Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell'ormone in colture cellulari primarie umane
11 novembre 2016
Qui, descriviamo le impostazioni per monitorare in parallelo la bioluminescenza circadiana e l'attività secretoria delle cellule insulari umane e dei miotubi primari. Per questo, abbiamo impiegato la somministrazione genica lentivirale di un reporter di clock con nucleo di luciferasi, seguita dalla sincronizzazione in vitro e dalla raccolta del terreno di deflusso mediante perifusione cellulare continua.
L'obiettivo generale di questa procedura è la valutazione parallela della bioluminescenza circadiana e dell'attività secretoria di cellule endocrine primarie umane coltivate e sincronizzate in vitro. Questo metodo può aiutare a studiare il modello temporale della secrezione cellulare e come può essere regolato da orologi circadiani autonomi dalle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di monitorare le luciferine circadiane come reporter e, contemporaneamente, raccogliere il mezzo di deflusso per misurare i livelli di ormoni secreti e miochine. Per introdurre i reporter di bioluminescenza circadiana nelle cellule primarie mediante trasduzione lentivirale, in primo luogo, trasferire le piastre di Petri da 3,5 cm contenenti mioblasti umani al 30%-50% di confluenza in una cappa a flusso laminare. Sostituire il terreno di coltura dei mioblasti umani con 2 ml di terreno di crescita. Quindi trasdurre la coltura cellulare primaria pipettando la soluzione di lentivirus nella piastra per ottenere una molteplicità di infezioni pari a tre. Incubare le cellule per una notte in un incubatore per colture tissutali. Cambiare il mezzo il giorno successivo. Per ottenere la sincronizzazione in vitro, aggiungere 10 micromolari di attivatore dell'adenilil ciclasi in 2 mL di terreno per piastra di Petri da 3,5 cm contenente le cellule primarie precedentemente trasfettate. Incubare le cellule per 60 minuti a 37
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio descrive metodi per monitorare la bioluminescenza circadiana insieme all'attività secretoria di cellule insulari umane e miotubi primari. L'approccio prevede la trasduzione genica lentivirale di un reporter luciferasico del core clock, seguita da sincronizzazione in vitro e perfusione continua delle cellule per la raccolta del mezzo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Cronobiologia
Sfondo
- I ritmi circadiani svolgono un ruolo cruciale nelle funzioni cellulari.
- Il monitoraggio della bioluminescenza può fornire informazioni sull'attività cellulare.
- Le cellule delle isole pancreatiche umane sono fondamentali per la secrezione di insulina.
- I miotubi primari sono importanti per lo studio della fisiologia muscolare.
Scopo dello studio
- Studiare la relazione tra ritmi circadiani e attività secretoria.
- Sviluppare un metodo per il monitoraggio in tempo reale delle funzioni cellulari.
- Migliorare la comprensione dei processi metabolici nelle cellule umane.
Metodi Utilizzati
- Consegna genica mediante lentivirus per l'espressione di un reporter luciferasico.
- Sincronizzazione in vitro di colture cellulari.
- Perfusione continua per la raccolta del mezzo.
- Misurazione della bioluminescenza per valutare i ritmi circadiani.
Risultati principali
- Monitoraggio riuscito della bioluminescenza circadiana nelle cellule delle isole pancreatiche umane.
- Attività secretoria dimostrata nei miotubi primari.
- Sviluppo di un metodo affidabile per lo studio dei ritmi cellulari.
- Forniti nuovi spunti sulle interazioni tra biologia circadiana e funzione cellulare.
Conclusioni
- Lo studio propone un approccio innovativo per monitorare le attività cellulari in tempo reale.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dell'influenza dei ritmi circadiani sul metabolismo.
- Applicazioni potenziali nella ricerca sul diabete e nella fisiologia muscolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione parallela dell'espressione genica dell'orologio circadiano e della secrezione ormonale in colture cellulari primarie umane consente un'analisi diretta della regolazione temporale nei sistemi endocrino e muscolare umani. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi, collegando gli oscillatori molecolari circadiani a risultati funzionali di secrezione. L'integrazione di queste misurazioni nella fase di scoperta supporta l'avanzamento calibrato sui rischi di programmi metabolici e di cronobiologia lungo l'intero portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette una riduzione del rischio meccanicistica correlando l'attività dei geni orologio con la secrezione di ormoni e miocine in cellule umane primarie.
- Supporta la validazione funzionale delle target interrompendo i geni orologio fondamentali e quantificando gli effetti secretori a valle.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione dei percorsi per target metabolici ed endocrini.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce sistemi di cellule primarie validati e sincronizzati per lo sviluppo di saggi robusti.
- Fornisce letture quantitative e risolte nel tempo sia dell'espressione genica che dell'attività secretoria.
- Permette una valutazione riproducibile degli effetti di perturbazioni chimiche o genetiche sui prodotti regolati dal ritmo circadiano.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati ottenuti in vitro con la fisiologia umana rilevante per la malattia, utilizzando cellule primarie di isole e muscolo.
- Permette la scoperta di biomarcatori traslazionali collegando il disturbo del clock molecolare a fenotipi funzionali di secrezione.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica nella ricerca metabolica e cronobiologica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo collega la fase iniziale della scoperta alla ricerca preclinica, permettendo la verifica di ipotesi sulla regolazione circadiana in cellule primarie umane, sostenendo sia la validazione del bersaglio che la continuità traslazionale.
- Biologia della scoperta: Consente il test diretto della funzione dei geni circadiani e del loro impatto sui percorsi secretori.
- Screening: Fornisce modelli cellulari primari sincronizzati e pronti per saggi, con output quantitativi per la valutazione di composti.
- Analisi: Genera dati di bioluminescenza e di secrezione risolti nel tempo, per confronti statistici robusti tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il disturbo del clock molecolare a fenotipi secretori rilevanti per le malattie nelle cellule umane.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per valutare la regolazione circadiana in diversi tipi cellulari primari e bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro per misurazioni a lungo termine e parallele in cellule umane primarie.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione collegando uscite molecolari e funzionali in sistemi rilevanti per la malattia.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione basata sul rischio di programmi in ambito metabolico e cronobiologico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella trasduzione lentivirale, nella coltura cellulare primaria e nella misurazione della bioluminescenza.
- Necessita dell'accesso a sistemi di perfusione sincronizzati e a saggi sensibili per ormoni e miocine.
- Richiede una standardizzazione tra team per la raccolta riproducibile di dati in serie temporali.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi tipi cellulari primari o per diversi parametri secretori.
- La stabilità del coltura a lungo termine e del reporter deve essere convalidata per ogni singola applicazione.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
