNA ed è applicabile in vari disegni sperimentali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- epigenetica dell'RNA
- modifiche m6A
- tecniche sperimentali
Sfondo
- La N6-metiladenosina è una modificazione dell'RNA di notevole importanza.
- Comprendere le modificazioni dell'RNA è fondamentale per ottenere informazioni sulla regolazione genica.
- I metodi attuali per la rilevazione della m6A presentano limitazioni.
- Questa tecnica modificata mira a migliorare il rilevamento e l'analisi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per rilevare le modifiche m6A nell'RNA.
- Migliorare la comprensione dell'epigenetica dell'RNA.
- Fornire un approccio standardizzato per diverse progettazioni sperimentali.
Metodi Utilizzati
- Isolamento dell'RNA da tessuto murino.
- Elettroforesi per la valutazione della qualità dell'RNA.
- Trasferimento dell'RNA su una membrana di nylon.
- Rivelazione mediante anticorpi anti-m6A e chemiluminescenza.
Risultati principali
- Rilevamento efficace delle modifiche m6A nei rRNA, mRNA e RNA piccoli.
- Delimitazione chiara delle modifiche m6A in vari campioni di RNA.
- La tecnica può essere eseguita in modo efficiente entro quattro giorni.
Conclusioni
- La tecnica di northern blotting modificata è efficace per lo studio delle modifiche dell'RNA.
- Questo metodo apre nuove prospettive nella ricerca sull'epigenetica dell'RNA.
- Applicazioni potenziali includono studi sui ritmi circadiani e sull'obesità.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione accurata delle modifiche dell'RNA N6-metiladenosina (m6A) supporta la validazione degli obiettivi nell'epigenetica dell'RNA consentendo una valutazione quantitativa della regolazione epitrascrittomica. Questo metodo aumenta la fiducia predittiva negli studi meccanicistici che collegano l'm6A a processi fisiologici come i ritmi circadiani e il metabolismo. Fornisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per ridurre i rischi associati alle ipotesi terapeutiche nella biologia della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi della stabilità, traduzione e splicing dell'RNA dipendenti dall'm6A, chiarificando i ruoli funzionali dei regolatori epigenetici nelle reti di espressione genica.
- Valore operativo: Fornisce una chiara definizione dell'm6A tra le diverse specie di RNA, supportando l'identificazione di bersagli rilevanti per i biomarcatori nei modelli di malattia.
- Valore predittivo: Facilita l'analisi dose-risposta e cinetica dei livelli di m6A, migliorando la certezza riguardo al coinvolgimento del bersaglio e alla modulazione del percorso.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera letture chemiluminescenti quantitative compatibili con imaging ad alta risoluzione per analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali.
- Valore operativo: Standardizza il trasferimento e il rilevamento dell'RNA mediante membrana in nylon e sonda a base di anticorpi, riducendo la variabilità nel profilo delle modifiche.
- Prontezza del saggio: Consente il confronto diretto tra controlli di RNA modificato e non modificato, supportando la validazione del saggio per campagne di screening epigenetico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la dinamica dell'm6A nell'RNA epatico a fenotipi metabolici e circadiani, sostenendo l'esplorazione di biomarcatori traslazionali in modelli preclinici.
- Valore operativo: Permette campionamenti longitudinali (ad esempio, intervalli di quattro ore) per catturare i modelli temporali delle modificazioni rilevanti per i ritmi fisiologici.
- Contenimento del rischio: Riduce l'ambiguità nelle misurazioni delle modificazioni dell'RNA, migliorando la riproducibilità nei flussi di lavoro di validazione degli obiettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel continuum dalla biologia della scoperta all'identificazione dei capostipiti, fornendo una validazione del livello epigenetico che integra il profilo trascrizionale e proteomico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su scrittori, cancellatori e lettori di m6A mediante la misurazione diretta dello stato di modificazione nell'RNA.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi per valutare gli effetti di composti sui marcatori epitrascrittomici in sistemi cellulari o derivati da tessuti.
- Analisi: Permette la quantificazione basata su immagini dell'intensità del segnale di m6A, facilitando il confronto statistico tra gruppi sottoposti a diversi trattamenti o con diverso background genetico.
- Ricerca traslazionale: Collega le modificazioni epigenetiche nell'RNA a esiti fisiologici, sostenendo la progressione preclinica allineata a biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile a diversi tipi di RNA e ad anticorpi specifici per modificazioni, consentendo il riutilizzo su multipli bersagli epigenetici e aree di patologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli epigenetici a RNA attraverso il rilevamento diretto e specifico per modificazione.
- Valore operativo: Flusso di lavoro standardizzato con passaggi definiti di trasferimento, bloccaggio e rilevamento, che garantisce riproducibilità tra laboratori.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto chiarificando il rilevanza funzionale della m6A in vie biologiche rilevanti per le malattie.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli epigenetici in base alla dinamica quantificabile delle modificazioni, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta esperienza nelle tecniche di manipolazione dell'RNA, elettroforesi e immunoblotting.
- La strumentazione include un crosslinker a UV, un sistema di imaging digitale e uno spettrofotometro per la quantificazione dell'RNA.
- La standardizzazione tra i gruppi richiede l'uso costante di soluzioni trattate con DEPC e condizioni di trasferimento controllate.
- L'adattamento ad altre modifiche dell'RNA dipende dalla disponibilità di anticorpi specifici in grado di riconoscere tali modifiche.
- I limiti pratici includono il rischio di degradazione dell'RNA e la necessità di ottimizzare le condizioni di incubazione con gli anticorpi e di lavaggio.
