Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare il numero di subunità nei complessi proteici omo-oligomerici nei lisati cellulari mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti con dodecilsolfato di sodio. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare, come lo stato oligomerico delle proteine coinvolte in processi cellulari essenziali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede la purificazione dei complessi proteici omo-oligomerici né l'uso di attrezzature specializzate e costose.

Pertanto, può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori. Questo esperimento utilizza due tipi di cellule: cellule A549 che esprimono la proteina Myxovirus resistance A, o MxA, endogena e virocellule che sovraesprimono MxA.

Sezionare le cellule A549 e le virocélle in piastre a sei pozzetti con due millilitri di mezzo di crescita per pozzetto. Incubare le cellule durante la notte in un incubatore per colture cellulari. Il giorno successivo, raccogliere le cellule.

Lavare ogni pozzetto con un millilitro di PBS e staccare le cellule aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione di Tripsina-EDTA 0,25% per circa cinque minuti a temperatura ambiente. Non appena le cellule si staccano dalla piastra, aggiungere 0,5 millilitri di mezzo di crescita e mescolare accuratamente aspirando e dispensando con una pipetta. Trasferire le cellule di ogni pozzetto in una provetta da due millilitri e raccoglierle mediante centrifugazione usando una centrifuga da banco.

Rimuovere con attenzione il soprannatante mediante pipetta senza disturbare il pellet cellulare. Lavare le cellule aggiungendo un millilitro di PBS freddo e prelevando delicatamente su e giù la sospensione cellulare con la pipetta. Centrifugare le cellule in una centrifuga da banco.

Rimuovere con attenzione il soprannatante per mezzo di pipetta, senza staccare il pellet cellulare. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi freddo, risospendere le cellule aspirando e dispensando ripetutamente con la pipetta, quindi posizionare sul ghiaccio. Proteggere immediatamente il lisato dalla luce coprendo le provette con carta stagnola, poiché l'iodoacetamide presente nel tampone di lisi è sensibile alla luce.

Incubare sul ghiaccio per 30 minuti. L'uso di iodoacetammide è fondamentale perché l'iodoacetammide protegge in modo irreversibile il gruppo tiolo delle cisteine libere formando un legame tiolico e impedisce l'aggregazione proteica artificiale. Successivamente, rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione in una centrifuga da banco preraffreddata.

Durante la centrifugazione, preparare colonne di dialisi con un cutoff di peso molecolare di 10.000. Fissare le colonne di dialisi a un galleggiante e posizionarle in un becher riempito con tampone di dialisi pre-raffreddato per equilibrare le colonne. Non toccare la membrana.

Posizionare un agitatore magnetico in un becher e trasferire il becher nella stanza fredda. Utilizzando l'agitatore magnetico per garantire un'agitazione delicata, equilibrare per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo 20 minuti, rimuovere le colonne dal buffer di dialisi e dal galleggiante.

Trasferire i lisati depurati nelle colonne di dialisi preparate mediante pipettatura, senza toccare la membrana. Fissare le colonne a un galleggiante. Riposizionarle nel becher riempito con tampone di dialisi, quindi trasferire il becher in cella fredda.

Dializzare il lisato per almeno quattro ore a quattro gradi Celsius, agitando delicatamente con un agitatore magnetico, per rimuovere i metaboliti e i sali piccoli che potrebbero interferire con l'elettroforesi su gel di poliacrilamide non denaturante. Al termine della dialisi, trasferire ciascun campione dializzato in una provetta da 1,5 millilitri. Rimuovere i precipitati mediante centrifugazione in una centrifuga da banco.

È necessario eseguire immediatamente l'elettroforesi dopo la dialisi dei lisati per prevenire la dissociazione dei complessi proteici oligomerici. Riempire la camera del gel interna ed esterna con tampone di corsa pre-raffreddato. Eseguire una pre-correnza del gel di poliacrilamide non denaturante con tampone di corsa pre-raffreddato a 25 milliampere per gel per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Mescolare 15 microlitri del lisato preparato con cinque microlitri di buffer campione 4X. Caricare un campione standard di proteine native a scelta e 15 microlitri di campione sul gel. Eseguire l'elettroforesi a 25 milliampere per quattro ore a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'elettroforesi su gel di poliacrilamide non denaturante, smontare il gel e trasferirlo con attenzione nel buffer SDS. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata. Preparare due spugne, quattro fogli di carta filtrante in cellulosa e una membrana per il trasferimento per ogni gel, quindi immergerli nel buffer di trasferimento.

Assemblare il sandwich come segue, dal basso verso l'alto: una spugna, due fogli di carta filtro in cellulosa, una membrana per il trasferimento, il gel, due fogli di carta filtro in cellulosa e una spugna. Posizionare il sandwich nel serbatoio di trasferimento, assicurandosi che la membrana sia rivolta verso il polo positivo e il gel verso il polo negativo.

Riempire il serbatoio di trasferimento con tampone pre-raffreddato. Per ottenere i migliori risultati di trasferimento proteico, eseguire il trasferimento a 90 milliampere durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, smontare il sandwich.

Incubare la membrana in soluzione di Ponceau S per cinque minuti a temperatura ambiente per visualizzare il campione proteico. Decolorare la membrana ponendola in acqua deionizzata e lavandola. Dopo aver trasferito la membrana in un vassoio, segnare le bande del campione proteico utilizzando una penna.

Bloccare la membrana con il buffer di blocco per almeno un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, le proteine di interesse vengono visualizzate mediante immunostaining utilizzando un anticorpo policlonale di coniglio diretto contro MxA come descritto nel protocollo testuale. Le virocelle prive di MxA endogeno sono state trasfettate con MxA di tipo selvaggio ricombinante e con varianti di MxA monomerico e dimerico.

La migrazione della variante ricombinante di MxA al loro peso molecolare atteso ha confermato il loro stato oligomerico. La MxA di tipo selvaggio espressa ectopicamente ha migrato come un tetramero. Queste proteine ricombinanti sono state quindi utilizzate per valutare lo stato oligomerico della proteina MxA umana endogena ottenuta da cellule A549 stimolate con interferone-alfa.

I risultati hanno rivelato che la dimensione di MxA nei lisati di cellule A549 stimolate con interferone-alfa corrisponde a un tetramero. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno e mezzo se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non congelare e scongelare i campioni durante l'intero procedimento, poiché ciò potrebbe distruggere le interazioni proteiche o causare aggregazioni proteiche.

Inoltre, quando si lavora con reagenti sensibili alla luce, come l'iodoacetammide, è importante proteggere i campioni dalla luce durante il passaggio di lisi. Dopo l'elettroforesi su gel in condizioni non denaturanti con SDS-PAGE, è possibile eseguire altri metodi come l'estrazione proteica dal gel e l'attività enzimatica AsiS o una seconda dimensione di elettroforesi su gel per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sull'attività enzimatica e sulla caratterizzazione di potenziali complessi etero-oligomerici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare la composizione dei complessi proteici oligomerici in cellule in coltura.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare lisati cellulari da colture cellulari per studiare le proteine oligomeriche mediante analisi in PAGE non denaturante. Ricorda che il lavoro con l'iodoacetamide può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti e la protezione oculare devono essere sempre adottate.