11 novembre 2016
Qui, descriviamo le impostazioni per monitorare in parallelo la bioluminescenza circadiana e l'attività secretoria delle cellule insulari umane e dei miotubi primari. Per questo, abbiamo impiegato la somministrazione genica lentivirale di un reporter di clock con nucleo di luciferasi, seguita dalla sincronizzazione in vitro e dalla raccolta del terreno di deflusso mediante perifusione cellulare continua.
L'obiettivo generale di questa procedura è la valutazione parallela della bioluminescenza circadiana e dell'attività secretoria di cellule endocrine primarie umane coltivate e sincronizzate in vitro. Questo metodo può aiutare a studiare il modello temporale della secrezione cellulare e come può essere regolato da orologi circadiani autonomi dalle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di monitorare le luciferine circadiane come reporter e, contemporaneamente, raccogliere il mezzo di deflusso per misurare i livelli di ormoni secreti e miochine. Per introdurre i reporter di bioluminescenza circadiana nelle cellule primarie mediante trasduzione lentivirale, in primo luogo, trasferire le piastre di Petri da 3,5 cm contenenti mioblasti umani al 30%-50% di confluenza in una cappa a flusso laminare. Sostituire il terreno di coltura dei mioblasti umani con 2 ml di terreno di crescita. Quindi trasdurre la coltura cellulare primaria pipettando la soluzione di lentivirus nella piastra per ottenere una molteplicità di infezioni pari a tre. Incubare le cellule per una notte in un incubatore per colture tissutali. Cambiare il mezzo il giorno successivo. Per ottenere la sincronizzazione in vitro, aggiungere 10 micromolari di attivatore dell'adenilil ciclasi in 2 mL di terreno per piastra di Petri da 3,5 cm contenente le cellule primarie precedentemente trasfettate. Incubare le cellule per 60 minuti a 37
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Questo studio descrive metodi per monitorare la bioluminescenza circadiana insieme all'attività secretoria delle cellule isolane umane e dei miotubi primari. L'approccio prevede la consegna genica lentivirale di un reporter del core clock della luciferasi, seguita da sincronizzazione in vitro e perifusione continua cellulare per la raccolta del mezzo.
Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures enables direct interrogation of temporal regulation in human endocrine and muscle systems. This approach enhances predictive confidence in target validation by linking molecular circadian oscillators to functional secretory outputs. Integrating these measurements at the discovery stage supports risk-adjusted advancement of metabolic and chronobiology programs across the portfolio.
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing of circadian regulation in human primary cells, supporting both target validation and translational continuity.