Utilizzando il Compound Etilene-releasing, acido 2-Chloroethylphosphonic, come strumento per studiare risposta di etilene in batteri

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo semplice e sicuro per lo studio della risposta batterica all'etilene. Questo metodo permetterà di rispondere a domande fondamentali riguardo le interazioni pianta-microbo, come ad esempio il ruolo svolto dall'etilene nell'adesione batterica e nella colonizzazione delle piante. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede alcun equipaggiamento specializzato ed è molto più sicura rispetto alla manipolazione dell'etilene gassoso in laboratorio.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su come la produzione di cellulosa batterica è influenzata dall'etilene, può essere applicato anche ad altri microorganismi associati alle piante per lo studio in vitro del coinvolgimento dei processi mediati dall'etilene nella colonizzazione delle piante. In preparazione, preparare 100 millilitri di mezzo di crescita per le piantine di Arabidopsis e 100 millilitri di mezzo di crescita batterico per la decomposizione di CEPA. Una volta che il mezzo per Arabidopsis si è raffreddato, suddividere 40 millilitri in un matraccio sterile e integrare l'aliquota con 40 microlitri di ACC 10 millimolare.

Ora, caricare i quadranti della piastra con cinque millilitri di mezzo e lasciare solidificare l'agar. I quadranti opposti di tutte le piastre contengono mezzo di crescita batterica e mezzo per arabidopsis. Utilizzare tre configurazioni diverse di mezzo.

Il trattamento CEPA avverrà in una fase successiva del protocollo. Preparare ciascuna configurazione di piastra in triplice replicato. Una volta raffreddato l'agar, distribuire uniformemente circa 50 semi in ciascun quadrante del mezzo per arabidopsis.

Quindi, incubare le piastre al buio a quattro gradi Celsius per tre o quattro giorni. Successivamente, dopo l'incubazione dei semi, esporli alla luce fluorescente per due ore. Poi, distribuire 10 microlitri di soluzione stock di CEPA 500 millimolare sulla piastra batterica di una configurazione di piastre.

La concentrazione finale di CEPA nell'agar sarà di un millimolare. Ora sigillare tutte le piastre con pellicola da laboratorio e avvolgerle nella stagnola. Successivamente, posizionare le piastre in un ambiente buio a 23 gradi Celsius con il lato dell'agar rivolto verso il basso e lasciarle incubare per tre giorni per far germinare i semi.

Dopo la germinazione dei semi, utilizzare pinzette sterilizzate alla fiamma per rimuovere le piantine corrispondenti a ciascun trattamento. Selezionare 30 piantine da ciascun quadrante per un totale di 180 per trattamento. Acquisire immagini delle piantine al microscopio stereoscopico o con una fotocamera digitale ad alta risoluzione su sfondo nero, posizionando un righello accanto come riferimento di scala.

Successivamente, misurare la lunghezza dell'ipocotilo utilizzando il software ImageJ. Utilizzando lo strumento lineare, misurare 10 millimetri e selezionare Imposta scala nella scheda Analizza per definire la scala. Quindi, utilizzare lo strumento Segmentato presente nel menu dello strumento Linea retta per misurare ciascun ipocotilo e premere M per calcolarne le lunghezze.

L'analisi del pellicle è uno strumento standard per la valutazione della produzione di cellulosa batterica. L'analisi del pH e della morfologia è descritta nel protocollo dettagliato. In preparazione, raccogliere le cellule da colture di avviamento in triplice replicato e quantificare le cellule utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hauser.

Quindi, preparare quattro miscele madri di mezzo con diverse concentrazioni di CEPA. Per ogni miscela madre, aliquotare 60 millilitri di mezzo SH a pH 7 e aggiungere 120 microlitri di soluzione stock di CEPA rispettivamente a concentrazione zero, cinque, 50 o 500 millimolari, per ottenere concentrazioni finali di CEPA pari a zero, 0,1, 0,1 o 1,0 millimolare. Mescolare questi mezzi agitando delicatamente i flaconi.

È necessario un insieme di mezzi di coltura per ciascuna delle tre replicazioni e un quarto insieme funge da controllo sterile. Pertanto, dividere ogni preparazione di mezzo da 60 millilitri in quattro aliquote da 14 millilitri. Successivamente, raffreddare preventivamente le aliquote da 14 millilitri prima di inocularle con le rispettive colture iniziali per ottenere una concentrazione finale di 100.000 cellule per millilitro.

Mantenere tutte le provette inoculate sul ghiaccio per prevenire la produzione di cellulosa. Utilizzare i restanti eluatati da 14 millilitri per i pozzetti di controllo sterili. A questo punto, da ciascun mix master da 14 millilitri, caricare eluatati da 2 millilitri in sei pozzetti di una piastra sterile da 24 pozzetti, per un totale di quattro piastre caricate per ogni coltura iniziale analizzata.

Sigillare attentamente le piastre con pellicola di paraffina e incubarle in statico per sette giorni a 30 gradi Celsius. Durante l'incubazione, incubare in parallelo una coltura liquida di 25 millilitri per misurare periodicamente l'acidità del mezzo. Se l'acidità scende al di sotto di un pH di cinque, la crescita dell'organismo inibirà la decomposizione del CEPA in etilene e sarà quindi incompatibile con questo saggio.

Una settimana dopo, raccogliere e misurare il peso fresco, lo spessore, il peso secco e la cristallinità del pellicolo. Per raccogliere un pellicolo dalla piastra, premere un lato del pellicolo in modo da sollevare il bordo opposto e prelevarlo con una pinzetta. Mantenendo la presa, appoggiarlo su un tovagliolo di carta pulito per tre secondi al fine di rimuovere il mezzo in eccesso.

Quindi, pesare ogni pellicola e registrare questo valore come peso fresco. Successivamente, allineare le pellicole lungo un righello e fotografarle lateralmente utilizzando una fotocamera digitale ad alta risoluzione. Analizzare queste immagini per determinare lo spessore delle pellicole.

Successivamente, trasferire singolarmente le pellicole nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti. Trattarle con 12 millilitri di idrossido di sodio 0,1 N a 80 gradi Celsius per 20 minuti per lisare le cellule. Rimuovere quindi l'idrossido di sodio e neutralizzare le pellicole trattate lavandole accuratamente con 12 millilitri di acqua ultrapura per 24 ore con agitazione in una piastra a sei pozzetti.

Durante questa incubazione, cambiare l'acqua ogni sei ore. Al termine dell'incubazione, le pellicole dovrebbero essere bianche. Successivamente, posizionare le pellicole su tappetini di silicone ed essiccarle a 50 gradi Celsius per 48 ore per prepararle alla misurazione del peso secco.

La cristallinità delle pellicole può essere analizzata mediante spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier. Le piantine di arabidopsis thaliana cresciute al buio hanno mostrato il fenotipo della risposta tripla, caratterizzato da un ipocotile corto e spesso con un uncino apicale esagerato, in presenza di ACC e in presenza di etilene prodotto dalla decomposizione di CEPA su mezzo SH, ma non in condizioni non trattate. È evidente che la lunghezza dell'ipocotile dei semi trattati era significativamente inferiore rispetto ai controlli non trattati.

Pertanto, l'etilene è stato rilasciato dal CEPA nel mezzo SH a una concentrazione fisiologicamente rilevante. Tutte le concentrazioni di etilene derivate dal CEPA hanno ridotto significativamente il peso fresco del pellicola, ma non hanno influenzato lo spessore del pellicola, mentre tutte le concentrazioni di etilene derivate dal CEPA hanno aumentato significativamente il peso secco del pellicola. Inoltre, l'idratazione del pellicola è stata ridotta da tutte le concentrazioni di etilene derivato dal CEPA.

Nel corso di questa procedura, è importante misurare il pH del mezzo di crescita per assicurarsi che il pH non scenda al di sotto di cinque, in modo che la degradazione del CEPA in etilene non venga inibita. Ricordare che il CEPA in polvere è estremamente pericoloso per le membrane mucose. È sempre necessario adottare le opportune precauzioni durante l'esecuzione di questo protocollo.

Questa tecnica permetterà ai ricercatori interessati alle interazioni tra piante e batteri di esplorare in modo sicuro le risposte mediate dall'etilene in vitro. Ciò contribuirà a chiarire come i segnali vegetali modulino la colonizzazione e l'adesione batterica. Attualmente, questo settore è stato poco studiato.