Name: Utilizzando il Compound Etilene-releasing, acido 2-Chloroethylphosphonic, come strumento per studiare risposta di etilene in batteri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Scopri un metodo sicuro per studiare la risposta batterica all'etilene usando l'acido 2-cloroetilfosfonico (CEPA). Questa tecnica evita l'uso di etilene gassoso e permette di analizzare l'adesione batterica e la colonizzazione delle piante.

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Gli autori ringraziano il Dr. Dario Bonetta per aver fornito i semi di Arabidopsis thaliana e per l'assistenza tecnica per quanto riguarda il test di tripla risposta, così come Simone Quaranta per l'aiuto con FT-IR. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione per la scoperta del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC-DG) a JLS, da una borsa di studio per laureati dell'Ontario (OGS) a RVA e da una borsa di studio per laureati Queen Elizabeth II in Scienza e Tecnologia (QEII-GSST) a AJV.

1. Prodotti chimici <ol><li> Preparare una soluzione di 500 mM CEPA (144.49 g / mol), e una soluzione costituita sia 500 mM NaCl (58.44 g / mol) e 500 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O (137.99 g / mol) in acidificata (pH 2.5) ultra-acqua pura o 0,1 N HCl. Mescolare con un vortice fino a quando le soluzioni sono chiare. </li><li> In serie diluire (10x) le soluzioni 500 mm nello stesso solvente per ottenere 5 mm e 50 titoli mm. </li><li> Preparare una soluzione di 10 mm 1-aminociclopropano acido carbossilico (ACC; 101.1 g / mol) in acqua ultra-pura. </li><li> Filtro-sterilizzare soluzioni di riserva e aliquote conservare a -20 ° C. </li><li> Filtro-sterilizzare cellulasi. Aliquote Conservare a 4 ° C. </li></ol> 2. Verifica Etilene produzione da 2-Chloroethylphosphonic acido di decomposizione: Triple Assay Risposta <ol><li> Surface-sterilizzare Arabidopsis thaliana Ecotipo Columbia Seeds Uso della fase vapore Metodo: ATTENZIONE: Il passo successivo produce tgas di cloro ossico. Condurre la sterilizzazione seme in una cappa aspirante. <ol><li> Ottenere un contenitore sigillabile profondo abbastanza per ospitare un bicchiere di vetro da 250 ml per la sterilizzazione del seme e metterlo in una cappa aspirante. </li><li> Aggiungere A. thaliana semi in una provetta e posizionare il tubo in un rack. Posizionare il rack che contiene il tubo aperto nel contenitore richiudibile. Nota: Non riempire singoli tubi oltre mezzo pieno per consentire al gas di cloro di penetrare i semi inferiori. </li><li> Inserire un becher da 250 ml contenente 100 ml di candeggina commerciale nel contenitore sigillabile. Aggiungere con cautela 3 ml di HCl concentrato alla candeggina e sigillare immediatamente il contenitore con il suo coperchio. ATTENZIONE: Bleach e HCl reagiscono per produrre gas di cloro tossico che agisce in superficie-sterilizzare i semi. </li><li> Incubare i semi in presenza di cloro gassoso per 4 ore in fumehood. Nota: i tempi di sterilizzazione più lunghi ridurre l&#39;efficienza di germinazione. </li><li> Dopo la sterilizzazione, consentire cgas hlorine per sfogare la cappa per almeno 1 ora poi sigillare la provetta. Lasciare la candeggina e la miscela HCl nel fumehood per almeno 24 ore prima dello smaltimento. Nota: i semi sterilizzati possono essere conservati a temperatura ambiente per un utilizzo immediato. </li><li> Conservare i semi a 4 ° C per una conservazione a lungo termine. Portare i semi a temperatura ambiente prima di aprire la provetta per evitare la formazione di condensa. semi Conservare al buio. </li></ol></li><li> Preparare piastre di agar a 4-settore Petri Piatti (90 x 15 mm): <ol><li> Preparare 110 ml di terreno di coltura per A. thaliana piantine: 1x Murashige e Skoog (MS) terreno base 15 (4.33 g / L) contenente 1% (w / v) di saccarosio e 0,8% (w / v) di agar. Regolare il supporto MS a pH 6 con NaOH. </li><li> Preparare 100 ml di terreno di coltura batterica di CEPA decomposizione: Schramm e Hestrin (SH) medium 16 contenente 1,5% (w / v) di agar. Regolare il medium SH a pH 7 con NaOH. </li><li> Sterilizzare i media in autoclave e Temper a bagnomaria C 55 °. </li><li> Una volta che l&#39;agar MS ha temprato, aggiungere 40 ml in un pallone sterile. Per preparare il terreno di coltura controllo positivo per A. thaliana piantine, completano l&#39;40 ml aliquota di MS agar con 40 ml di 10 mm secondo per ottenere una concentrazione finale di 10 micron ACC. </li><li> Aggiungere 5 ml di terreno ai quadranti appropriate delle piastre Petri settorizzati (Figura 1) e consentire l&#39;agar solidificare. Preparare tutte le lastre in triplice copia. Nota: CEPA non viene aggiunto al mezzo di crescita fino al più tardi nel protocollo. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> Figura 1:. Installazione di piastre di agar utilizzati per il test di risposta tripla con CEPA Uno schema illustra i quadranti specifici per il controllo negativo (A), controllo positivo (B), e piastre sperimentali (C). Questa cifra è stata modificata da Augimeri e cinturino 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="3"><li> Stratify A. thaliana semi di germinazione Assicurarsi sincrono: <ol><li> Aggiungere circa cinquanta A. semi thaliana viene eseguito su ciascun quadrante contenente MS o MS + ACC agar. Assicurarsi che i semi sono distribuiti in modo uniforme per facilitare la rimozione piantina e l&#39;analisi. </li><li> Incubare le piastre contenenti semi al buio a 4 ° C per 3-4 giorni. </li></ol></li><li> Scomporre CEPA su batterica di crescita a medio (SH) ed eseguire Triple test di risposta: <ol><li> Dopo stratificazione, esporre i semi di luce fluorescente per 2 ore. </li><li> Distribuire 10 ml di soluzione stock di 500 mM CEPA sui quadranti delle piastre sperimentali contenenti SH agar (pH 7; Figura 1) per ottenere una concentrazione finale CEPAdi 1 mM. </li><li> Sigillare i piatti con pellicola di laboratorio e coprire con un foglio per creare un ambiente scuro per i semi. </li><li> Germinare semi incubando le piastre al buio a 23 ° C per 3 giorni con il lato agar giù. Nota: Le piastre possono essere impilati, ma controlli negativi dovrebbero essere collocati sul fondo dal etilene è più leggero dell&#39;aria. </li></ol></li><li> Analizzare Triple Risposta Assay dati: <ol><li> Con una pinza di fiamma sterilizzato, rimuovere singole piantine da una piastra corrispondente ad ogni trattamento e vista sotto un microscopio da dissezione o USB digitale. Assicurarsi che il fondo delle piantine sono allineati e fotografia. </li><li> Rimuovere 30 piantine da ogni quadrante (60 piantine per replica biologica e 180 piantine per il trattamento). Allineare su una superficie con uno sfondo nero e la fotografia con un righello. </li><li> Misurare la lunghezza hypocotyl (mm) di piantine ripetute utilizzando il software ImageJ 17. Impostare la scala facendo clic e trascinando il * diritta *strumento per selezionare una lunghezza di 10 mm. Selezionare &quot;Set Scale&quot; nella scheda &quot;Analizza&quot; e impostare la distanza nota a 10. Utilizzando lo strumento * * segmentato, fare clic e trascinare per selezionare la lunghezza della dell&#39;ipocotilo e premere M per misurare la distanza. Confronta i mezzi di repliche biologiche con un one-way ANOVA con test di confronto multiplo di un Tukey. Le differenze sono ritenuti significativi se p &lt;0.05. </li></ol></li></ol> 3. Analisi del pH durante la crescita batterica <ol><li> Crescere e quantificare Komagataeibacter Culture xylinus Starter in triplice copia: <ol><li> Inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. Incubare culture a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore). </li><li> Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml sterile 0,85% (w / v) NaCl soluzione, lavare le cellule due volte e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Quantificare cellule utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser. </li></ol></li><li> Seminare Culture per l&#39;analisi di pH: <ol><li> Aggiungere 150 ml di brodo SH (pH 7) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione a dodici 500 ml flaconi con coperchi foglio. Seminare palloni con K. colture starter xylinus ad una concentrazione di 10 5 cellule / ml. Utilizzando le tre colture starter, preparare tre repliche biologiche per il trattamento. </li><li> culture integrare con 300 ml di soluzioni madre 5, 50, o 500 mm CEPA per ottenere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1 e 1,0 mm, rispettivamente. Supplemento colture di controllo non trattati con 300 ml di solvente usato per sciogliere CEPA. </li><li> Sigillare beute mediante nastratura ermeticamente i coperchi foglio nei flaconi e incubare culture per 14 giorni a 30 ° C con agitazione a 150 rpm. </li></ol></li><li> Ogni giorno, Asepticarimuovere lly 5 ml campioni provenienti da ciascuno cellule pallone e pellet per centrifugazione (2.000 x g, 4 ° C; 10 min). Trasferire surnatanti in una provetta pulita e misurare il pH di ciascun replicato biologica usando un pH-metro. </li><li> Analizzare i dati in tempo portate dalla graficamente il pH media delle repliche biologiche. Nota: È importante che il pH coltura non scenda sotto 3,5; un pH cultura 5 riduce significativamente rilascio etilene da CEPA, e un pH inferiore a 3,5 inibisce completamente il rilascio di etilene. </li><li> Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente. </li></ol> 4. Colony Morfologia <ol><li> Grow K. Culture xylinus Starter in triplice copia: <ol><li> Inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. incubaculture te a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore). </li><li> Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml di soluzione fisiologica sterile, lavare le cellule e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparare 24 piastre di agar contenenti 25 ml di SH (pH 7) medie con 1,5% (w / v) di agar. </li><li> Una volta che l&#39;agar è solidificato, diffusa 50 ml di 5, 50, e 500 soluzioni madre mM CEPA su agar per ottenere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1, e 1,0 mM, rispettivamente. Impostare placche di comando trattato e del solvente, che consistono di alcuna modifica e la diffusione di 50 ml di solvente usato per sciogliere i composti di prova. </li><li> Piastre di scansione per gli colonie isolate con un ciclo-completo (~ 5 ml) di K. xylinus coltura starter e sigillarli con la pellicola di paraffina. Seminare tutte le lastre in triplice copia. Incubare le piastre per cinque giorni a 30 ° C. </li><li> Photcolonie ograph a 20X di ingrandimento utilizzando un microscopio digitale USB e qualitativamente valutare la morfologia e la cellulosa di produzione coloniale su terreno solido. Nota: Cellulosa appare come sostanza nebuloso lungo il margine della colonia. </li><li> Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente. </li></ol> 5. Pellicle Assays <ol><li> Crescere e quantificare K. Culture xylinus Starter in triplice copia: <ol><li> In triplice copia, inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. Incubare culture a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore). </li><li> Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml di soluzione fisiologica sterile, lavare tlui le cellule due volte e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Quantificare cellule utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser. </li></ol></li><li> Preparare Master Mix per inoculare piastre da 24 pozzetti: <ol><li> Supplemento 60 ml di terreno SH (pH 7) con 120 ml di 5, 50, e 500 mM scorte CEPA avere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1, e 1,0 mM, rispettivamente. Supplemento altri 60 ml di terreno SH (pH 7) con 120 ml di solvente usato per sciogliere CEPA. Vortex per miscelare. </li><li> Dividere ogni 60 ml di CEPA contenente mezzo in quattro 14 ml aliquote. Inoculare tre dei 14 ml aliquote con repliche biologiche di coltura starter alla concentrazione di 10 5 cellule / ml. Mantenere i tubi con le cellule in ghiaccio per evitare la produzione di cellulosa. Nota: Il restante 14 ml un&#39;aliquota sarà utilizzato per pozzetti di controllo sterili. </li></ol></li><li> Seminare piastre da 24 pozzetti: <ol><li> Testare ogni trattamento nel proprio piatto con tre file di repliche biologiche euna fila di controlli sterili (Figura 2). </li></ol></li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> Figura 2:. Flow-chart che illustra il protocollo utilizzato per il saggio pellicola e l&#39;analisi della CEPA supplementato medio SH pH 7 (60 ml) è aliquotati per tre inoculazioni replicati biologica separati e un controllo sterile (14 ml ciascuna). Tali colture sono poi aliquotati in sei repliche tecniche (2 ml) in una piastra ben 24 e quindi sigillati con parafilm. Dopo incubazione per 7 giorni a 30 ° C, pellicole vengono raccolte e caratterizzati determinando peso umido, spessore, peso a secco, e cristallinità dal FT-IR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Utilizzando il master mix 14 ml, aggiungere 2 ml in each di sei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti sterili. Completare per le tre repliche biologiche e controllo sterile (Figura 2). Ripetere l&#39;operazione per ogni trattamento. </li><li> piastre di tenuta con la pellicola di paraffina e incubare staticamente per 7 giorni a 30 ° C. </li></ol><ol start="4"><li> Raccolta e Misura Pellicle Wet peso, spessore, asciutto Peso (cellulosa Yield) e cristallinità (Figura 2): <ol><li> Premere un lato della pellicola di elevare il bordo pellicle avversaria e rimuovere singole pellicole con una pinza. Pur mantenendo la presa, metterli su un tovagliolo di carta fresca per 3 secondi per rimuovere eccesso di terreno prima della pesatura per determinare il loro peso umido. </li><li> Allineare pellicole adiacenti ad un righello e fotografia dal lato utilizzando una fotocamera digitale ad alta risoluzione. </li><li> Utilizzando il software ImageJ 17, misurare lo spessore pellicola sulla spalla sinistra, spalla destra e al centro di ogni pellicola. Medio Tutti i replicati tecnici per ogni Replicat biologicae. </li><li> trasferire singolarmente le pellicole nei pozzetti di un 6-pozzetti. Trattare pellicole con 12 ml di 0,1 N NaOH a 80 ° C per 20 minuti per lisare le cellule. </li><li> Rimuovere il NaOH e neutralizzare pellicole mediante lavaggio con acqua ultra pura per 24 ore con agitazione. Cambiare l&#39;acqua ogni 6 ore. Nota: pellicole dovrebbero essere bianco al termine della fase di lavaggio. </li><li> Inserire pellicole stuoie silicio e asciutto a 50 ° C per 48 ore fino a peso costante. Una volta asciutto, togliere dal stuoie e misurare pesi pellicle su una bilancia analitica per determinare il rendimento di cellulosa batterica. </li><li> Analizzare pellicola cristallinità mediante trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa (FT-IR) utilizzando 32 scansioni e una risoluzione di 4 cm -1 nell&#39;intervallo 4000 a 650 cm -1. Calcolare l&#39;indice di cristallinità, CI (IR), utilizzando un 1437 / A 895; il rapporto di assorbanza del &quot;banda cristallina&quot; e &quot;banda amorfa&quot; come descritto in precedenza 18. </li></ol&gt; </li><li> Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente. </li><li> Analizzare Pellicle dati: <ol><li> Calcolare pellicola idratazione determinando la differenza tra pellicola peso umido e il peso secco. </li><li> La media dei valori di tutti i replicati tecniche per ottenere un singolo valore per ciascun replicato biologico per l&#39;analisi statistica. Confronto trattamenti con un one-way ANOVA con test di confronto multiplo di Tukey. Le differenze sono significative se p &lt;0.05. </li><li> Normalizzare i dati come la percentuale dei controlli non trattati e riportare i mezzi di repliche biologiche. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi qui descritti illustrano la produzione in situ di etilene da CEPA per lo studio della risposta etilene batterica usando l&#39;organismo modello, K. xylinus. Questo metodo è molto utile come etilene può essere prodotto da integrare qualsiasi mezzo acquoso che ha un pH superiore a 3,5 10,11 con CEPA eliminando la necessità di etilene puro o di laboratorio specializzato. Questo metodo non è limitato a studiare gli effetti di etilene CEPA derivato sui batteri, ma può essere anche essere...

L&#39;etilene olefina (C 2 H 4) fu scoperto come ormone vegetale nel 1901, quando si è osservato che piantine pisello, coltivate in un laboratorio che utilizza lampade a gas di carbone, mostravano una morfologia anomala in cui steli (ipocotili) erano più corte, più spessa e piegato di lato rispetto ai normali piantine di piselli; un fenotipo in seguito definito il 1,2 risposta tripla. Studi successivi hanno dimostrato che l&#39;etilene è un fitormoni vitale che regola numerosi processi di sviluppo come la crescita, la risposta allo stress, la maturazione dei frutti e senescenza 3. Arabidopsis thaliana, un organismo modello per la ricerca biologia vegetale, è stato ben studiato per quanto riguarda la sua risposta alla etilene. Mutanti risposta Diversi etilene sono stati isolati sfruttando il fenotipo risposta tripla osservato in dark-grown A. piantine thaliana in presenza di etilene 1,4,5. Il precursore biosintetico per la produzione di etilene in piante è 1-aAcido minocyclopropane carbossilico (ACC) 6 ed è comunemente usato per il test di risposta tripla per aumentare la produzione di etilene endogeno che porta alla tripla 1,4,5 risposta fenotipo. Sebbene la risposta etilene viene ampiamente studiato nelle piante, l&#39;effetto dell&#39;etilene esogeno sui batteri è notevolmente poco studiata nonostante la stretta associazione di batteri con piante. Uno studio ha riportato che alcuni ceppi di Pseudomonas possono sopravvivere con etilene come unica fonte di carbonio e di energia 7. Tuttavia, solo due studi hanno dimostrato che i batteri rispondono all&#39;etilene. Il primo studio ha mostrato che ceppi di Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida e P. syringae erano chemiotattica verso etilene utilizzando un test spina agarosio in cui agarosio fuso è stato mescolato con un buffer chemiotassi equilibrata con gas puro etilene 8. Tuttavia, a nostra conoscenza, non ci sono stati Furthrapporti er usano gas etilene puro per caratterizzare la risposta di etilene batterica, probabilmente a causa della difficilmente di gestire gas in laboratorio, senza attrezzature specializzate. La seconda relazione di risposta etilene batterica dimostrato che un aumento della produzione di etilene di cellulosa batterica e l&#39;espressione genica influenzato nel batterio frutta-associata, Komagataeibacter (ex Gluconacetobacter) xylinus 9. In questo caso, il composto di etilene-releasing, acido 2-chloroethylphosphonic (CEPA) è stato usato per la produzione di etilene in situ nel mezzo di crescita batterica, bypassando la necessità di etilene puro o attrezzature specializzate. CEPA produce etilene in un rapporto 1: 1 molare sopra pH 3,5 10,11 attraverso un primo ordine di reazione base-catalizzata 12 - 14. La degradazione del CEPA è correlata positivamente con pH e temperatura 13,14 e risultati nella produzione di etilene, cloruro e fosfato. CEPA fornisce ai ricercatori interessati a studiare le risposte batterici di etilene con una comoda alternativa per l&#39;etilene gassoso. L&#39;obiettivo generale dei seguenti protocolli è di fornire un metodo semplice ed efficace per studiare la risposta di etilene batterica e comprende la convalida dei livelli fisiologicamente rilevanti di produzione di etilene da CEPA decomposizione in mezzo di crescita batterica, analisi di pH cultura per assicurare CEPA decomposizione non è compromessa durante crescita batterica, e la valutazione degli effetti dell&#39;etilene sulla morfologia batterica e fenotipo. Dimostriamo questi protocolli che utilizzano K. xylinus, tuttavia, questi protocolli può essere adattato per studiare la risposta di etilene in altri batteri utilizzando il terreno di coltura appropriato e analisi fenotipo.

<table><tbody><tr><td>Acido carbossilico 1-amminociclopropano (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Precursore biosintetico dell'etilene nelle piante</td></tr><tr><td>Piastra di Petri a 4 settori</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>Per testare la tripla risposta</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>Per solidificare il mezzo</td></tr><tr><td>Canon Rebel T1i Fotocamera DLSR</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>Per le immagini delle pellicole</td></tr><tr><td>Cellulasi da Trichoderma reesei ATCC 26921&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Soluzione acquosa</td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>Per SH medium</td></tr><tr><td>Candeggina commerciale</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>Candeggina per la sterilizzazione dei semi</td></tr><tr><td>HCl concentrato</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Acido cloridrico per la regolazione del pH</td></tr><tr><td>Microscopio digitale USB</td><td>Collegabile</td><td>N/A</td><td>Per immagini di colonie</td></tr><tr><td>Ethephon (&ge; 96%; Acido 2-cloroetilfosfonico)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Composto di rilascio di etilene</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Per SH medio</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Batterio alfaproteobatterico batterico produttore di cellulosa</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1,7 ml provetta per microcentrifuga</td></tr><tr><td>Murashige e Skoog (MS) basale medio&nbsp;</td><td>Mezzo di crescita Sigma</td><td>M5519</td><td>Arabidopsis thaliana</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Fosfato di sodio, eptaidrato bibasico per SH medio</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>Cloruro di sodio per soluzione salina e di controllo</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Fosfato di sodio, monobasico monoidrato per soluzione di controllo</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>Idrossido di sodio per la regolazione del pH</td></tr><tr><td>Film di paraffina</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>Per sigillare piastre e matracci</td></tr><tr><td>Peptone (batteriologico)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>Per</td></tr><tr><td>SH medium Petroff-Hausser camera di conteggio</td><td>Hausser scientific</td><td>3900</td><td>Camera di conteggio delle cellule batteriche</td></tr><tr><td>Filtro di sterilizzazione in polietersulfone 0,2 &; m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Per sterilizzare la cellulasi</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Saccarosio per MS medium</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Per SH medium</td></tr></tbody></table>

utilizzando il compound etilene-releasing, acido 2-chloroethylphosphonic, come strumento per studiare risposta di etilene in batteri

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

L'etilene (C2H4) è un fitormone gassoso che è coinvolto in numerosi aspetti dello sviluppo delle piante, svolgendo un ruolo dominante nella senescenza e nella maturazione dei frutti. L'etilene esogeno applicato durante lo sviluppo precoce delle piante innesca il fenotipo a tripla risposta; un ipocotile più corto e più spesso con un uncino apicale esagerato. Nonostante l'intima relazione tra piante e batteri, l'effetto dell'etilene esogeno sui batteri è stato molto trascurato. Ciò è in parte dovuto alla difficoltà di controllare l'etilene gassoso all'interno del laboratorio senza attrezzature specializzate. L'acido 2-cloroetilfosfonico (CEPA) è un composto che si decompone in etilene, cloro e fosfato in un rapporto molare 1:1:1:1 quando disciolto in un mezzo acquoso con pH 3,5 o superiore. Qui descriviamo l'uso del CEPA per produrre etilene in situ per lo studio della risposta all'etilene nei batteri utilizzando il batterio Komagataeibacter xylinus associato alla frutta e produttore di cellulosa come organismo modello. I protocolli qui descritti includono sia la verifica della produzione di etilene da CEPA tramite il saggio a tripla risposta di Arabidopsis thaliana sia gli effetti dell'etilene esogeno sulla produzione di cellulosa di K. xilinus, sulle proprietà della pellicola e sulla morfologia coloniale. Questi protocolli possono essere adattati per esaminare l'effetto dell'etilene su altri microbi utilizzando appropriati terreni di crescita e analisi del fenotipo. L'uso del CEPA fornisce ai ricercatori un'alternativa semplice ed efficiente al gas etilene puro per la determinazione di routine della risposta batterica all'etilene.

Una configurazione schematica piatto per la verifica dell&#39;etilene liberazione dal CEPA in terreno SH (pH 7) con il test triplice risposta è illustrato in Figura 1A - C. Un diagramma di flusso illustrante il protocollo pellicola è mostrato in Figura 2. Dark-grown A. thaliana piantine mostrano il fenotipo triplice risposta (hypocotyl più breve e più spesso di un gancio apicale esagerata) in presenza di ACC e in presenza di eti...

I protocolli qui descritti facilitano l'indagine conveniente delle risposte batteriche dell'etilene utilizzando l'acido 2-cloroetilfosfonico (CEPA). L'etilene viene prodotto in situ attraverso la decomposizione del CEPA in un mezzo acquoso di crescita batterica, eludendo il requisito del gas etilene puro.

Utilizzando il Compound Etilene-releasing, acido 2-Chloroethylphosphonic, come strumento per studiare risposta di etilene in batteri

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo semplice e sicuro per lo studio della risposta batterica all'etilene. Questo metodo permetterà di rispondere a domande fondamentali riguardo le interazioni pianta-microbo, come ad esempio il ruolo svolto dall'etilene nell'adesione batterica e nella colonizzazione delle piante. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede alcun equipaggiamento specializzato ed è molto più sicura rispetto alla manipolazione dell'etilene gassoso in laboratorio.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su come la produzione di cellulosa batterica è influenzata dall'etilene, può essere applicato anche ad altri microorganismi associati alle piante per lo studio in vitro del coinvolgimento dei processi mediati dall'etilene nella colonizzazione delle piante. In preparazione, preparare 100 millilitri di mezzo di crescita per le piantine di Arabidopsis e 100 millilitri di mezzo di crescita batterico per la decomposizione di CEPA. Una volta che il mezzo per Arabidopsis si è raffreddato, suddividere 40 millilitri in un matraccio sterile e integrare l'aliquota con 40 microlitri di ACC 10 millimolare.Ora, caricare i quadranti della piastra con cinque millilitri di mezzo e lasciare solidificare l'agar. I quadranti opposti di tutte le piastre contengono mezzo di crescita batterica e mezzo per arabidopsis. Utilizzare tre configurazioni diverse di mezzo.Il trattamento CEPA avverrà in una fase successiva del protocollo. Preparare ciascuna configurazione di piastra in triplice replicato. Una volta raffreddato l'agar, distribuire uniformemente circa 50 semi in ciascun quadrante del mezzo per arabidopsis.Quindi, incubare le piastre al buio a quattro gradi Celsius per tre o quattro giorni. Successivamente, dopo l'incubazione dei semi, esporli alla luce fluorescente per due ore. Poi, distribuire 10 microlitri di soluzione stock di CEPA 500 millimolare sulla piastra batterica di una configurazione di piastre.La concentrazione finale di CEPA nell'agar sarà di un millimolare. Ora sigillare tutte le piastre con pellicola da laboratorio e avvolgerle nella stagnola. Successivamente, posizionare le piastre in un ambiente buio a 23 gradi Celsius con il lato dell'agar rivolto verso il basso e lasciarle incubare per tre giorni per far germinare i semi.Dopo la germinazione dei semi, utilizzare pinzette sterilizzate alla fiamma per rimuovere le piantine corrispondenti a ciascun trattamento. Selezionare 30 piantine da ciascun quadrante per un totale di 180 per trattamento. Acquisire immagini delle piantine al microscopio stereoscopico o con una fotocamera digitale ad alta risoluzione su sfondo nero, posizionando un righello accanto come riferimento di scala.Successivamente, misurare la lunghezza dell'ipocotilo utilizzando il software ImageJ. Utilizzando lo strumento lineare, misurare 10 millimetri e selezionare Imposta scala nella scheda Analizza per definire la scala. Quindi, utilizzare lo strumento Segmentato presente nel menu dello strumento Linea retta per misurare ciascun ipocotilo e premere M per calcolarne le lunghezze.L'analisi del pellicle è uno strumento standard per la valutazione della produzione di cellulosa batterica. L'analisi del pH e della morfologia è descritta nel protocollo dettagliato. In preparazione, raccogliere le cellule da colture di avviamento in triplice replicato e quantificare le cellule utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hauser.Quindi, preparare quattro miscele madri di mezzo con diverse concentrazioni di CEPA. Per ogni miscela madre, aliquotare 60 millilitri di mezzo SH a pH 7 e aggiungere 120 microlitri di soluzione stock di CEPA rispettivamente a concentrazione zero, cinque, 50 o 500 millimolari, per ottenere concentrazioni finali di CEPA pari a zero, 0,1, 0,1 o 1,0 millimolare. Mescolare questi mezzi agitando delicatamente i flaconi.È necessario un insieme di mezzi di coltura per ciascuna delle tre replicazioni e un quarto insieme funge da controllo sterile. Pertanto, dividere ogni preparazione di mezzo da 60 millilitri in quattro aliquote da 14 millilitri. Successivamente, raffreddare preventivamente le aliquote da 14 millilitri prima di inocularle con le rispettive colture iniziali per ottenere una concentrazione finale di 100.000 cellule per millilitro.Mantenere tutte le provette inoculate sul ghiaccio per prevenire la produzione di cellulosa. Utilizzare i restanti eluatati da 14 millilitri per i pozzetti di controllo sterili. A questo punto, da ciascun mix master da 14 millilitri, caricare eluatati da 2 millilitri in sei pozzetti di una piastra sterile da 24 pozzetti, per un totale di quattro piastre caricate per ogni coltura iniziale analizzata.Sigillare attentamente le piastre con pellicola di paraffina e incubarle in statico per sette giorni a 30 gradi Celsius. Durante l'incubazione, incubare in parallelo una coltura liquida di 25 millilitri per misurare periodicamente l'acidità del mezzo. Se l'acidità scende al di sotto di un pH di cinque, la crescita dell'organismo inibirà la decomposizione del CEPA in etilene e sarà quindi incompatibile con questo saggio.Una settimana dopo, raccogliere e misurare il peso fresco, lo spessore, il peso secco e la cristallinità del pellicolo. Per raccogliere un pellicolo dalla piastra, premere un lato del pellicolo in modo da sollevare il bordo opposto e prelevarlo con una pinzetta. Mantenendo la presa, appoggiarlo su un tovagliolo di carta pulito per tre secondi al fine di rimuovere il mezzo in eccesso.Quindi, pesare ogni pellicola e registrare questo valore come peso fresco. Successivamente, allineare le pellicole lungo un righello e fotografarle lateralmente utilizzando una fotocamera digitale ad alta risoluzione. Analizzare queste immagini per determinare lo spessore delle pellicole.Successivamente, trasferire singolarmente le pellicole nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti. Trattarle con 12 millilitri di idrossido di sodio 0,1 N a 80 gradi Celsius per 20 minuti per lisare le cellule. Rimuovere quindi l'idrossido di sodio e neutralizzare le pellicole trattate lavandole accuratamente con 12 millilitri di acqua ultrapura per 24 ore con agitazione in una piastra a sei pozzetti.Durante questa incubazione, cambiare l'acqua ogni sei ore. Al termine dell'incubazione, le pellicole dovrebbero essere bianche. Successivamente, posizionare le pellicole su tappetini di silicone ed essiccarle a 50 gradi Celsius per 48 ore per prepararle alla misurazione del peso secco.La cristallinità delle pellicole può essere analizzata mediante spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier. Le piantine di arabidopsis thaliana cresciute al buio hanno mostrato il fenotipo della risposta tripla, caratterizzato da un ipocotile corto e spesso con un uncino apicale esagerato, in presenza di ACC e in presenza di etilene prodotto dalla decomposizione di CEPA su mezzo SH, ma non in condizioni non trattate. È evidente che la lunghezza dell'ipocotile dei semi trattati era significativamente inferiore rispetto ai controlli non trattati.Pertanto, l'etilene è stato rilasciato dal CEPA nel mezzo SH a una concentrazione fisiologicamente rilevante. Tutte le concentrazioni di etilene derivate dal CEPA hanno ridotto significativamente il peso fresco del pellicola, ma non hanno influenzato lo spessore del pellicola, mentre tutte le concentrazioni di etilene derivate dal CEPA hanno aumentato significativamente il peso secco del pellicola. Inoltre, l'idratazione del pellicola è stata ridotta da tutte le concentrazioni di etilene derivato dal CEPA.Nel corso di questa procedura, è importante misurare il pH del mezzo di crescita per assicurarsi che il pH non scenda al di sotto di cinque, in modo che la degradazione del CEPA in etilene non venga inibita. Ricordare che il CEPA in polvere è estremamente pericoloso per le membrane mucose. È sempre necessario adottare le opportune precauzioni durante l'esecuzione di questo protocollo.Questa tecnica permetterà ai ricercatori interessati alle interazioni tra piante e batteri di esplorare in modo sicuro le risposte mediate dall'etilene in vitro. Ciò contribuirà a chiarire come i segnali vegetali modulino la colonizzazione e l'adesione batterica. Attualmente, questo settore è stato poco studiato.

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Utilizzando il Compound Etilene-releasing, acido 2-Chloroethylphosphonic, come strumento per studiare risposta di etilene in batteri (Video) | JoVE Journal

Utilizzando il Compound Etilene-releasing, acido 2-Chloroethylphosphonic, come strumento per studiare risposta di etilene in batteri

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