Name: Un metodo per lRNA di misura N 6 -methyladenosine modifiche di cellule e tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri un metodo di northern blotting modificato per rilevare le modifiche m6A nell'RNA di cellule e tessuti. Questa tecnica consente di studiare l'epigenetica dell'RNA con elevata sensibilità e standardizzazione.

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C.Y.W. ha ricevuto il sostegno del National Health Research Institute (NHRI-EX101-9925SC), del National Science Council (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) e del Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 e CMRPG3C1763).

NOTA: L&#39;RNA totale m 6 A livello comprende rRNA, mRNA, e altri piccoli RNA. Dal momento che l&#39;RNA ribosomiale è abbondante m 6 modifiche A, la misura di m 6 livelli A dovranno prendere in considerazione questo fatto. Isolamento 1. RNA <ol><li> Utilizzando la soluzione di decontaminazione ribonucleasi (spruzzato su tovaglioli di carta), pulire le pipette e le superfici banco di laboratorio. asciugamani di carta bagnati con acqua priva di nucleasi e pulire le pipette e le superfici banco di laboratorio di nuovo. </li><li> RNA Estrazione <ol><li> Isolamento RNA totale <ol><li> Utilizzando un agitatore, mescolare 50-100 mg di tessuto o 5-10 x 10 6 cellule in 1 ml di soluzione di isolamento dell&#39;RNA mantenuti a 4 ° C. NOTA: più tessuto (100-150 mg) può essere richiesto per i campioni di tessuto adiposo di topi a causa delle concentrazioni di RNA inferiori in esso. I campioni provengono da cuore del mouse, fegato, muscolo scheletrico, polmone, cervello e macrofagi sono stati impiegati in precedenza 4. </li><li> Incubate omogenati di esempio per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 100 ml di 1-bromo-3-cloropropano (BCP) per 1 ml di omogenato del campione. Agitare le provette con forza per 15 s e procedere per isolare l&#39;RNA totale secondo le istruzioni 24 del produttore. </li></ol></li><li> Poliadenilato mRNA Purificazione da RNA totale isolato <ol><li> Purificare mRNA poliadenilato utilizzando kit o protocolli disponibili. <ol><li> Agitare accuratamente per risospendere ciascuna delle seguenti soluzioni: soluzione vincolante, oligo (dT) perle di polistirene, e soluzione di lavaggio 2x. Assicurarsi che il oligo (dT) perline calda a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li><li> Trasferire 120 ml di soluzione di eluizione per la preparazione in un tubo e si riscalda a 70 ° C su una piastra riscaldante. </li><li> Pipetta fino a 500 mg di RNA totale in una provetta. Con l&#39;acqua priva di nucleasi, regolare il volume a 250 ml. </li><li> Aggiungere 250 ml di soluzione vincolante 2x alla RNA totale cosìluzione e brevemente vortex per mescolare il contenuto. </li><li> Aggiungere 15 ml di oligo (dt) perline e vortex accuratamente per mescolare. </li><li> Incubare la miscela a 70 ° C per 3 min. </li><li> Rimuovere il campione dal blocco di riscaldamento e lasciar riposare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Centrifugare a 15.000 xg per 2 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante, lasciando dietro di sé circa 50 ml. </li><li> Aggiungere 500 ml di soluzione di lavaggio per risospendere il pellet pipettando. </li><li> Pipettare la sospensione in un set di tubi filtro rotativo / collezione. </li><li> Centrifugare a 15.000 xg per 2 min. Rimuovere la colonna dal tubo di raccolta e scartare il flow-through. Riportare la colonna a tubo di raccolta. </li><li> Pipettare 500 ml di soluzione di lavaggio sul filtro rotativo. </li><li> Centrifugare a 15.000 x g per 2 minuti. </li><li> Trasferire il filtro rotativo in un tubo di raccolta fresca. </li><li> Pipettare 50 ml di soluzione di eluizione riscaldataa 70 ° C sul centro del filtro rotativo. </li><li> Incubare per 2-5 minuti a 70 ° C. Centrifugare a 15.000 xg per 1 min. </li><li> Pipettare un ulteriore 50 ml di soluzione di eluizione riscaldata a 70 ° C sul centro del filtro rotativo. </li><li> Ripetere il passo 1.2.2.1.18. </li></ol></li><li> Aggiungere 100 mg glicogeno / mL, 0,1 volumi di tampone di 3 M acetato di sodio (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo assoluto. Precipitato durante la notte a -80 ° C. </li><li> Centrifugare a 15.000 xg per 25 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%. Centrifugare a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C. Rimuovere con attenzione l&#39;etanolo. </li><li> A secco in aria per 3-5 minuti. </li><li> Aggiungere 10 ml di acqua priva di nucleasi per dissolvere il pellet. </li><li> Conservare a -70 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> RNA qualificazione e quantificazione <ol><li> Utilizzando uno spettrofotometro, determinare la concentrazione di RNA da noting l&#39;assorbanza a 260 nm e 280 nm. Il rapporto A 260 / A 280 dovrebbe essere 1,8-2,2. </li><li> Controllare la qualità del campione di RNA utilizzando 0,8% gel elettroforesi 25. NOTA: L&#39;RNA totale eucariotica intatto dovrebbe mostrare intense bande 28S e 18S rRNA. Il rapporto di 28S contro intensità banda 18S rRNA per una buona preparazione RNA è ~ 2. </li></ol></li></ol> 2. elettroforesi su gel e di trasferimento NOTA: I protocolli di preparazione del buffer sono riportati nella tabella 1. <ol><li> Formaldeide Gel di Preparazione (1%) <ol><li> Risciacquare tutte le apparecchiature elettroforesi con dietilpirocarbonato acqua (DEPC). </li><li> Sciogliere 2.5 g di agarosio in 215 mL di acqua DEPC completamente in un forno a microonde. </li><li> Aggiungere 12,5 ml di 10x 3- (N-morfolino) propanosulfonico (MOPS) buffer e 22,5 ml di formaldeide al 37%. </li><li> Versare il tutto nell&#39;apparecchio elettroforesi con un pettine 1,5 mm di spessore. </li><li> Eliminare le bolle o spingere torlo per i bordi del gel con un pettine pulito. </li><li> Lasciare il gel solidificare a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparazione del campione <ol><li> Mescolare 1-10 mg di RNA totale e 11,3 ml di tampone campione. </li><li> Mescolare 2 ug del marcatore RNA (1 mg / mL) con 11.3 ml di tampone campione. </li><li> Aggiungere acqua priva di nucleasi ai campioni da 2.2.1 e 2.2.2 ad un volume totale di 16 microlitri. </li><li> Riscaldare a 60 ° C per 5 minuti, e poi raffreddare su ghiaccio. </li><li> Mescolare 16 microlitri del campione da 2.2.3 con 4 ml di colorante inseguimento, che contiene 0,1 mg / mL di bromuro di etidio in ghiaccio. ATTENZIONE: il bromuro di etidio è forse teratogeno e tossico se inalato. Leggi bromuro di etidio scheda di sicurezza. </li></ol></li><li> elettroforesi <ol><li> Aggiungere 200 ml di 10x tampone MOPS a 1.800 ml di DDH 2 O per fare un tampone di corsa 1x MOPS. </li><li> Utilizzare il tampone di corsa 1x MOPS per sciacquare i pozzetti del gel. </li><li> Pre-run tegli gel a 20 V per 5 min. </li><li> Caricare i campioni di RNA nei pozzetti del gel. </li><li> Coprire con un foglio per evitare l&#39;esposizione alla luce. Eseguire a 35 V per circa 17 ore (durante la notte) </li><li> Esaminare e fotografare il gel sotto una luce UV. </li></ol></li><li> Trasferimento <ol><li> Tagliare il gel per rimuovere la parte non utilizzata. </li><li> Preparare 500 ml di 10x tampone SSC (250 mL di 20x tampone SSC e 250 mL di acqua DEPC). </li><li> Lavare il gel due volte con 10x tampone SSC per 20 minuti con agitazione a 50 giri al minuto. </li><li> Tagliare 1 filtro foglio di carta grande abbastanza per servire come una carta stoppino, che assorbe buffer di trasferimento dalla sezione Trasferimento (Figura 1). </li><li> Tagliare 4 pezzi di carta da filtro per la stessa dimensione del gel. </li><li> Tagliare 1 foglio di membrana di nylon caricata positivamente alla stessa dimensione come il gel. </li><li> Tracciare una tacca sul gel e la membrana come marcatore per assicurare il corretto orientamento. </li><li> Immergere la membrana in tampone SSC 2x per 15 min. </li><li> Versare 500 ml of 10x SSC tampone nel cassetto di trasferimento. </li><li> Disporre il grande foglio di carta filtrante attraverso la piastra di vetro e bagnare la carta da filtro con il tampone di trasferimento. </li><li> Stendete le bolle con una pipetta. </li><li> Immergere 2 pezzi di carta da filtro pre-tagliati in buffer di trasferimento e metterli al centro della carta da filtro dal punto 2.4.5. Rimuovere eventuali bolle. </li><li> Posare il gel superiore rivolto verso il basso sulla carta da filtro. </li><li> Disporre la membrana sulla superficie del gel. Allineare le tacche del gel e la membrana. </li><li> Mettere 2 pezzi di carta filtro pre-taglio sulla parte superiore della membrana e bagnare la carta da filtro con il tampone di trasferimento. </li><li> Rimuovere eventuali bolle tra gli strati. </li><li> Applicare pellicola intorno al gel di garantire che gli asciugamani assorbono solo fino tampone passa attraverso il gel e la membrana. </li><li> Stack i tovaglioli di carta sulla parte superiore della carta da filtro. </li><li> Inserire un lastra di vetro di grandi dimensioni sulla parte superiore degli asciugamani. </li><li> Collocare un peso in cima alla pila. </li><li>Mantenere notte per consentire l&#39;RNA di trasferire dal gel alla membrana. </li></ol></li></ol> 3. Rilevamento di N 6 -methyladenosine <ol><li> membrana reticolazione <ol><li> Mantenere la membrana umida nel tampone 2x SSC. </li><li> Mettere 2 fogli di carta da filtro immersa con 10x SSC tampone in reticolante UV. </li><li> Posizionare la membrana sulla parte superiore della carta da filtro, con il lato di RNA-adsorbito rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Selezionare &quot;modalità autocrosslink&quot; (120.000 μJ) e premere il pulsante &quot;Start&quot; per avviare l&#39;irradiazione. </li><li> Esaminate la membrana ed il gel con UV immagine Gel collettore per confermare il trasferimento RNA dal gel alla membrana. </li></ol></li><li> immunoblotting <ol><li> Bloccare la membrana in latte scremato 5% in soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 (TBST) tampone a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare tre volte con tampone TBST per 15 min. </li><li> Incubare la membrana durante la notte in m 6 A (&lt;em&gt; soluzione N 6 -methyladenosine) anticorpo (1: 1.000 in 5% senza grassi del latte tampone TBST) a 4 ° C. </li><li> Lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 min. </li><li> Incubare la membrana nella soluzione HRP-coniugato asino anti-coniglio anticorpo (1: 2.000 in tampone latte TBST 5% non grassa) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 min. </li><li> Applicare il substrato chemiluminescente potenziato (0,125 ml per cm 2 di membrana). </li><li> Cattura il chemiluminescenza con le impostazioni ottimali del imager digitale, secondo le istruzioni del produttore 26. </li></ol></li><li> m 6 una quantificazione <ol><li> Misurare la relativa m 6 A intensità chemiluminescente utilizzando il software ImageJ. <ol><li> Sotto il menu del software ImageJ, selezionare l&#39;opzione &quot;File&quot; per aprire il file pertinente. </li><li> Selezionare lo strumento &quot;Rettangolo&quot; da ImageJ e disegnare una cornice intornoi segnali. </li><li> Se RNA ribosomiale non è il focus degli esperimenti, evitare le 18S e 28S RNA ribosomiale m 6 fasce A per il calcolo. </li><li> Fai clic su &quot;Comando&quot; e &quot;1&quot; per confermare la corsia selezionato. </li><li> Premere il tasto &quot;Comando&quot; e &quot;3&quot; per mostrare la trama selezionata. </li><li> Fare clic sullo strumento &quot;Straight&quot; e tracciare le linee per separare l&#39;area segmentata. </li><li> Fare clic sullo strumento &quot;Bacchetta&quot; per registrare le misurazioni. </li><li> Esportare i dati. </li><li> Normalizzare i livelli di m 6 A con la 18S RNA ribosomiale banda dalla colorazione bromuro di etidio. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Mishima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-Northern+Blotting%3A+Detection+of+RNA+Modifications+by+Using+Antibodies+against+Modified+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides.</a> PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).</li>
<li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA+modifications+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le modifiche dell'RNA hanno un ruolo importante nella funzione e nella fisiologia cellulare. L'attuale comprensione della regolazione, della funzione e dell'omeostasi di queste modifiche è ancora in fase di esplorazionee ampliamento. Pertanto, è necessario un metodo preciso e gold standard per valutare le modifiche dell'RNA. Il metodo del northern blotting modificato fornisce una quantificazione precisa delle modifiche dell'RNA e una chiara delineazione delle modifiche nei diversi RNA. Sebbene il metodo richieda almeno 3 giorni, può essere standardizzato e può essere utilizzato in vari disegni sperimentali. Inoltre, con diversi anticorpi, può rilevare diverse modificazioni dell'RNA27.
È importante separare i diversi RNA quando si analizzano le modifiche dell'RNA. L'RNA ribosomiale comprende gran parte della quantità totale di RNA28,29. I risultati dell'analisi delle modifiche dell'RNA solo nell'RNA totale rappresenteranno principalmente le variazioni dell'rRNA. La metilazione e altre modifiche simili dell'rRNA potrebbero potenzialmente mascherare i cambiamenti in altri RNA. Con la procedura di separazione su gel, le modifiche dell'mRNA e di altri piccoli RNA possono essere analizzate in modo più accurato.
La mappatura dell'intero trascrittoma con immunoprecipitazione e sequenziamento di m6A fornisce informazioni dettagliate sulla modifica di ciascun tipo di RNA22. Fornisce informazioni sugli RNA specifici e una risoluzione di circa 80-120 bp. Sebbene m6A-Seq possa confrontare le modifiche tra diverse condizioni sperimentali, la selezione di standard e controlli appropriati per tali esperimenti è difficile18. L'immunoprecipitazione è difficile da riprodurre, spesso con variazioni significative tra le ripetizioni. Inoltre, m6A-Seq richiede la frammentazione di campioni di RNA prima dell'immunoprecipitazione e del sequenziamento30. Il processo di frammentazione potrebbe potenzialmente indurre influenze indebite sulle modifiche originali dell'RNA. Se l'esperimento non ha bisogno delle informazioni specifiche del gene ma richiede condizioni diverse per il confronto, il metodo attuale fornisce una migliore visualizzazione e controllo per diverse configurazioni sperimentali. 
La modifica dell'RNA è un passo importante nella regolazione del controllo trascrizionale31. Tuttavia, l'omeostasi e i meccanismi di regolazione di varie modificazioni dell'RNA in diversi ambiti fisiologici non sono ancora chiari. Utilizzando l'attuale metodo del northern blotting modificato, è possibile quantificare e confrontare diverse modificazioni dell'RNA. Inoltre, i cambiamenti e le regolazioni delle modificazioni dell'RNA possono essere studiati in modo più dettagliato. In futuro, potrebbe anche essere possibile combinare i dati sperimentali provenienti sia dal northern blotting classico che dai protocolli di northern blotting modificati, fornendo maggiori informazioni sulla biologia dell'RNA.
Il fattore più importante che determina il successo del protocollo di northern blotting modificato è l'integrità del campione di RNA. Gli RNA con una certa quantità di degradazione possono produrre buoni risultati di northern blotting classico, ma questo potrebbe potenzialmente avere un impatto significativo sui risultati del northern blotting modificati. Anche le modifiche dell'RNA in diversi tessuti o linee cellulari potrebbero variare in modo significativo. È importante testare i carichi di campioni di RNA adatti per i diversi tessuti prima di eseguire gli esperimenti finali.
Poiché le procedure di blotting sono state tradizionalmente denominate in onore del Dr. Southern e di diverse direzioni geografiche, proponiamo il nome di blotting "nord-orientale" per la tecnica attuale.

Le modifiche dinamiche e reversibili dell'RNA hanno un ruolo importante nell'omeostasi dell'RNA. Quattro decenni fa, le modifiche della N 6-metiladenosina (m6A) sono risultate abbondanti nei trascrittomi eucariotici1. Hanno diverse funzioni nell'RNA messaggero (mRNA), nell'RNA ribosomiale (rRNA), nell'RNA nucleolare piccolo, nell'RNA di trasferimento e nel microRNA2. Le modificazioni m6A dell'mRNA influenzano il loro splicing3, la traduzione4, la degradazione5 e la localizzazione2. Inoltre, influenzano la biogenesi dei ribosomi e la funzione dei microRNA6. La conservazione evolutiva delle modificazioni dell'RNA m6A è nota nei batteri unicellulari negli esseri umani pluricellulari7. La delineazione dei ruoli delle modifiche m6A è attualmente oggetto di un'ampia esplorazione. Si prevede che gli sforzi forniranno nuove informazioni sul controllo della trascrizione. Studi recenti rivelano che anche altre modifiche chimiche dell'mRNA8 svolgono un ruolo critico nel metabolismo dell'RNA. 
I ritmi circadiani9, la pluripotenza delle cellule staminali10, il metabolismo dei trigliceridi4, la fibrosi11, l'obesità12 e la depressione maggiore13 sono alcuni esempi di processi in cui le modifiche m6A sono note per controllare i risultati. Molti trascritti del gene dell'orologio circadiano hanno siti m6A14. La modulazione della m6A metilasi o della demetilasi provoca variazioni del periodo circadiano15. Mettl3, una m6A transferasi, è un regolatore per la pluripotenza delle cellule staminali. Una carenza di Mettl3 porta a una letalità embrionale precoce e a un priming aberrante del lignaggio nella fasepost-impianto 10. Un deficit di massa grassa e obesità associata (FTO), una m6A demetilasi, negli adipociti influenza la mobilizzazione degli acidi grassi e il peso corporeo attraverso la regolazione posttrascrizionale di Angptl44. Questi studi rivelano che l'm6A non solo controlla l'elaborazione dell'mRNA, ma svolge anche un ruolo critico nello sviluppo embriologico e nella fisiopatologia. La funzione delle modificazioni m6A ha implicazioni per le considerazioni terapeutiche in futuro.
Sono disponibili diversi metodi per misurare le modifiche m6A dell'RNA16-18. Tradizionalmente, la cromatografia su strato sottile (TLC) e la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) sono utilizzate per studiare la distribuzione di m6A in diversi RNA19,20. La spettrometria di massa è uno strumento sensibile per la rilevazione di modificazioni m6A nell'RNA. Tuttavia, l'RNA deve essere asportato dalla RNasi in brevi frammenti prima dell'analisi mediante spettrometria di massa21. L'immunoprecipitazione e il sequenziamento del metil-RNA (m6A-Seq)22 immunoprecipita gli RNA frammentati con anticorpi m6A-specifici ed esegue il sequenziamento parallelo dell'RNA. Questo metodo genera paesaggi di m6A a livello di trascrittoma. La mappatura ad alta risoluzione di m6A con risoluzione a singolo nucleotide (miCLIP) mappa ulteriormente le modifiche di m6A con una risoluzione a singolo nucleotide23. Entrambi i metodi forniscono dettagli sulla modifica di m6A nell'intero trascrittoma, con informazioni specifiche sui geni. Tuttavia, le quantificazioni e la standardizzazione in entrambi i metodi sono difficili se gli esperimenti richiedono il confronto di più condizioni. Inoltre, le frammentazioni dell'RNA per m6A-Seq alterano la struttura originale dell'RNA, che può influenzare i livelli nativi di m6A. Per rilevare le modificazioni globali dell'RNA m6A e i loro cambiamenti in diverse condizioni sperimentali, riportiamo un metodo che impiega un protocollo di northern blotting modificato. Questo metodo risolve l'RNA in base al peso molecolare, utilizzando l'elettroforesi su gel18. Questa procedura fornisce una migliore standardizzazione e quantificazione per gli esperimenti che coinvolgono più condizioni o campioni. Fornisce inoltre informazioni specifiche sulla modifica m6A per diversi RNA, siano essi rRNA, mRNA o microRNA.

<table><tbody><tr><td>Soluzione RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td>Protocollo 1.1</td></tr><tr><td>TRI Soluzione reagente</td><td>Ambion</td><td>AM9738</td><td>Protocollo 1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-Bromo-3-cloropropano (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td>Protocollo 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>JTbaker</td><td>8006</td><td>Protocollo 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Protocollo 1.2.1.3</td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep Kit</td><td>Sigma</td><td>MRN70</td><td>Protocollo 1.2.2.1</td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td>Protocollo 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Fluka</td><td>71183</td><td>Protocollo 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9930</td><td>Protocollo 1.2.2.6</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Protocollo 2.1.1</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>JT Baker</td><td>Protocollo A426</td><td>2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Protocollo 2.1.3</td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide al 37%</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Protocollo 2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA, sale disodico</td><td>JT Baker</td><td>8993</td><td>Protocollo 2.1.3 10x MOPS</td></tr><tr><td>tampone formammide</td><td>Sigma</td><td>F7503</td><td>Protocollo 2.2.1</td></tr><tr><td>RNA Millennium Marker</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td>Protocollo 2.2.2</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td>Protocollo 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>Protocollo 2.2.5 colorante tracciante</td></tr><tr><td>Blu bromofenolo</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td>Protocollo 2.2.5 colorante tracciante</td></tr><tr><td>Xilene Cianolo FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>Protocollo 2.2.5 colorante tracciante</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio diidrato</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Protocollo 2.4.2 20x tampone SSC</td></tr><tr><td>Citrato trisodico</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Protocollo 2.4.2 20x tampone SSC</td></tr><tr><td>Carta assorbente</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Protocollo RPN6101M 2.4.4</td></tr><tr><td>Membrana GE Hybond-N+ Protocollo</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td>2.4.6</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>Protocollo 3.1.2</td></tr><tr><td>Gel Catcher 1500</td><td>Tecnologia ANT</td><td>Gel Catcher 1500</td><td>Protocollo 3.1.5</td></tr><tr><td>Anti-m6A (N6-metiladenosina)</td><td>Sistemi sinaptici</td><td>202003</td><td>Protocollo 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd intero Ab</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td>Protocollo 3.2.5</td></tr><tr><td>Sistema ChemiDoc MP</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>Protocollo 3.2.8</td></tr></tbody></table>

un metodo per l&#39;rna di misura<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modifiche di cellule e tessuti

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N 6-Metiladenosina (m6A) Le modifiche dell'RNA sono diverse e onnipresenti tra gli eucarioti. Si verificano in mRNA, rRNA, tRNA e microRNA. Studi recenti hanno rivelato che queste modifiche reversibili dell'RNA influenzano lo splicing, la traduzione, la degradazione e la localizzazione dell'RNA. Molteplici processi fisiologici, come i ritmi circadiani, la pluripotenza delle cellule staminali, la fibrosi, il metabolismo dei trigliceridi e l'obesità sono controllati anche dalle modificazioni m6A. L'immunoprecipitazione/sequenziamento, la spettrometria di massa e il northern blotting modificato sono alcuni dei metodi comunemente impiegati per misurare le modifiche di m6A. Qui, presentiamo una tecnica di blotting nord-orientale per misurare le modifiche di m6A. L'attuale protocollo fornisce una buona separazione dimensionale dell'RNA, una migliore accomodazione e standardizzazione per vari disegni sperimentali e una chiara delineazione delle modifiche di m6A in varie fonti di RNA. Mentre è noto che le modificazioni m6A hanno un impatto cruciale sulla fisiologia umana in relazione ai ritmi circadiani e all'obesità, il loro ruolo in altri stati (pato)fisiologici non è chiaro. Pertanto, le indagini sulle modificazioni di m6A hanno un'immensa possibilità di fornire informazioni chiave sulla fisiologia molecolare.

Dopo 14 giorni nel normale fase circadiana luce-buio, i topi wild-type sono stati collocati in buio costante. Gli RNA dal fegato sono stati campionati ad intervalli di 4 ore e studiate con modificato blotting settentrionale. La metilazione di rRNA, mRNA, e piccoli RNA erano chiaramente rilevata (Figura 2). Il confronto tra differenti tempi circadiani (CT) può essere accuratamente calcolata con lo standard 18S rRNA. C&#39;era robusta oscillazione circadiana di m 6 livelli A in rRNA, mRNA, e piccoli RNA. Per evitare l&#39;interferenza offerto da rRNA, RNA poliadenilato possono essere purificate, come al punto 1.2.2. Dopo la purificazione, l&#39;rRNA può essere sostanzialmente eliminato per consentire una migliore visualizzazione di altri RNA (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figura 1: Montaggio della unità di trasferimento macchia. è indicata l&#39;unità di trasferimento capillare per asciugare l&#39;RNA alla membrana. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> Figura 2: il ritmo circadiano delle m 6 levels in C57BL / 6J. Questa figura mostra la m 6 A blot di RNA totale da fegati di topi wild-type sacrificato il primo giorno della fase dark-scuro dopo 14 giorni di una normale fase leggera-buio a 4 h intervalli. La quantificazione è stata effettuata utilizzando il m 6 A differenza di densità delle immagini tra 18S e 28S rRNA. La m 6 A abbondanza stato normalizzato alla banda 18S rRNA dal gel formaldeide in basso.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> Figura 3: I m 6 una macchie con o senza rRNA. Rappresentante m sono mostrati 6 una macchie del totale RNA e l&#39;RNA poliadenilato dal fegato di topi wild-type. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> 10x tampone MOPS (pH 7,0, proteggere dalla luce) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> MOPS </td><td> 41.85 </td><td> g </td><td> 0.2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Acetato di sodio </td><td> 4.1 </td><td> g </td><td>0,05 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA, Disodium Salt </td><td> 3.7 </td><td> g </td><td> 0,01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> acqua DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Totale </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Mescolare a temperatura ambiente </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> 20x tampone SSC (pH 7,0) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Cloruro di sodio </td><td> 175,3 </td><td> g </td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> citrato trisodico </td><td> 88.3 </td><td> g </td><td> 0.3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> acqua DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Totale </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> Mescolare a temperatura ambiente, poi in autoclave </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> Dye monitoraggio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Buffer 10x MOPS </td><td> 500 </td><td> microlitri </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ficoll 400 </td><td> 0.75 </td><td> g </td><td> 15% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> bromofenolo blu </td><td> 0.01 </td><td> g </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> xilene cianolo </td><td> 0.01 </td><td> g </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> acqua DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Totale </td><td> 5 </td><td> mL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Conservare a -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> acqua DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Diluire il rapporto a 1: 1.000 di DEPC in DDH 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Mescolare notte a temperatura ambiente, poi in autoclave </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> tampone campione (riparo dalla luce) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Buffer 10x MOPS </td><td> 200 </td><td> microlitri </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37% di formaldeide </td><td> 270 </td><td> microlitri </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> formammide </td><td> 660 </td><td> microlitri </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Conservare a -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table> Tabella 1: Tamponi e soluzioni.

Un metodo di blotting nord modificato per misurare N 6 -methyladenosine (m 6 a) delle modifiche in RNA è descritto. L&#39;attuale metodo in grado di rilevare le modifiche in diversi RNA e controlli sotto vari disegni sperimentali.

Un metodo per l&#39;RNA di misura<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modifiche di cellule e tessuti

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

L'obiettivo generale della tecnica di northern blot modificata è misurare le modifiche di N6-metiladenosina, n6A, nell'RNA e rilevare tali modifiche in diversi tipi di RNA. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sul ruolo dell'epigenetica dell'RNA, come le modifiche della N6-metiladenosina. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una separazione efficace dell'RNA, una migliore standardizzazione dei disegni sperimentali e una chiara definizione delle modifiche n6A negli RNA.Questo metodo può fornire informazioni sulle modifiche n6A nell'RNA e può essere applicato anche ad altre modifiche dell'RNA utilizzando diversi anticorpi di rilevamento. Per iniziare l'esperimento, spruzzare la soluzione di decontaminazione da ribonucleasi su tovaglioli di carta e pulire le pipette e le superfici del banco da laboratorio. Inumidire i tovaglioli di carta con acqua libera da nucleasi e pulire nuovamente le pipette e le superfici del banco da laboratorio.Prelevare una soluzione per l'isolamento dell'RNA mantenuta a quattro gradi Celsius e aggiungere un millilitro di tale soluzione a circa 75 milligrammi di tessuto murino. Utilizzare un agitatore magnetico per omogeneizzare il tessuto. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di 1-Bromo-3-cloropropano o BCP per ogni millilitro di omogeneato del campione.Agitare vigorosamente i tubi per 15 secondi ed eseguire l'isolamento dell'RNA totale. Utilizzando uno spettrofotometro, determinare la concentrazione di RNA rilevando l'assorbanza a 260 nanometri e 280 nanometri. Verificare la qualità del campione di RNA eseguendo un'elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8%.Risciacquare tutta l'apparecchiatura per elettroforesi con acqua di dietilpirocarbonato o acqua DEPC. Combinare 2,5 grammi di agarosio e poi 215 millilitri di acqua DEPC in un matraccio Erlenmeyer e sciogliere completamente la miscela in un forno a microonde. Dopo che la soluzione è completamente fusa, aggiungere 12,5 millilitri di tampone MOPS 10X.Aggiungere 22,5 millilitri di formaldeide al 37% al pallone. Quindi versare la soluzione nell'apparato di elettroforesi con un pettine dello spessore di 1,5 millimetri. Utilizzando un pettine pulito, spingere le bolle ai margini del gel.Lasciare solidificare il gel a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzare il tampone di corsa MOPS 1X precedentemente preparato per risciacquare i pozzetti del gel ed eseguire una pre-corretta del gel. Caricare i campioni di RNA nei pozzetti del gel, quindi far correre il gel.Il giorno successivo, esaminare e fotografare il gel sotto luce UV. Per preparare il trasferimento, tagliare il gel e rimuovere la porzione non utilizzata. Preparare 500 millilitri di tampone SSC 10X (saline sodium citrate).Lavare il gel due volte con tampone SSC 10X. Ritagliare un foglio di carta filtro sufficientemente grande da coprire il gel. Ritagliare quattro pezzi di carta filtro delle stesse dimensioni del gel.Successivamente, ritagliare un foglio di membrana di nylon carica positivamente delle stesse dimensioni del gel. Fare un intaglio sul gel e sulla membrana come riferimento per garantire l'orientamento corretto. Immergere la membrana nel buffer 2X SSC.Versare 500 millilitri di tampone SSC 10X nel vassoio di trasferimento. Posizionare il foglio di carta filtro grande sulla lastra di vetro e inumidire la carta filtro con il tampone di trasferimento. Quindi utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali bolle d'aria.Inzuppare due pezzi di carta filtro pre-tagliata nel buffer di trasferimento e posizionarli al centro della carta filtro. Rimuovere eventuali bolle d'aria. Quindi posare il gel, con il lato superiore rivolto verso il basso, sulla carta filtro e appoggiare la membrana sopra il gel, assicurandosi di allineare le tacche del gel e della membrana.Successivamente, posizionare due pezzi di carta filtrante pre-tagliata sopra la membrana. Rimuovere eventuali bolle d'aria tra gli strati. Applicare della pellicola trasparente attorno al gel per assicurarsi che gli stracci assorbano solo il tampone che passa attraverso il gel e la membrana.Quindi, impilare dei fogli di carta assorbente sopra la carta da filtro. Posizionare una lastra di vetro di dimensioni maggiorate sopra i fogli di carta assorbente e apporre un peso sulla sommità dell'impilaggio, lasciando che l'RNA migri dal gel alla membrana per tutta la notte. Al termine del trasferimento, mantenere la membrana umida in tampone 2X SSC.Immergere due fogli di carta filtrante nel tampone SSC 10X, quindi posizionare i fogli nel cross-linker UV. Assicurarsi che il lato della membrana con l'RNA assorbito sia rivolto verso l'alto, quindi appoggiare la membrana sopra la carta filtrante. Selezionare la modalità di cross-linking automatico e premere il pulsante di avvio per iniziare l'irradiazione.Esaminare la membrana e il gel con un sistema di imaging per gel UV per confermare il trasferimento dell'RNA dal gel alla membrana. Bloccare la membrana in una soluzione di latte scremato al 5% in tampone TBST a temperatura ambiente per un'ora. Incubare la membrana in soluzione di anticorpo anti-m6A durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 minuti. Successivamente, incubare la membrana nella soluzione di anticorpo anti-coniglio prodotto in asino coniugato con HRP per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 minuti.Applicare il substrato di chemiluminescenza potenziata. Raccogliere il segnale chemiluminescente mediante un sistema di imaging digitale. Infine, procedere alla quantificazione di m6A e misurare l'intensità chemiluminescente relativa di m6A utilizzando ImageJ. RNA di fegato di topo sono stati campionati a intervalli di quattro ore e analizzati mediante la tecnica di northern blot modificata.La metilazione di rRNA, mRNA e piccoli RNA è stata chiaramente rilevata. Sono stati eseguiti blot rappresentativi per m6A su RNA totale e su RNA privo di rRNA ottenuto da fegati di topi di tipo selvaggio. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in quattro giorni se eseguita correttamente.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica dell'RNA per esplorare gli effetti sulla fisiologia umana legati al ritmo circadiano e all'obesità.

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Qui, viene descritto un saggio in vitro privo di anticorpi per l'analisi diretta dell'attività di metiltransferasi sull'RNA transscritto sintetico o in vitro.

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Il saggio di immunoprecipitazione dell'RNA metilato è un metodo a base di anticorpi utilizzato per arricchire i frammenti di RNA metilati. Accoppiato con il sequenziamento profondo, porta all'identificazione di trascrizioni che trasportano la modifica m5C.

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Il ruolo delle modificazioni dell'RNA nelle infezioni virali sta appena iniziando ad essere esplorato e potrebbe evidenziare nuovi meccanismi di interazione virale-ospite. In questo lavoro, forniamo una pipeline per studiare le modifiche dell'RNA m6A e m5C nel contesto delle infezioni virali.

Esplorare gli epitrascrittomi m6A e m5C sull'infezione virale: un esempio di HIV

Il presente protocollo descrive la preparazione e la misurazione quantitativa di arginina libera e proteina-legata e metil-arginine mediante spettroscopia 1H-NMR.

Esplorazione del metiloma dell'arginina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare

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Caratterizzazione delle modifiche dell'RNA in singoli neuroni utilizzando la spettrometria di massa

Il protocollo fornisce istruzioni per modificare l'RNA con dimetilsolfato per esperimenti di profilazione mutazionale. Include il sondaggio in vitro e in vivo con due metodi alternativi di preparazione della libreria.

Sondare la struttura dell'RNA con profilo mutazionale del dimetilsolfato con sequenziamento in vitro e nelle cellule

Qui presentiamo un protocollo per valutare semi-quantitativamente i livelli globali di m⁶A utilizzando dot blot. L'RNA totale viene estratto, denaturato, maculato su una membrana di nylon, sondato con anticorpi anti-m⁶A e visualizzato tramite chemiluminescenza. L'intensità del segnale, quantificata dall'analisi in scala di grigi ImageJ, riflette l'abbondanza relativa di metilazione, fornendo un flusso di lavoro riproducibile per la ricerca.

Test Dot Blot per Rilevare i Livelli Globali di Modifica dell'RNAN 6-metiladenosina

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Un metodo per l'RNA di misura

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