Name: Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Impara la tecnica microchirurgica per creare un anello arterovenoso nel ratto, utile per studiare l'angiogenesi e ingegnerizzare tessuti vascolarizzati. Questo metodo consente di analizzare la vascolarizzazione in vivo e sviluppare soluzioni personalizzate per il trapianto.

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Vorremmo ringraziare le seguenti istituzioni per sostenere la nostra ricerca ciclo AV: Staedtler Stiftung, il Dr. Fritz Erler Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Ufficio per genere e la diversità, la Forschungsstiftung Medizin , Friedrich-Alexander di Erlangen-Norimberga (FAU), AO Foundation, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Hans Georg Geis Foundation, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), Germania, e il Ministero dell&#39;Istruzione superiore e della ricerca scientifica, l&#39;Iraq. Vorremmo ringraziare Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Kohn e Ilse Arnold-Herberth per la loro eccellente supporto tecnico.

Il Comitato Animal Care del Friedrich-Alexander di Erlangen-Norimberga (FAU) e il governo della Media Franconia, in Germania, ha approvato tutti gli esperimenti. Per gli esperimenti, i ratti Lewis maschi con un peso corporeo di 300 - sono stati usati 350 g. 1. The Loop Modello artero nel ratto <ol><li> Impianto Procedura (Figura 2) <ol><li> Per anestesia utilizzare una scatola di plastica speciale che è collegata tramite tubo al vaporizzatore isoflurano e chiusa da un coperchio. Accendere fornitura di gas e flussometro tra 0,8-1,5 L / min. </li><li> Posizionare il topo nella scatola di plastica induzione e sigillare la parte superiore. Attivare vaporizzatore isoflurano al 5%. </li><li> Osservare attentamente il ratto durante l&#39;induzione dell&#39;anestesia. Dopo 3 - 4 min, il ratto saranno anestetizzati. </li><li> Verificare il corretto anestesia: la perdita del riflesso di raddrizzamento, perdita del riflesso palpebrale, riflesso di ritiro, riflesso corneale positivo. </li><li> Rimuovere il ratto dalla scatola e controllare la suapeso per il calcolo dei farmaci. Applicare una pomata oculare per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Somministrare farmaci antidolorifici e antibiotici (ad es., 7,5 mg / kg per via sottocutanea enrofloxacina (SC), 12,5 mg / kg di tramadolo e 100 mg / kg metamizolo sia per via endovenosa (iv)). Somministrare cristalloidi peso-adattato durante il funzionamento (ad es., 30 ml / kg sc). </li><li> Posizionare il topo sul dorso su una piastra riscaldante a 37 ° C sotto anestesia con 1 - 2% inalazione isoflurano somministrata tramite maschera. </li><li> Monitorare l&#39;anestesia correttamente e aumentare isoflurano se il livello di anestesia è troppo bassa (il movimento del ratto, risposta al dolore, il tono della mascella, nessuna perdita di riflessi (vedi 1.1.4.), La frequenza cardiaca aumentando). Fare attenzione a non overdose isoflurano (perdita dei riflessi corneali, alta frequenza cardiaca, diminuzione della saturazione di ossigeno). Utilizzare una speciale pulsossimetria per piccoli animali per controllare la saturazione di ossigeno (95 - 100%) e la frequenza cardiaca (250 - 450 / min) del ratto. Durante gli operatiil monitoraggio della temperatura del ratto (36 - 40 ° C) e regolare la temperatura della piastra riscaldante, se necessario. </li><li> Shave lati interni degli arti posteriori con un rasoio elettrico e disinfettare la zona con antisettici. Distribuire gli arti posteriori e fissarli con nastro adesivo. </li><li> Posare il topo sotto un microscopio chirurgico e coprire il ratto con drappeggio sterile. Assicurarsi che l&#39;intera procedura di intervento viene eseguito in condizioni di sterilità. </li><li> Aprire la pelle nel mezzo della coscia sinistra con una incisione longitudinale dal ginocchio superiore all&#39;inguine con un bisturi (No. 10). </li><li> Tagliare il tessuto sottocutaneo e fascia in strati di circa 3 cm di lunghezza con le forbici dissezione e microforceps finché il fascio vascolare femorale viene esposto dalla arteria pelvica nell&#39;inguine alla biforcazione dell&#39;arteria femorale del ginocchio. </li><li> Separare i vasi e rimuovere l&#39;avventizia con le forbici avventizia e microforceps. </li><li> Coagulare il lato bRANCHES utilizzando la coagulazione elettrica. Coprire il campo operatorio con un impacco umido. </li><li> Aprire la pelle sul lato destro come descritto per il lato sinistro, 1.1.11 - 1.1.14. </li><li> Per la raccolta del graft venoso, legare destra vena femorale per coagulazione elettrica sulla estremità prossimale e distale ad una distanza di 1 - 1,5 cm. </li><li> Rimuovere l&#39;innesto venoso con microforceps e lavare l&#39;innesto venoso con una soluzione di eparina (50 UI / ml in soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%) con una cannula di irrigazione e trasferirlo alla coscia sinistra. Coprire il campo operatorio sul lato destro con una compressa umida. </li><li> Legare la vena femorale sul lato sinistro prossimalmente alla regione inguinale con un morsetto microvasi. Coagulare vena femorale distalmente mediante coagulazione elettrica, al ginocchio superiore prima ramificazione, ad una distanza di circa 2 cm. </li><li> Per anastomosi collegare l&#39;estremità prossimale dell&#39;innesto venoso con l&#39;estremità prossimale della vena da end-to-end anastomosi con un 11-0 Suture. Utilizzare circa 8 punti staccati. Inizia con ponendo i primi due punti di sutura nelle posizioni ore 12 e ore 6. Poi, mettere in 2 per altre 3 suture tra questi punti sul lato anteriore e poi mettere 2 per altre 3 suture nel lato posteriore. </li><li> Legare l&#39;arteria femorale nello stesso modo descritto per la vena femorale (1.1.18.). Assicurarsi che i vasi di loop non siano attorcigliate. Anastomose l&#39;estremità distale del graft venoso con l&#39;estremità prossimale dell&#39;arteria come descritto per la vena femorale (passi 1.1.19.). </li><li> Somministrare 25 UI di eparina per via endovenosa. Fare di nuovo che i vasi di loop non siano attorcigliate, rimuovere i morsetti e verificare la presenza di perdite e pervietà del ciclo per circa 5 minuti. </li><li> Papaverina Dribble (ad esempio, 4 mg / ml) sulle navi per evitare spasmi vascolari. Se c&#39;è pervietà, il ciclo si espande e si può osservare il polso dell&#39;arteria. </li><li> Precompilare la camera di fissaggio con la prima metà (circa 500 ml) della matrice (ad esempio &lt;/ Em&gt;, un idrogel o una matrice ossea con o senza cellule). Incorporare il loop nella camera di impiantazione. </li><li> Riempire la camera impiantazione con la seconda metà della matrice ad un volume totale di 1000 ml. Sigillare la camera con il coperchio della camera. </li><li> Fissare la camera di fissaggio sulla coscia con un non-assorbibile 6-0 suture. Fissare il coperchio della camera con un non-assorbibile 6-0 suture. Smettere di eventuali sanguinamenti con la coagulazione elettrica. </li><li> Chiudere la pelle con assorbibili 4-0 punti di sutura. Coprire la ferita con spray in alluminio. </li><li> Somministrare antibiotici e analgesici (ad esempio, 7,5 mg / kg sc enrofloxacina, tramadolo 12,5 mg / kg per os (PO) (attraverso l&#39;acqua potabile) per 3 - 5 giorni e poi a seconda del comportamento del ratto). </li><li> Girare il vaporizzatore fuori e lasciare il ratto di respirare i gas di alimentazione fino a quando non comincia a svegliarsi. </li><li> Posizionare il topo in una scatola con supporto termico e osservare con attenzione fino alla completa guarigione. </li><li> Non lasciare le Nazioni Unite topofrequentato fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. </li><li> Non restituire il ratto alla compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. </li></ol></li><li> procedura espianto <ol><li> Eseguire l&#39;espianto dopo un breve tempo o di lunga data di impianto (secondo il disegno dello studio, per gli esempi si veda Bibliografia 27-32). Anestetizzare il topo indicato ai punti 1,1,1-1.1.9. </li><li> Aprire la pelle dell&#39;addome con un bisturi (No. 10) e spostare l&#39;intestino parte con una compressa. Esporre l&#39;aorta addominale e le tamponi di cotone vena cava caudalis utilizzando. </li><li> Cannulate l&#39;aorta addominale (ad es., 24 calibro plastica cannula) e tagliare la vena cava caudale con le forbici dissezione. </li><li> Lavare l&#39;aorta addominale con soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% contenente 100 IU / ml di eparina fino il liquido è chiaro. Profumato l&#39;aorta con 30 ml di soluzione di perfusione (ad es., Il contrasto agente o l&#39;India inK). </li><li> Euthanize ratto mediante iniezione di una dose letale di embutramide, mebezonium ioduro, soluzione tetracaina cloridrato iniettabile (0.1 - 0.2 ml / kg) in anestesia profonda. </li><li> Legare l&#39;aorta addominale e la vena cava caudalis con un non-assorbibile sutura 4-0. </li><li> Chiudere l&#39;area ferita aperta con 1 - 2 pinze. Conservare il ratto per 24 ore a 4 ° C (polimerizzazione della soluzione di perfusione). </li><li> Posizionare il topo sul dorso. Distribuire gli arti posteriori e fissarli con nastro adesivo. </li><li> Aprire la pelle sopra la camera con una incisione longitudinale con un bisturi (No. 10). </li><li> Rimuovere il tessuto connettivo dalla camera e il peduncolo ciclo con le forbici dissezione e microforceps. Tagliare il peduncolo ciclo ad una distanza di 1 cm dalla apertura della camera con le forbici dissezione e rimuovere la camera. </li><li> Aprire il coperchio della camera e rimuovere con attenzione il costrutto dalla camera con una pinza e fissarlo in 4% soluzione di formalina tamponata per 24 ore a cameratemperatura. Successivamente utilizzare il costrutto per il 3D micro-tomografia computerizzata o inclusi in paraffina per l&#39;analisi istologica 30. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per oltre un decennio, abbiamo utilizzato con successo il ciclo (AV) artero per scopi di ingegneria tissutale e l&#39;angiogenesi studiare in vivo nel piccolo modello animale. Potremmo dimostrare che questo modello di microchirurgia è molto adatto per l&#39;ingegneria dei tessuti diversi e che può essere utilizzato anche per studi di angiogenesi o antiangiogenesi. Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi / Tessuti o organi ingegne...

La maggior parte dei tessuti e organi del corpo umano sono dipendenti da una rete di vasi sanguigni funzionale che fornisce nutrienti, scambia gas e rimuove i residui. Malfunzionamento del sistema causati da problemi vascolari locali o sistemici può portare a una moltitudine di malattie gravi. Inoltre, in aree di ricerca quali l&#39;ingegneria tissutale o medicina rigenerativa, una rete di vasi sanguigni funzionali all&#39;interno dei tessuti generati artificialmente o organi trapiantati è indispensabile per l&#39;applicazione clinica di successo. Per decenni i ricercatori hanno studiato gli esatti meccanismi coinvolti nella crescita vascolare al fine di conoscere più a fondo le situazioni patologiche al fine di trovare nuovi interventi terapeutici e fornire una migliore prevenzione dei disturbi vascolari. Nella prima fase, processi di base quali le interazioni cellula-cellula o l&#39;effetto di molecole sulle cellule del sistema vascolare sono solitamente studiati in vitro 2D o 3Desperimenti. modelli 2D tradizionali sono di facile esecuzione, sono ben noti e hanno contribuito notevolmente ad una migliore comprensione di questi processi. Per la prima volta nel 1980, Folkman et al. segnalato nell&#39;angiogenesi vitro semina delle cellule endoteliali capillari sulla gelatina piastre rivestite 1. Questo ha dato immediatamente modo per pubblicazione di una moltitudine di ulteriori esperimenti angiogenesi 2D su tubo cellule endoteliali formazione test 2, dosaggio migrazione 3 e la co-coltura di tipi cellulari 4, così come gli altri. Questi test sono ancora in uso oggi e accettato come standard metodi in vitro. Tuttavia, questa configurazione sperimentale non è sempre appropriato per lo studio del comportamento delle cellule in vivo poiché la maggior parte tipi cellulari richiedono un ambiente 3D per formare pertinenti strutture dei tessuti fisiologici 5. Si è potuto dimostrare che l&#39;architettura della matrice 3D è decisiva per capillare morphogenesiS 6 e che le interazioni cellula-extra matrice extracellulare (ECM) e cultura 3D condizioni regolano importanti fattori coinvolti nella angiogenesi tumorale 7. La matrice 3D fornisce ingressi meccanici complessi, in grado di legare le proteine ​​effettrici e stabilire gradienti di concentrazione del soluto dei tessuti scala. Inoltre, si ritiene necessario per imitare in morfogenetica vivo e passaggi rimodellamento dei tessuti complessi 5. In questi sistemi, sia angiogenesi e vasculogenesi possono essere studiate. Mentre angiogenesi descrive la germinazione dei capillari da vasi sanguigni preesistenti 8, vasculogenesi si riferisce alla formazione de novo dei vasi sanguigni attraverso le cellule endoteliali o dei loro progenitori 9,10. La maturazione dei vasi è descritto in un processo chiamato &#39;arteriogenesis&#39; attraverso il reclutamento delle cellule muscolari lisce 11. Un angiogenico tipico modello in vitro è la germinazione delle cellule endoteliali da monostrato esistentes testa di serie come un monostrato su superfici gel, sulla superficie di microsfere incorporati all&#39;interno di un gel o con la costruzione di sferoidi di cellule endoteliali 12. Nei modelli vascolare cellule endoteliali singoli sono intrappolate in un gel 3D. Essi interagiscono con le cellule endoteliali adiacenti per formare strutture e reti de novo vascolari, tipicamente in combinazione con cellule di supporto 12. Tuttavia, anche complessa in 3D in modelli in vitro non possono mimare nelle impostazioni vivo completamente dato il gran numero di cellula-cellula e cellula-ECM Interazioni 13. Le sostanze con un&#39;elevata attività in vitro non mostrano automaticamente gli stessi effetti in vivo e viceversa 14. Per un&#39;analisi completa di vascolarizzazione processi vi è un urgente bisogno di sviluppare modelli in vivo che meglio simulano la situazione nel corpo. Una vasta gamma di test in vivo di angiogenesi sono descritti in letteratura, tra cui lasaggio pulcino chorioallantoic membrana (CAM), il modello di pesce zebra, il saggio di angiogenesi corneale, il modello di sacca d&#39;aria dorsale, la camera di dorsali plica, i modelli di tumore sottocutaneo 14. Tuttavia, questi test sono spesso associate a limitazioni, come ad esempio i cambiamenti morfologici rapidi, i problemi nel distinguere nuovi capillari da quelli già esistenti nel test CAM, o lo spazio limitato nel saggio di angiogenesi corneale 15. Inoltre, vengono utilizzati sistemi non mammiferi (ad es., Il modello zebrafish 16), che porta a problemi xenotrapianto 17. Nel modello di tumore sottocutaneo, angiogenesi originari soltanto dal tumore stesso non può essere analizzato in quanto il tessuto adiacente contribuisce notevolmente al processo di vascolarizzazione. Inoltre, il tessuto circostante può avere un ruolo decisivo nel plasmare il microambiente tumorale 18. Non solo per lo studio dell&#39;angiogenesi o vasculogenesi c&#39;è un forte NEEd un standardizzato e ben caratterizzato modello in vivo, ma anche per lo studio delle diverse strategie di vascolarizzazione in ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. Oggi, la generazione di organi artificiali complessi o tessuti è possibile sia in vitro che in vivo. 3D bioprinting fornisce una tecnica di fabbricazione on-demand per la generazione di tessuti viventi funzionale complesso 3D 19. Inoltre, bioreattori possono essere utilizzati per generare tessuti 20 o persino il proprio corpo può essere utilizzato come bioreattore 21. Tuttavia, la barriera principale per applicazione di successo di tessuti generati artificialmente è la mancanza di vascolarizzazione all&#39;interno dei costrutti ingegnerizzati. collegamento immediato vascolare dell&#39;ospite dopo il trapianto è un presupposto fondamentale per la sopravvivenza, specialmente nel caso di tessuti artificiali larga scala o organi. Diverso in vitro o in vivo strategie prevascularization erano develpato per stabilire una microcircolo funzionale costrutti prima dell&#39;impianto 22. L&#39;impianto di un ponteggio con in vitro capillari ingegnerizzati preformati sulla pelle dorsale di topi ha portato ad una rapida anastomosi vascolare topi entro un giorno 23. Al contrario, una co-coltura sferoide costituito da cellule staminali mesenchimali umane della vena ombelicale e cellule endoteliali umane assemblate in una rete prevascolare tridimensionale sviluppato ulteriormente dopo l&#39;impianto in vivo. Tuttavia, anastomosi con il sistema vascolare host è stato limitato 24. Soprattutto, in difetti poco vascolarizzati, come le aree necrotiche o irradiate, questa cosiddetta estrinseca vascolarizzazione - la crescita interna dei vasi della zona circostante in patibolo - spesso non riesce. Vascolarizzazione intrinseca, invece, si basa su un asse vascolare come fonte di nuovi capillari germinazione nella scaffold 25. Utilizzando l&#39;approccio vascolarizzazione assiale, L&#39;ingegneria tessutale può essere trapiantato con il suo asse vascolare e collegato alle navi locali nel sito ricevente. Immediatamente dopo il trapianto, il tessuto è adeguatamente supportato da ossigeno e sostanze nutritive, che crea le condizioni per l&#39;integrazione ottimale. A causa della limitata disponibilità di modelli per lo studio dell&#39;angiogenesi in vivo e in riconoscimento della crescente importanza di generare tessuti assialmente vascolarizzato, abbiamo sviluppato l&#39;approccio microchirurgico di Erol e Spira ulteriormente per generare un loop (AV) artero nel modello animale 26. L&#39;uso di una camera di impiantazione completamente chiusa rende questo metodo molto adatto per studiare la formazione di vasi sanguigni in &quot;controllata&quot;, ben caratterizzata in condizioni in vivo (Figura 1). Questo modello non è utile solo per le indagini di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per la vascolarizzazione assiale di ponteggi per Engin tessutofini eering.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio 0,9%</td><td>Berlin-Chemie AG</td><td>34592508</td><td></td></tr><tr><td>11-0 Ethilon / poliammide 6/6</td><td>Ethicon</td><td>EH7438G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl / poligalattina 910</td><td>Ethicon</td><td>V392H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Prolene / polipropilene</td><td>Ethicon</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>spray all'alluminio</td><td>Pharma Partner Vertriebs-GmbH</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>antisettici&nbsp;</td><td>BODE Chemie GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catetere&nbsp;</td><td>B Braun Meslungen AG</td><td>4251612-02</td><td></td></tr><tr><td>agente di contrasto</td><td>Flowtech</td><td>&nbsp; MV-122</td><td></td></tr><tr><td>embutramide, ioduro di mebezonio, soluzione iniettabile di tetracaina cloridrato&nbsp;</td><td>Intervet International GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>encre de chine inchiostro di china intenso</td><td>Lefranc & Bourgeois</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>unguento per gli occhi</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalina 4%</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG</td><td>P087.4</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>isoflurano&nbsp;</td><td>Abbott Laboratories</td><td>6055482</td><td></td></tr><tr><td>ratto Lewis, maschio</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamizol-Natrium&nbsp;</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>papaverine / Paveron N</td><td>Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tramadol / Tramal</td><td>Gr&uuml; nenthal GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

il arterovenosa (av) loop in un modello di piccoli animali per studiare angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

Una rete di vasi sanguigni funzionale è un prerequisito per la sopravvivenza e la crescita di quasi tutti i tessuti e organi del corpo umano. Inoltre, in situazioni patologiche come il cancro, la vascolarizzazione gioca un ruolo di primo piano nella progressione della malattia. Di conseguenza, vi è una forte necessità di un modello in vivo standardizzato e ben caratterizzato al fine di chiarire i meccanismi della neovascolarizzazione e sviluppare diversi approcci di vascolarizzazione per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa.
Descriviamo un approccio microchirurgico per un piccolo modello animale per l'induzione di un asse vascolare costituito da una vena e un'arteria che sono anastomizzate a un'ansa arterovenosa (AV). L'ansa AV viene trasferita in una camera di impianto chiusa per creare un microambiente isolato in vivo, che è collegato all'organismo vivente solo per mezzo dell'asse vascolare. Utilizzando l'imaging 3D (risonanza magnetica, micro-CT) e l'immunoistologia, il sistema vascolare in crescita può essere visualizzato nel tempo. Impiantando diverse cellule, fattori di crescita e matrici, la loro funzione nella formazione della rete di vasi sanguigni può essere analizzata senza alcuna influenza di disturbo dall'ambiente circostante in un ambiente ben controllabile. 
Oltre agli studi di angiogenesi e antiangiogenesi, il modello AV loop è anche perfettamente adatto per l'ingegnerizzazione di tessuti vascolarizzati. Dopo un certo tempo di prevascolarizzazione, i tessuti generati possono essere trapiantati nel sito difettoso e collegati microchirurgicamente ai vasi locali, garantendo così l'immediato afflusso di sangue e l'integrazione del tessuto ingegnerizzato. Variando le matrici, le cellule, i fattori di crescita e l'architettura della camera, è possibile generare vari tessuti, che possono poi essere adattati alle esigenze del singolo paziente.

Ingegneria dei tessuti Per scopi di ingegneria del tessuto osseo, diversi sostituti ossei sono stati impiantati nel piccolo animale ratto modello ciclo AV 27,28,33,34. Vascolarizzazione potrebbe perfettamente essere dimostrata da 3D micro-tomografia computerizzata (micro-CT) (Figura 3A). Vascolarizzazione di una matrice bovina elaborato osso spugnoso (PBCB) è risultata significativamente più alta nel gruppo ciclo rispetto al gruppo senz...

Descriviamo un approccio microchirurgico per la generazione di un loop arterovenosa (AV) come un modello di analisi vascolarizzazione in vivo in un ambiente isolato e ben caratterizzato. Questo modello non è solo utile per l&#39;indagine di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per l&#39;ingegneria vascolarizzato assialmente e tessuti trapiantabili.

Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

L'obiettivo generale di questo approccio microchirurgico è creare un circuito arterovenoso per l'ingegnerizzazione di tessuti assiali, vascolarizzati e trasferibili, nonché per l'analisi della vascolarizzazione in vivo e in un ambiente isolato e ben caratterizzato. Con questo metodo, possiamo utilizzare i nostri corpi come bioreattori viventi per la generazione di diversi tipi di tessuti vascolarizzati assialmente, personalizzati in base alle esigenze del singolo paziente. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il tessuto ottenuto può essere trapiantato mantenendo il suo accesso vascolare e collegato ai vasi locali nel sito ricevente, garantendo un immediato apporto di ossigeno e nutrienti.Oltre agli studi di ingegneria tissutale, questo metodo può fornire informazioni sui processi di angiostenosi in un organismo vivente. Può inoltre essere applicato a situazioni patologiche, come l'angiogenesi tumorale. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà a causa dell'elevata complessità dell'intervento chirurgico, quale l'anastomosi microscopica di vasi submillimetrici.L'idea iniziale di questo metodo è nata quando ci siamo trovati di fronte a casi clinici con difetti tissutali estesi, che richiedevano il trapianto di tessuto vascolarizzato aloogeno creando una significativa mobilità nel sito donatore. Dopo aver confermato un'adeguata anestesia, pesare il ratto per calcolare le dosi dei farmaci. Successivamente, applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione durante l'anestesia.Dopo aver somministrato farmaci analgesici e antibiotici, posizionare il ratto su un tappetino riscaldante e somministrare continuamente isoflurano. Quindi, verificare nuovamente il livello di anestesia mediante pinzatura del dito del piede. Se possibile, utilizzare anche l'ossimetria del polso per controllare il livello di anestesia del ratto.Procedere con la rasatura delle facce interne degli arti posteriori. Quindi disinfettare l'area chirurgica con alternati lavaggi di betadina e alcol. Successivamente, divaricare gli arti posteriori e fissarli con nastro adesivo.Infine, posizionare il ratto sotto un microscopio chirurgico e coprirlo con un campo sterile. Procedere con l'intervento utilizzando procedure sterili. Aprire la cute nella parte mediale della coscia sinistra con un'incisione longitudinale che va dal ginocchio superiore all'inguine, utilizzando un bisturi.Successivamente, utilizzando forbici da dissezione e pinzette microchirurgiche, tagliare il tessuto sottocutaneo e la fascia in strati lunghi circa tre centimetri. Fermarsi quando il fascio vascolare femorale è esposto dall'arteria pelvica nell'inguine fino al ginocchio. Successivamente, utilizzando forbici per tessuti adiposi e pinzette microchirurgiche, separare i vasi ed asportare il tessuto adiposo.Se necessario, coagulare i rami laterali mediante coagulazione elettrica. Al termine, coprire la zona operata con una compressa umida e ripetere la procedura sul lato destro del ratto. A questo punto, con la prima procedura completata in modo simmetrico, procedere al prelievo del graft venoso.Prima di tutto, legare la vena femorale destra mediante coagulazione elettrica alle estremità prossimale e distale per ottenere un innesto di circa uno a 1,5 centimetri. Successivamente, rimuovere l'innesto venoso con pinzette microchirurgiche. Per dilatare l'apertura dell'innesto venoso, utilizzare il dilatatore per vasi.Quindi, lavare l'innesto venoso con una soluzione di eparina utilizzando una cannula per irrigazione. Trasferire l'innesto scarnificato alla coscia sinistra e coprire il campo operatorio sul lato destro con un compressa umida. Successivamente, legare la vena femorale sul lato sinistro in prossimit&agrave; della regione inguinale mediante una pinza per microvasi.Quindi coagulare la vena femorale in posizione distale, vicino all'estremit&agrave; superiore del ginocchio, prima della biforcazione. Per l'anastomosi, connettere l'estremit&agrave; prossimale del graft venoso con l'estremit&agrave; prossimale della vena utilizzando una tecnica end-to-end con un punto di sutura 11-0. Iniziare posizionando i primi due punti di sutura alle posizioni delle 12 e delle 6.Quindi, inserire due o tre punti di sutura aggiuntivi tra questi punti sulla faccia anteriore. E successivamente posizionare altri due o tre punti di sutura sulla faccia posteriore. L'anastomosi dei vasi a loop è il passaggio più critico del protocollo.È importante assicurarsi che le suture vengano eseguite con la massima precisione possibile per ridurre il rischio e la chiusura dei vasi a circuito chiuso. Successivamente, legare l'arteria femorale con una pinza per microvasi ed utilizzare la coagulazione elettronica, in modo analogo alla legatura della vena femorale. Prima di procedere, verificare che i vasi a circuito chiuso non siano attorcigliati.Quindi, anastomizzare l'estremità distale del graft venoso con l'estremità prossimale dell'arteria, utilizzando la stessa tecnica di sutura illustrata in precedenza. Dopo la seconda anastomosi, somministrare 25 UI di eparina per via endovenosa. A questo punto, verificare attentamente che i vasi del loop non siano torsionati e quindi rimuovere le pinze.Osservare il loop per circa cinque minuti, verificando la presenza di perdite e la pervietà. Se c'è pervietà, il loop si espanderà e il polso dell'arteria sarà visibile. Durante l'osservazione, lasciare gocciolare papaverina sui vasi per prevenire spasmi vascolari.Successivamente, riempire preliminarmente la camera di impianto con la prima metà della miscela di matrice, circa mezzo millilitro. Quindi, incorporare l'ansa all'interno della camera di impianto. Chiudere l'ingresso della camera con due coaguli di fibrina e riempire la camera con la seconda metà della miscela di matrice, per un volume totale di un millilitro.Ora, posizionare la camera sulla coscia, sigillare la camera con il suo coperchio e fissare il coperchio con un punto di sutura non riassorbibile 6-0. Successivamente, fissare la camera di impianto alla coscia con un ulteriore punto di sutura non riassorbibile 6-0. Arrestare qualsiasi sanguinamento mediante coagulazione elettrica.Infine, chiudere la cute con punti riassorbibili 4-0 e coprire la ferita con spray all'alluminio. A scopo di ingegneria tissutale ossea, sono stati impiantati diversi tipi di sostituti ossei nel modello del piccolo animale ratto con loop arterovenoso (A-V). La vascolarizzazione è stata osservata mediante tomografia computerizzata micro-3D.La pre-vascularizzazione di una matrice ossea bovina canicolare processata per sei settimane ha portato a una sopravvivenza superiore degli osteoblasti iniettati. I campioni sono stati raccolti, sezionati e colorati in diversi momenti successivi all'impianto. Ad esempio, la colorazione con ematossilina ed eosina ha mostrato che l'uso di un sostituto osseo a base di fosfato tricalcico beta e idrossiapatite insieme a cellule staminali mesenchimali ha determinato numerose connessioni vascolari entro sei settimane.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque o sei ore, se effettuata correttamente. Seguendo questa procedura, una grande varietà di diversi fattori cellulari o anticorpi può essere impiantata per studiare un'ampia gamma di condizioni. Questa tecnica funziona anche in un modello di grande animale, come il circuito venoso dell'agnello.Pertanto, consentirebbe ai ricercatori di generare tessuti vascolarizzati in grandi quantità clinicamente rilevanti. Questo modello potrebbe offrire l'opportunità di studiare la vascolarizzazione in condizioni patologiche. Ad esempio, sarebbe possibile indagare gli effetti di diversi fattori di crescita e cellule durante la formazione della rete vascolare tumorale.

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La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in...

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Vascolarizzazione è la chiave per approcci in ingegneria dei tessuti successo. Pertanto, tecnologie affidabili sono necessari per valutare lo sviluppo di reti vascolari in tessuto-costrutti. Qui vi presentiamo un metodo semplice e conveniente per visualizzare e quantificare vascolarizzazione in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Qui presentiamo un modello murino di insufficienza della fistola arterovenosa (AVF) in cui è incorporata una configurazione anastomotica clinicamente rilevante. Questo modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia e per testare possibili interventi terapeutici.

A Novel Modello murino di fistola artero-venosa Fallimento: la procedura chirurgica in dettaglio

Questa è una linea guida per la costruzione di tessuto vascolarizzato in vivo utilizzando un circuito arterovenoso microchirurgico o una configurazione peduncolare a flusso continuo all'interno di una camera di ingegneria tissutale. I tessuti vascolarizzati generati possono essere impiegati per la rigenerazione degli organi e la sostituzione di difetti tissutali, nonché per test farmacologici e modellazione della malattia.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

L'angiogenesi coinvolge interazioni multi-cellula e multi-sistema che devono essere studiate in un ambiente fisiologicamente rilevante. L'obiettivo di questo studio è dimostrare la capacità del modello di coltura del mesentere di ratto di effettuare confronti time-lapse di reti microvascolari intatte durante l'angiogenesi.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Metodo per Time-Lapse Imaging di coltura Rat mesenteriche microvascolari Networks

Attualmente qualsiasi tipo di composito vascularized allotransplantation dipende lungo-termine-immunosoppressione, difficile da sostenere per indicazioni non-vita-critici. Vi presentiamo un nuovo tibial VCA modello porcino che può essere utilizzato per studiare osso VCA e viene illustrato l'utilizzo dell'angiogenesi chirurgico per mantenere la vitalità dell'osso senza la necessità di modulazione immunitaria a lungo termine.

Chirurgica dell'angiogenesi in porcina Allotransplantation Tibial: un nuovo grande osso animale vascolarizzato Allotransplantation composito modello

Vi presentiamo un protocollo per isolare frammenti adiposo microvascolari derivate dal tessuto che rappresentano le unità di vascolarizzazione promettenti. Possono essere isolati rapidamente, non richiedono l'elaborazione in vitro e, pertanto, può essere utilizzato per un passo prevascularization in diversi campi dell'ingegneria dei tessuti.

L&#39;isolamento di Murine adiposo derivate dal tessuto microvascolare Frammenti come vascolarizzazione Unità per Tissue Engineering

Questo lavoro dimostra un nuovo approccio per valutare la proliferazione, la differenziazione e il potenziale di formazione delle vascelle di cellule staminali endoteliali (VESCs) attraverso il trapianto di grassi mammarie, seguito da una preparazione del tessuto a tutto sesto per l'osservazione microscopica. Viene inoltre presentata una strategia di tracciamento delle linee per indagare il comportamento dei VESC in vivo .

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.

In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

Il presente protocollo propone la creazione di una fistola artero-venosa nei conigli utilizzando una tecnica no-touch modificata. La tecnica prevede l'anastomosi laterale dell'arteria carotide comune e della vena giugulare esterna senza la dissezione dei tessuti perivenosi o il taglio dell'arteria.

Una tecnica modificata per la costruzione della fistola artero-venosa nei conigli

L'angiogenesi da germoglio, fondamentale per lo sviluppo e la malattia, coinvolge complessi processi molecolari e meccanici. Presentiamo un versatile modello ex vivo 2.5D che analizza la germinazione cellulare dalle arterie carotidi suine, rivelando l'angiogenesi rigida-dipendente e la distinta meccanica delle cellule leader-follower. Questo modello aiuta a far progredire le strategie di ingegneria tissutale e gli approcci alla terapia del cancro.

Modello 2.5D per la caratterizzazione meccanica ex vivo dell'angiogenesi da germogliamento in tessuto vivente

Impara la tecnica microchirurgica per creare un anello arterovenoso nel ratto, utile per studiare l'angiogenesi e ingegnerizzare tessuti vascolarizzati. Questo metodo consente di analizzare la vascolarizzazione in vivo e sviluppare soluzioni personalizzate per il trapianto.

Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

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