Un metodo per l'RNA di misura N 6 -methyladenosine modifiche di cellule e tessuti
5 dicembre 2016
Un metodo di blotting nord modificato per misurare N 6 -methyladenosine (m 6 a) delle modifiche in RNA è descritto. L'attuale metodo in grado di rilevare le modifiche in diversi RNA e controlli sotto vari disegni sperimentali.
L'obiettivo generale della tecnica di northern blotting modificata è misurare le modifiche di N6-metiladenosina, n6A nell'RNA e rilevare le modifiche in diversi RNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo dell'epigenetica dell'RNA, come le modifiche della N6-metiladenosina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce l'efficace separazione dell'RNA, una migliore standardizzazione per i disegni sperimentali e una chiara delineazione della modifica n6A negli RNA.
Questo metodo può fornire informazioni sulle modifiche dell'n6A nell'RNA e può anche essere applicato ad altre modifiche dell'RNA con diversi anticorpi di rilevamento. Per iniziare l'esperimento, spruzzare la soluzione di decontaminazione con ribonucleasi su tovaglioli di carta e pulire le pipette e le superfici del banco di laboratorio. Inumidisci i tovaglioli di carta con acqua priva di nucleasi e pulisci nuovamente le pipette e le superfici del banco da laboratorio.
Ottenere una soluzione di isolamento dell'RNA mantenuta a quattro gradi Celsius e aggiungere un millilitro della soluzione a circa 75 milligrammi di tessuto di topo. Utilizzare un agitatore ad asta per omogeneizzare il tessuto. Quindi, aggiungere 100 microlitri di 1-Bromo-3-cloropropano o BCP per un millilitro di campione omogeneizzato.
Agitare energicamente le provette per 15 secondi e procedere all'isolamento totale dell'RNA. Utilizzando uno spettrofotometro, determinare la concentrazione di RNA annotando l'assorbanza a 260 nanometri e 280 nanometri. Controllare la qualità del campione di RNA eseguendo l'elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8%.
Sciacquare tutte le apparecchiature per elettroforesi con dietilpirocarbonato o acqua DEPC. Unire 2,5 grammi di agarosio, quindi 215 millilitri di acqua DEPC in un pallone di Erlenmeyer e sciogliere completamente il composto in un forno a microonde. Dopo che la soluzione si è sciolta, aggiungere 12,5 millilitri di tampone MOPS 10X.
E 22,5 millilitri di 37% di formaldeide nel pallone. Quindi versare la soluzione nell'apparecchio di elettroforesi con un pettine di 1,5 millimetri di spessore. Usando un pettine pulito, spingi le bolle sui bordi del gel.
Lasciare solidificare il gel a temperatura ambiente. Quindi, utilizzare il tampone da corsa 1X MOPS precedentemente preparato per risciacquare i pozzetti del gel e pre-eseguire il gel. Caricare i campioni di RNA nei pozzetti del gel, quindi eseguire il gel.
Il giorno successivo, esamina e fotografa il gel sotto una luce UV. Per preparare il trasferimento, tagliare il gel e rimuovere la parte inutilizzata. Preparare 500 millilitri di soluzione salina 10X citrato di sodio o tampone SSC.
Lavare il gel due volte con il tampone SSC 10X. Taglia un foglio di carta da filtro abbastanza grande da coprire il gel. Taglia quattro pezzi di carta da filtro della stessa dimensione del gel.
Quindi, taglia un foglio di membrana di nylon caricata positivamente della stessa dimensione del gel. Segna una tacca sul gel e sulla membrana come pennarello per garantire il corretto orientamento. Immergere la membrana in tampone SSC 2X.
Versare 500 millilitri di tampone SSC 10X nel vassoio di trasferimento. Stendere il foglio di carta da filtro grande sulla lastra di vetro e bagnare la carta da filtro con il tampone di trasferimento. Quindi utilizzare una pipetta per stendere eventuali bolle.
Immergere due pezzi di carta da filtro pretagliata nel tampone di trasferimento e posizionarli al centro della carta da filtro. Rimuovi eventuali bolle. Quindi appoggiare il gel con la parte superiore rivolta verso il basso sulla carta da filtro e appoggiare la membrana sopra il gel, assicurandosi di allineare le tacche del gel e della membrana.
Quindi, posiziona due pezzi di carta da filtro pretagliata sopra la membrana. Rimuovi eventuali bolle tra gli strati. Applicare un involucro di plastica attorno al gel per assicurarsi che gli asciugamani assorbano solo il tampone passando attraverso il gel e la membrana.
Quindi impila i tovaglioli di carta sopra la carta da filtro. Posiziona una lastra di vetro di grandi dimensioni sopra gli asciugamani e posiziona un peso sopra la pila e lascia che l'RNA si trasferisca dal gel alla membrana durante la notte. Dopo il trasferimento, mantenere la membrana umida in un tampone SSC 2X.
Immergere due fogli di carta da filtro con tampone SSC 10X, quindi posizionare i fogli nel reticolante UV. Assicurati che il lato assorbito dall'RNA sia rivolto verso l'alto, quindi posiziona la membrana sopra la carta da filtro. Selezionare la modalità di collegamento incrociato automatico e premere il pulsante di avvio per avviare l'irradiazione.
Esaminare la membrana e il gel con un catturatore di immagini su gel UV per confermare il trasferimento dell'RNA dal gel alla membrana. Bloccare la membrana nel latte scremato al 5% nel tampone TBST a temperatura ambiente per un'ora. Incubare la membrana per una notte in una soluzione di anticorpi m6A a quattro gradi Celsius.
Il giorno successivo, lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 minuti. Successivamente, incubare la membrana nella soluzione di anticorpi anti-coniglio d'asino coniugato HRP per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 minuti.
Applicare il substrato a chemiluminescenza potenziata. Cattura la chemiluminescenza con un imager digitale. Infine, passare alla quantificazione m6A e misurare l'intensità relativa della chemiluminescenza m6A utilizzando l'immagine J.Gli RNA epatici di topo sono stati campionati a intervalli di quattro ore e studiati con la tecnica del northern blotting modificata.
La metilazione di rRNA, mRNA e piccoli RNA è stata chiaramente rilevata. Sono stati eseguiti blot m6A rappresentativi per l'RNA totale e senza rRNA dal fegato di topi wild type. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se eseguita correttamente.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica dell'RNA per esplorare gli impatti sulla fisiologia umana legati al ritmo circadiano e all'obesità.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo di northern blotting modificato per misurare le modificazioni N6-metiladenosina (m6A) nell'RNA. La tecnica consente il rilevamento di modificazioni in diversi campioni di RNA ed è applicabile in vari disegni sperimentali.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Epigenetica dell'RNA
- Modificazioni m6A
- Tecniche sperimentali
Sfondo
- La N6-metiladenosina è una significativa modificazione dell'RNA.
- Comprendere le modificazioni dell'RNA è cruciale per acquisire informazioni sulla regolazione genica.
- I metodi attuali per rilevare m6A sono limitati.
- Questa tecnica modificata mira a migliorare il rilevamento e l'analisi.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per rilevare le modificazioni m6A nell'RNA.
- Migliorare la comprensione dell'epigenetica dell'RNA.
- Fornire un approccio standardizzato per vari disegni sperimentali.
Metodi utilizzati
- Isolamento dell'RNA da tessuto di topo.
- Elettroforesi per la valutazione della qualità dell'RNA.
- Trasferimento dell'RNA su una membrana di nylon.
- Rilevamento utilizzando anticorpi m6A e chemiluminescenza.
Principali risultati
- Rilevamento riuscito di modificazioni m6A in rRNA, mRNA e piccoli RNA.
- Delineazione chiara delle modificazioni m6A in vari campioni di RNA.
- La tecnica può essere eseguita in modo efficiente entro quattro giorni.
Conclusioni
- La tecnica di northern blotting modificata è efficace per studiare le modificazioni dell'RNA.
- Questo metodo apre strade per la ricerca nell'epigenetica dell'RNA.
- Le potenziali applicazioni includono studi sui ritmi circadiani e l'obesità.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of RNA N6-methyladenosine (m6A) modifications supports target validation in RNA epigenetics by enabling quantitative assessment of epitranscriptomic regulation. This method enhances predictive confidence in mechanistic studies linking m6A to physiological processes such as circadian rhythms and metabolism. It provides a standardized, reproducible platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of m6A-dependent RNA stability, translation, and splicing to clarify functional roles of epigenetic regulators in gene expression networks.
- Operational Value: Provides clear delineation of m6A across RNA species, supporting biomarker-relevant target identification in disease models.
- Predictive Value: Facilitates dose-response and time-course analysis of m6A levels, improving confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative chemiluminescent readouts compatible with high-resolution imaging for comparative analysis across experimental conditions.
- Operational Value: Standardizes RNA transfer and detection via nylon membrane and antibody-based probing, reducing variability in modification profiling.
- Assay Readiness: Enables side-by-side comparison of modified and unmodified RNA controls, supporting assay validation for epigenetic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links m6A dynamics in liver RNA to metabolic and circadian phenotypes, supporting translational biomarker exploration in preclinical models.
- Operational Value: Permits longitudinal sampling (e.g., four-hour intervals) to capture temporal modification patterns relevant to physiological rhythms.
- Risk Mitigation: Reduces ambiguity in RNA modification measurements, improving reproducibility in target validation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing epigenetic layer validation that complements transcriptional and proteomic profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of m6A writers, erasers, and readers through direct measurement of modification status in RNA.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for assessing compound effects on epitranscriptomic marks in cell-based or tissue-derived systems.
- Analytics: Enables image-based quantification of m6A signal intensity, facilitating statistical comparison across treatment groups or genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects epigenetic changes in RNA to physiological outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical progression.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various RNA types and modification-specific antibodies, allowing reuse across multiple epigenetic targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of RNA epigenetic targets through direct, modification-specific detection.
- Operational Value: Standardized workflow with defined transfer, blocking, and detection steps ensuring inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying the functional relevance of m6A in disease-relevant pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on quantifiable modification dynamics.
Implementation Considerations
- Expertise in RNA handling, electrophoresis, and immunoblotting techniques is required.
- Instrumentation includes UV crosslinker, digital imager, and spectrophotometer for RNA quantification.
- Standardization across teams requires consistent use of DEPC-treated solutions and controlled transfer conditions.
- Adaptation to other RNA modifications depends on availability of specific modification-recognizing antibodies.
- Practical limitations include RNA degradation risk and the need for optimization of antibody incubation and washing conditions.
