Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

L'obiettivo generale di questo approccio microchirurgico è creare un circuito arterovenoso per l'ingegnerizzazione di tessuti assiali, vascolarizzati e trasferibili, nonché per l'analisi della vascolarizzazione in vivo e in un ambiente isolato e ben caratterizzato. Con questo metodo, possiamo utilizzare i nostri corpi come bioreattori viventi per la generazione di diversi tipi di tessuti vascolarizzati assialmente, personalizzati in base alle esigenze del singolo paziente. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il tessuto ottenuto può essere trapiantato mantenendo il suo accesso vascolare e collegato ai vasi locali nel sito ricevente, garantendo un immediato apporto di ossigeno e nutrienti.

Oltre agli studi di ingegneria tissutale, questo metodo può fornire informazioni sui processi di angiostenosi in un organismo vivente. Può inoltre essere applicato a situazioni patologiche, come l'angiogenesi tumorale. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà a causa dell'elevata complessità dell'intervento chirurgico, quale l'anastomosi microscopica di vasi submillimetrici.

L'idea iniziale di questo metodo è nata quando ci siamo trovati di fronte a casi clinici con difetti tissutali estesi, che richiedevano il trapianto di tessuto vascolarizzato aloogeno creando una significativa mobilità nel sito donatore. Dopo aver confermato un'adeguata anestesia, pesare il ratto per calcolare le dosi dei farmaci. Successivamente, applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione durante l'anestesia.

Dopo aver somministrato farmaci analgesici e antibiotici, posizionare il ratto su un tappetino riscaldante e somministrare continuamente isoflurano. Quindi, verificare nuovamente il livello di anestesia mediante pinzatura del dito del piede. Se possibile, utilizzare anche l'ossimetria del polso per controllare il livello di anestesia del ratto.

Procedere con la rasatura delle facce interne degli arti posteriori. Quindi disinfettare l'area chirurgica con alternati lavaggi di betadina e alcol. Successivamente, divaricare gli arti posteriori e fissarli con nastro adesivo.

Infine, posizionare il ratto sotto un microscopio chirurgico e coprirlo con un campo sterile. Procedere con l'intervento utilizzando procedure sterili. Aprire la cute nella parte mediale della coscia sinistra con un'incisione longitudinale che va dal ginocchio superiore all'inguine, utilizzando un bisturi.

Successivamente, utilizzando forbici da dissezione e pinzette microchirurgiche, tagliare il tessuto sottocutaneo e la fascia in strati lunghi circa tre centimetri. Fermarsi quando il fascio vascolare femorale è esposto dall'arteria pelvica nell'inguine fino al ginocchio. Successivamente, utilizzando forbici per tessuti adiposi e pinzette microchirurgiche, separare i vasi ed asportare il tessuto adiposo.

Se necessario, coagulare i rami laterali mediante coagulazione elettrica. Al termine, coprire la zona operata con una compressa umida e ripetere la procedura sul lato destro del ratto. A questo punto, con la prima procedura completata in modo simmetrico, procedere al prelievo del graft venoso.

Prima di tutto, legare la vena femorale destra mediante coagulazione elettrica alle estremità prossimale e distale per ottenere un innesto di circa uno a 1,5 centimetri. Successivamente, rimuovere l'innesto venoso con pinzette microchirurgiche. Per dilatare l'apertura dell'innesto venoso, utilizzare il dilatatore per vasi.

Quindi, lavare l'innesto venoso con una soluzione di eparina utilizzando una cannula per irrigazione. Trasferire l'innesto scarnificato alla coscia sinistra e coprire il campo operatorio sul lato destro con un compressa umida. Successivamente, legare la vena femorale sul lato sinistro in prossimità della regione inguinale mediante una pinza per microvasi.

Quindi coagulare la vena femorale in posizione distale, vicino all'estremità superiore del ginocchio, prima della biforcazione. Per l'anastomosi, connettere l'estremità prossimale del graft venoso con l'estremità prossimale della vena utilizzando una tecnica end-to-end con un punto di sutura 11-0. Iniziare posizionando i primi due punti di sutura alle posizioni delle 12 e delle 6.

Quindi, inserire due o tre punti di sutura aggiuntivi tra questi punti sulla faccia anteriore. E successivamente posizionare altri due o tre punti di sutura sulla faccia posteriore. L'anastomosi dei vasi a loop è il passaggio più critico del protocollo.

È importante assicurarsi che le suture vengano eseguite con la massima precisione possibile per ridurre il rischio e la chiusura dei vasi a circuito chiuso. Successivamente, legare l'arteria femorale con una pinza per microvasi ed utilizzare la coagulazione elettronica, in modo analogo alla legatura della vena femorale. Prima di procedere, verificare che i vasi a circuito chiuso non siano attorcigliati.

Quindi, anastomizzare l'estremità distale del graft venoso con l'estremità prossimale dell'arteria, utilizzando la stessa tecnica di sutura illustrata in precedenza. Dopo la seconda anastomosi, somministrare 25 UI di eparina per via endovenosa. A questo punto, verificare attentamente che i vasi del loop non siano torsionati e quindi rimuovere le pinze.

Osservare il loop per circa cinque minuti, verificando la presenza di perdite e la pervietà. Se c'è pervietà, il loop si espanderà e il polso dell'arteria sarà visibile. Durante l'osservazione, lasciare gocciolare papaverina sui vasi per prevenire spasmi vascolari.

Successivamente, riempire preliminarmente la camera di impianto con la prima metà della miscela di matrice, circa mezzo millilitro. Quindi, incorporare l'ansa all'interno della camera di impianto. Chiudere l'ingresso della camera con due coaguli di fibrina e riempire la camera con la seconda metà della miscela di matrice, per un volume totale di un millilitro.

Ora, posizionare la camera sulla coscia, sigillare la camera con il suo coperchio e fissare il coperchio con un punto di sutura non riassorbibile 6-0. Successivamente, fissare la camera di impianto alla coscia con un ulteriore punto di sutura non riassorbibile 6-0. Arrestare qualsiasi sanguinamento mediante coagulazione elettrica.

Infine, chiudere la cute con punti riassorbibili 4-0 e coprire la ferita con spray all'alluminio. A scopo di ingegneria tissutale ossea, sono stati impiantati diversi tipi di sostituti ossei nel modello del piccolo animale ratto con loop arterovenoso (A-V). La vascolarizzazione è stata osservata mediante tomografia computerizzata micro-3D.

La pre-vascularizzazione di una matrice ossea bovina canicolare processata per sei settimane ha portato a una sopravvivenza superiore degli osteoblasti iniettati. I campioni sono stati raccolti, sezionati e colorati in diversi momenti successivi all'impianto. Ad esempio, la colorazione con ematossilina ed eosina ha mostrato che l'uso di un sostituto osseo a base di fosfato tricalcico beta e idrossiapatite insieme a cellule staminali mesenchimali ha determinato numerose connessioni vascolari entro sei settimane.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque o sei ore, se effettuata correttamente. Seguendo questa procedura, una grande varietà di diversi fattori cellulari o anticorpi può essere impiantata per studiare un'ampia gamma di condizioni. Questa tecnica funziona anche in un modello di grande animale, come il circuito venoso dell'agnello.

Pertanto, consentirebbe ai ricercatori di generare tessuti vascolarizzati in grandi quantità clinicamente rilevanti. Questo modello potrebbe offrire l'opportunità di studiare la vascolarizzazione in condizioni patologiche. Ad esempio, sarebbe possibile indagare gli effetti di diversi fattori di crescita e cellule durante la formazione della rete vascolare tumorale.