Name: Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Scopri come caratterizzare i complessi oligomerici della proteina MxA umana mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide non denaturante e western blot direttamente da lisati cellulari A549.

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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione della Fondazione nazionale svizzera per la ricerca scientifica (Sovvenzione nr. 31003A_143834) a JP.

NOTA: Questo protocollo si basa sul precedentemente pubblicati non-denaturazione PAGE protocollo 12. In questo studio, lo stato oligomerico della proteina MxA è stata valutata utilizzando sia cellule Vero overexpressing MxA o cellule A549 IFN-alfa-stimolato esprimono endogeno MxA. Il protocollo descritto di seguito può essere utilizzato per analizzare lo stato oligomerico di qualsiasi proteina in aggiunta a MxA. Tuttavia, può essere necessaria un&#39;ulteriore ottimizzazione. 1. Preparazione del lisato per i non-denaturazione PAGINA NOTA: per analizzare lo stato oligomerico della proteina MxA umana sia in cellule Vero o A549, 1,0 x 10 6 cellule sono state raccolte. A seconda del tipo di cellula o l&#39;abbondanza della proteina da analizzare, il numero della cella deve essere regolata. E &#39;anche importante proteggere il tampone di lisi da esposizione alla luce, non appena viene aggiunto il iodoacetamide fotosensibile. <ol><li> Seed 0,3 x 10 6 cellule A549 o Vero per bene ina 6 e piatti-. Mantenere le cellule in 2 ml di terreno di coltura per bene (vedi tabella 1). Incubare le cellule durante la notte in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Raccogliere le cellule di lavaggio con 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) e separare aggiungendo acido etilendiamminotetraacetico tripsina-0,5 ml di 0,25% (EDTA) 1x soluzione per circa 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Non appena le cellule si staccano dal piatto, aggiungere 0,5 ml di mezzo di crescita e miscelare accuratamente pipettando su e giù. </li><li> Trasferire le cellule di ogni pozzetto in una provetta 2 ml e pellet usando una centrifuga da tavolo (5.000 xg, a 4 ° C, 5 min). </li><li> rimuovere con attenzione il surnatante pipettando senza disturbare il pellet. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml di PBS ghiacciato pipettando accuratamente la sospensione cellulare su e giù. </li><li> Cellule pellet in una tabella centrifuga (5000 XG, 4 ° C, 5 min). </li><li> rimuovere con attenzione il surnatante pipettando wisarie, senza staccare il pellet di cellule. </li><li> Risospendere le cellule in 200 tampone di lisi ghiacciata ml (vedi tabella 1) pipettando su e giù e mettere in ghiaccio. </li><li> Immediatamente, proteggere dalla luce lisato coprendo i tubi con carta stagnola e incubare per 30 min in ghiaccio. NOTA: Dopo incubazione per 30 min in ghiaccio, non è più essenziale per proteggere il lisato da esposizione alla luce, poiché la protezione dei gruppi tiolici liberi è irreversibile. </li><li> Rimuovere detriti cellulari mediante centrifugazione in una centrifuga da tavolo pre-raffreddata (13.000 xg, a 4 ° C, 20 min). </li><li> Equilibrare colonne dialisi in tampone di dialisi (Tabella 1) in camera fredda a 4 ° C per 20 minuti durante la fase di centrifugazione. Utilizzare una colonna con un peso molecolare di 10.000 tagliato. <ol><li> Fissare le colonne ad una boa galleggiante e metterli in un bicchiere pieno di buffer di dialisi. Per garantire leggera agitazione, utilizzare un agitatore magnetico. Non toccare la membrana. NOTA: Dialysè colonne possono essere acquistati o preparati da 1,5 ml tubi secondo il protocollo descritto da Fiala e collaboratori 19. </li></ol></li><li> Rimuovere le colonne dal buffer di dialisi e la boa galleggiante. Trasferire i lisati eliminato nella colonna di dialisi preparata pipettando senza toccare la membrana. Fissare le colonne ad una boa galleggiante e metterli nuovamente dentro il bicchiere pieno di buffer di dialisi. </li><li> Dializzare il lisato in un becher contenente tampone di dialisi ghiacciata (Tabella 1) per almeno 4 ore (o preferibilmente durante la notte) a 4 ° C mentre accuratamente agitazione con un agitatore magnetico. Utilizzare almeno 100 ml di tampone di dialisi per un lisato 200 microlitri. </li><li> Trasferire il campione dializzato in una provetta da 1,5 ml. Rimuovere precipitati per centrifugazione in una centrifuga da tavolo (13.000 xg, a 4 ° C, 20 min). Per impedire la dissociazione della proteina oligomerica complessi continuano con il protocollo (sezione 2) immediatamente dopo la dialisi. Non congelarelisati preparati. </li></ol> 2. elettroforesi NOTA: L&#39;elettroforesi è stata eseguita come descritto prima con alcune modifiche 22. Nel protocollo descritto di seguito, prefabbricati gel gradiente sono stati utilizzati (4-15% di pendenza). In alternativa, i gel possono essere preparati in laboratorio. E &#39;molto importante escludere qualsiasi agente denaturante come SDS impedire la dissociazione dei complessi proteici oligomerici. Tempo di elettroforesi è stata ottimizzata per i diversi stati oligomerici della proteina MxA umana. Tuttavia, può variare per altre proteine, a seconda delle dimensioni del complesso oligomerico così come l&#39;intervallo di separazione, che dovrebbe essere raggiunto per analizzare il complesso. Pertanto, il tempo ottimale di elettroforesi deve essere determinato empiricamente. Per una risoluzione ottimale degli oligomeri da analizzare la corrente non deve superare i 25 mA. <ol><li> Montare il gel PAGE non denaturazione nella camera di gel. riempire tegli camera interna e esterna con tampone di corsa pre-raffreddata (Tabella 1). </li><li> Pre-eseguire il gel con tampone di corsa pre-raffreddata a 25 mA per gel per 15 minuti in camera fredda a 4 ° C. </li><li> Mescolare 15 ml di lisati sopra preparato con 5 ml di tampone campione 4x (Tabella 1). Non bollire il campione. </li><li> Caricare 15 ml di campione e uno standard proteina nativa di scelta sul gel. Eseguire il gel a 25 mA per 4 ore in cella a 4 ° C. NOTA: Per le analisi semi-quantitativa, un protocollo proteina quantificazione (ad esempio un Metodo di Bradford 23) può essere effettuata in modo da garantire il caricamento di quantità uguali di proteine totali per corsia. </li></ol> 3. Western Blot NOTA: vedere più avanti è il protocollo di un sistema di Western Blot bagnato. Qualsiasi membrana assorbente può essere utilizzato. Attivare fluoruro di polivinile (PVDF) membrane in 100% di metanolo prima di equilibrio in buf assorbentefer. La tecnica Western Blot semi-secco può essere utilizzato in alternativa, ma deve essere ottimizzato per grandi complessi oligomerici. <ol><li> Smontare il gel e trasferire con cautela in SDS tampone (Tabella 1). </li><li> Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, mentre scuotendo delicatamente. </li><li> Preparare 2 spugne, 4 fogli di carta filtro di cellulosa e una membrana assorbente per gel. Ammollo in assorbente tampone (Tabella 1). </li><li> Montare il panino come segue (basso verso l&#39;alto): 1 spugna, 2 cellulosa fogli di carta filtro, membrana, gel, 2 di cellulosa fogli di carta filtro, 1 spugna. </li><li> Mettere il sandwich nel serbatoio blotting. Assicurarsi che la membrana si affaccia sul polo positivo, mentre il gel di fronte al polo negativo. </li><li> Riempire il serbatoio tamponando con tampone assorbente pre-raffreddata. </li><li> Tamponare a 90 mA notte a 4 ° C per i migliori risultati di trasferimento proteina. </li><li> Smontare il panino e visualizzare il livello di proteine ​​incubando la membrana in Poncsoluzione eau S per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Decolorare la membrana con attenzione lavare via il Ponceau S con acqua deionizzata fino a quando si può vedere chiaramente le bande dello standard di proteine. </li><li> Segnare le bande dello standard proteina con una penna. NOTA: residua Ponceau S può interferire con il immunocolorazione. Per evitare questo, la membrana può essere decolorato ulteriormente mediante incubazione in 0,1 M NaOH per 1 min e successivo lavaggio con acqua deionizzata. </li><li> Bloccare la membrana con tampone di bloccaggio (vedi Tabella 1) per almeno 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Visualizza proteina (s) di interesse mediante immunocolorazione con anticorpi diretti contro la proteina da analizzare. NOTA: La proteina MxA umana è stata visualizzata utilizzando l&#39;anticorpo policlonale di coniglio specifico per Mx1 umano diluito 1: 1000 in tampone di bloccaggio (Tabella 1). La soluzione di anticorpi è stata incubata per una notte a 4 ° C. In alternativa, il monoclonale unnti-MxA anticorpi (clone 143) può essere utilizzato (dati non mostrati) 24. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui si descrive un semplice metodo che permette la rapida determinazione dello stato oligomerico di proteine ​​espresse in cellule di mammifero mediante PAGE non denaturante seguita da analisi Western blot. Il principale vantaggio di questo approccio è che lo stato oligomerico di una data proteina può essere determinata da lisati cellulari totali senza purificazione della proteina prima. Ciò può essere importante per proteine ​​che oligomerize o esercitano la loro funzione in associazione con fattori ausiliari. Inoltre,...

La struttura quaternaria di una proteina gioca un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Vie di segnalazione, l&#39;espressione genica, e l&#39;enzima di attivazione / disattivazione tutti si basano sul corretto montaggio di complessi proteici 1-4. Questo processo noto anche come omo- o etero-oligomerizzazione è dovuta a covalente irreversibile o reversibile interazioni proteina-proteina elettrostatiche e idrofobiche. Oligomerizzazione non solo diversifica i diversi processi cellulari senza aumentare le dimensioni del genoma, ma fornisce anche una strategia di proteine per costruire complessi stabili che sono più resistenti verso denaturazione e degradazione 5. Difetti di oligomerizzazione hanno un impatto sulla funzione delle proteine ​​e può portare allo sviluppo di malattie. Ad esempio, l&#39;enzima fenilalanina idrossilasi forma un complesso tetrameric. Alcune mutazioni all&#39;interno del complesso proteico possono indebolire la formazione tetramero e portare alla fenilchetonuria malattia 6. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La proteina MxA umano è un interferone (IFN) indotta antivirale proteine effettrici esercitando una vasta attività antivirale contro vari RNA così come virus a DNA 7. Essa appartiene alla superfamiglia delle grandi GTPasi Dynamin-like e ha la capacità di formare grandi strutture oligomeriche in vitro 8. L&#39;oligomerizzazione è stato suggerito per proteggere MxA dalla rapida degradazione 9,10. Nonostante intensi sforzi da molti gruppi di ricerca, il meccanismo molecolare di azione rimane in gran parte sfuggente e il ruolo dello Stato oligomerizzazione di MxA per la sua funzione antivirale è in discussione 9,11,12. A questo proposito, Gao e colleghi hanno proposto un modello in cui MxA esercita la sua attività antivirale interagendo con nucleoproteine virali in forma di grandi strutture oligomeriche anulari 11. Tuttavia, più di recente, abbiamo dimostrato che dimeri MxA mostrano attività antivirale e interagiscono con la nucleoproteina del virus A 12. Based sulla struttura cristallina di MxA, Gao e colleghi hanno individuato diversi residui di amminoacidi nelle regioni di interfaccia che sono critiche per la sua oligomerizzazione in vitro e la sua funzione antivirale 11,13. Pertanto, al fine di chiarire che oligomerica stato di MxA esercita attività antivirale, abbiamo cercato di creare un semplice protocollo per determinare rapidamente lo stato di oligmeric MxA mutanti interfaccia espressi nelle cellule umane, così come endogena MxA espresso dopo la stimolazione IFNα. Anche se ci sono molte tecniche che vengono comunemente utilizzati per studiare l&#39;interazione tra le proteine come la proteina split-verde fluorescente (split-GFP) saggio di complementazione 14, risonanza plasmonica di superficie 15 e Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) 16, non forniscono informazioni dell&#39;esatta stechiometria di un complesso proteico oligomerica. Per indagare questo particolare aspetto, tecniche comemulti-angolo di diffusione della luce (MALS) 17 e ultracentrifugazione analitica 18 sono molto utili. Di solito, le proteine ​​analizzate utilizzando questi metodi sono proteine ​​purificate. processi di oligomerizzazione può dipendere anche da altri fattori cellulari. Se questi fattori non sono noti, l&#39;analisi è più difficile. Inoltre, alcune proteine sono difficili da esprimere in E. coli e purificare. Pertanto, questi metodi non sono la scelta ottimale per analizzare oligomerizzazione proteina nel ambiente cellulare. Inoltre, queste tecniche richiedono strumenti costosi che non sono facilmente disponibili. Non denaturante elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE), cromatografia ad esclusione sterica o reticolazione chimica seguita da convenzionale sodio dodecil solfato (SDS) -pagina sono strumenti utili per la caratterizzazione della formazione di oligomeri da lisati cellulari 2,19,20. Questi metodi non richiedono attrezzature specializzate e possono essere facilmente performed in un laboratorio standard. Inizialmente abbiamo valutato vari protocolli di reticolazione chimici che invariantly hanno portato alla non-specifica aggregazione e la precipitazione di MxA. Pertanto, la prossima testato protocolli PAGE non denaturazione. Come non-denaturazione PAGE esclude l&#39;uso di SDS, la migrazione delle proteine ​​dipende dalla loro carica nativa. Blue-native PAGE utilizza brillante Coomassie G250 blu per caricare proteine con una carica negativa complessiva, simile a SDS, ma non denatura la proteina 21. Purtroppo, brillante Coomassie precipitati blu in presenza di alte sali e cationi bivalenti (ad esempio Mg 2+) che sono spesso inclusi nei buffer di lisi. A seconda dei buffer utilizzati, può essere difficile analizzare il campione senza ulteriore ottimizzazione di passi che potrebbero avere un effetto sul complesso proteico oligomerica. Qui vi presentiamo un protocollo semplice basato su un metodo precedentemente pubblicato 22 per determinare oligomerizzazione diproteina umana MxA derivate da lisati cellulari utilizzando non-denaturazione PAGE.

<table><tbody><tr><td>Unità di dialisi Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>Pre-equilibrare in tampone di dialisi (se si desidera la rimozione del glicerolo) Può essere autoprodotto secondo Fiala et al. 2011</td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricati, 10 pozzetti,</td> <td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td>Pre-run in tampone in esecuzione per regolare il sistema tampone</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11836170001</td><td>utilizzare 1 compressa per 50 ml</td></tr><tr><td>di PBS, pH 7,4&nbsp; flacone da 500 ml Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S soluzione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>TOXIC indossare guanti e proteggere gli occhi</td></tr><tr><td>NativeMark Unstained Protein Standard&nbsp; 50 &; l</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 57030</td><td>carico 5 & micro; l/pozzetto</td></tr><tr><td>A549 cellule</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL185</td><td>Crescere nel mezzo di crescita (vedere Tabella 1)</td></tr><tr><td>Cellule</td><td>Vero ATCC</td><td>ATCC CCL81</td><td>Crescere nel mezzo di crescita (vedere Tabella 1)anticorpo</td></tr> <tr><td>anti-Mx1</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00004599_D01P</td><td>Utilizzare a una diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>ECL Anti-coniglio IgG, anticorpo intero legato alla perossidasi di rafano (da asino)</td><td>GE-Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Utilizzare a una diluizione 1:10.000</td></tr><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA (1x)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Life Technologies</td><td>Thermo Fisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetammide &nbsp; 5 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>stock&nbsp; 100 mM</td></tr><tr><td>Blu di Bromfenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Tecnologie per la vita del piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Pen&nbsp; Streptococco 100 x&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140 - 130</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x Stock, 100 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; tecnologie per la vita</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>350500-038</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, dializzato, origine USA 500 ml Gibco Lotto: 42G9552K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro in cellulosa</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>PVDF blotting&nbsp; membrana</td><td>GE-Healthcare</td><td>10600022</td><td></td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)amminometano</td><td>Biosolve</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>fluoruro di sodio (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-7920</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Calbiochem</td><td>6555204</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 10% soluzione</td><td>Amresco</td><td>N907</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Biosolve</td><td>0007132391BS</td><td></td></tr><tr><td>sodio ortovanadato (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Glicerofosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Latte in polvere</td><td>Migros/Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Millipore</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Amresco</td><td>288</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-8045</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di mxa umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

La formazione di complessi oligomerici è un prerequisito cruciale per la corretta struttura e funzione di molte proteine. La proteina effettrice antivirale MxA indotta dall'interferone esercita un'ampia attività antivirale contro molti virus. MxA è una GTPasi simile alla dinamina e ha la capacità di formare strutture oligomeriche di ordine superiore. Tuttavia, se l'oligomerizzazione di MxA sia necessaria per la sua attività antivirale è una questione di dibattito. Descriviamo qui un semplice protocollo per valutare lo stato oligomerico di MxA espresso endogenamente o ectopicamente nella frazione citoplasmatica di linee cellulari umane mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide non denaturante (PAGE) in combinazione con l'analisi Western blot. Un passaggio critico del protocollo è la scelta di detergenti per prevenire l'aggregazione e/o la precipitazione di proteine particolarmente associate alle membrane cellulari come l'MxA, senza interferire con la sua attività enzimatica. Un altro aspetto cruciale del protocollo è la protezione irreversibile dei gruppi tiolici liberi dei residui di cisteina da parte della iodoacetammide per prevenire interazioni artificiali della proteina. Questo protocollo è adatto per una semplice valutazione dello stato oligomerico di MxA e inoltre consente una correlazione diretta dell'attività antivirale dei mutanti di interfaccia MxA con i rispettivi stati oligomerici.

L&#39;utilizzo non denaturazione PAGE, abbiamo analizzato lo stato oligomerico di tipo selvatico umano MxA, i mutanti dimerici interfaccia MxA (R640A) e MxA (L617D), così come l&#39;interfaccia mutante monomerico MxA (M527D) da lisati cellulari 12. Le cellule sono state lisate in un tampone contenente 1% ottilfenossipolietossietanolo (NP-40) e iodoacetamide per assicurare solubilizzazione delle proteine e la protezione di gruppi tiolici liberi (vedi Figura 1). Come descritto prima, sale e pic...

Questo articolo descrive un protocollo semplice e rapido per valutare lo stato oligomerico della proteina GTPasi MxA simile alla dinamina da lisati di cellule umane utilizzando una combinazione di PAGE non denaturante con analisi western blot.

Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare il numero di subunità nei complessi proteici omo-oligomerici nei lisati cellulari mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti con dodecilsolfato di sodio. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare, come lo stato oligomerico delle proteine coinvolte in processi cellulari essenziali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede la purificazione dei complessi proteici omo-oligomerici né l'uso di attrezzature specializzate e costose.Pertanto, può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori. Questo esperimento utilizza due tipi di cellule: cellule A549 che esprimono la proteina Myxovirus resistance A, o MxA, endogena e virocellule che sovraesprimono MxA.Sezionare le cellule A549 e le virocélle in piastre a sei pozzetti con due millilitri di mezzo di crescita per pozzetto. Incubare le cellule durante la notte in un incubatore per colture cellulari. Il giorno successivo, raccogliere le cellule.Lavare ogni pozzetto con un millilitro di PBS e staccare le cellule aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione di Tripsina-EDTA 0,25% per circa cinque minuti a temperatura ambiente. Non appena le cellule si staccano dalla piastra, aggiungere 0,5 millilitri di mezzo di crescita e mescolare accuratamente aspirando e dispensando con una pipetta. Trasferire le cellule di ogni pozzetto in una provetta da due millilitri e raccoglierle mediante centrifugazione usando una centrifuga da banco.Rimuovere con attenzione il soprannatante mediante pipetta senza disturbare il pellet cellulare. Lavare le cellule aggiungendo un millilitro di PBS freddo e prelevando delicatamente su e giù la sospensione cellulare con la pipetta. Centrifugare le cellule in una centrifuga da banco.Rimuovere con attenzione il soprannatante per mezzo di pipetta, senza staccare il pellet cellulare. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi freddo, risospendere le cellule aspirando e dispensando ripetutamente con la pipetta, quindi posizionare sul ghiaccio. Proteggere immediatamente il lisato dalla luce coprendo le provette con carta stagnola, poiché l'iodoacetamide presente nel tampone di lisi è sensibile alla luce.Incubare sul ghiaccio per 30 minuti. L'uso di iodoacetammide è fondamentale perché l'iodoacetammide protegge in modo irreversibile il gruppo tiolo delle cisteine libere formando un legame tiolico e impedisce l'aggregazione proteica artificiale. Successivamente, rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione in una centrifuga da banco preraffreddata.Durante la centrifugazione, preparare colonne di dialisi con un cutoff di peso molecolare di 10.000. Fissare le colonne di dialisi a un galleggiante e posizionarle in un becher riempito con tampone di dialisi pre-raffreddato per equilibrare le colonne. Non toccare la membrana.Posizionare un agitatore magnetico in un becher e trasferire il becher nella stanza fredda. Utilizzando l'agitatore magnetico per garantire un'agitazione delicata, equilibrare per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo 20 minuti, rimuovere le colonne dal buffer di dialisi e dal galleggiante.Trasferire i lisati depurati nelle colonne di dialisi preparate mediante pipettatura, senza toccare la membrana. Fissare le colonne a un galleggiante. Riposizionarle nel becher riempito con tampone di dialisi, quindi trasferire il becher in cella fredda.Dializzare il lisato per almeno quattro ore a quattro gradi Celsius, agitando delicatamente con un agitatore magnetico, per rimuovere i metaboliti e i sali piccoli che potrebbero interferire con l'elettroforesi su gel di poliacrilamide non denaturante. Al termine della dialisi, trasferire ciascun campione dializzato in una provetta da 1,5 millilitri. Rimuovere i precipitati mediante centrifugazione in una centrifuga da banco.È necessario eseguire immediatamente l'elettroforesi dopo la dialisi dei lisati per prevenire la dissociazione dei complessi proteici oligomerici. Riempire la camera del gel interna ed esterna con tampone di corsa pre-raffreddato. Eseguire una pre-correnza del gel di poliacrilamide non denaturante con tampone di corsa pre-raffreddato a 25 milliampere per gel per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Mescolare 15 microlitri del lisato preparato con cinque microlitri di buffer campione 4X. Caricare un campione standard di proteine native a scelta e 15 microlitri di campione sul gel. Eseguire l'elettroforesi a 25 milliampere per quattro ore a quattro gradi Celsius.Al termine dell'elettroforesi su gel di poliacrilamide non denaturante, smontare il gel e trasferirlo con attenzione nel buffer SDS. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata. Preparare due spugne, quattro fogli di carta filtrante in cellulosa e una membrana per il trasferimento per ogni gel, quindi immergerli nel buffer di trasferimento.Assemblare il sandwich come segue, dal basso verso l'alto: una spugna, due fogli di carta filtro in cellulosa, una membrana per il trasferimento, il gel, due fogli di carta filtro in cellulosa e una spugna. Posizionare il sandwich nel serbatoio di trasferimento, assicurandosi che la membrana sia rivolta verso il polo positivo e il gel verso il polo negativo.Riempire il serbatoio di trasferimento con tampone pre-raffreddato. Per ottenere i migliori risultati di trasferimento proteico, eseguire il trasferimento a 90 milliampere durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, smontare il sandwich.Incubare la membrana in soluzione di Ponceau S per cinque minuti a temperatura ambiente per visualizzare il campione proteico. Decolorare la membrana ponendola in acqua deionizzata e lavandola. Dopo aver trasferito la membrana in un vassoio, segnare le bande del campione proteico utilizzando una penna.Bloccare la membrana con il buffer di blocco per almeno un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, le proteine di interesse vengono visualizzate mediante immunostaining utilizzando un anticorpo policlonale di coniglio diretto contro MxA come descritto nel protocollo testuale. Le virocelle prive di MxA endogeno sono state trasfettate con MxA di tipo selvaggio ricombinante e con varianti di MxA monomerico e dimerico.La migrazione della variante ricombinante di MxA al loro peso molecolare atteso ha confermato il loro stato oligomerico. La MxA di tipo selvaggio espressa ectopicamente ha migrato come un tetramero. Queste proteine ricombinanti sono state quindi utilizzate per valutare lo stato oligomerico della proteina MxA umana endogena ottenuta da cellule A549 stimolate con interferone-alfa.I risultati hanno rivelato che la dimensione di MxA nei lisati di cellule A549 stimolate con interferone-alfa corrisponde a un tetramero. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno e mezzo se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non congelare e scongelare i campioni durante l'intero procedimento, poiché ciò potrebbe distruggere le interazioni proteiche o causare aggregazioni proteiche.Inoltre, quando si lavora con reagenti sensibili alla luce, come l'iodoacetammide, è importante proteggere i campioni dalla luce durante il passaggio di lisi. Dopo l'elettroforesi su gel in condizioni non denaturanti con SDS-PAGE, è possibile eseguire altri metodi come l'estrazione proteica dal gel e l'attività enzimatica AsiS o una seconda dimensione di elettroforesi su gel per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sull'attività enzimatica e sulla caratterizzazione di potenziali complessi etero-oligomerici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare la composizione dei complessi proteici oligomerici in cellule in coltura.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare lisati cellulari da colture cellulari per studiare le proteine oligomeriche mediante analisi in PAGE non denaturante. Ricorda che il lavoro con l'iodoacetamide può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti e la protezione oculare devono essere sempre adottate.

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In questo video, si descrive la caratterizzazione di complessi multiproteici (PPM) di blu elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (BN-PAGE). In una prima dimensione, dializzati lisati cellulari sono separati da BN-PAGE per identificare i singoli PPM. In una seconda dimensione SDS-PAGE, PPM di interesse sono ulteriormente suddivisi per analizzare i loro elettori mediante immunoblotting.

Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l&#39;analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

Questo video mostra una tecnica di separazione denaturante basata su poliacrilammide per proteine. Questa tecnica aiuta nell'identificazione preliminare delle proteine in base al loro peso molecolare.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato per l'analisi delle proteine: una tecnica per separare e visualizzare le proteine in base al peso molecolare

Questo video descrive la PAGINA multimerica per la separazione di complessi proteici nativi da omogeneizzati tissutali. La tecnica è un ibrido tra le tecniche blue native-PAGE e SDS-PAGE. I complessi separati possono essere caratterizzati e studiati per il loro ruolo nel funzionamento cellulare.

Multimer-PAGE per la separazione di complessi proteici nativi: una tecnica di separazione ibrida costituita da Blue Native-PAGE e SDS-PAGE per separare le proteine multimeriche intatte dal lisato tissutale

In questo video, dimostriamo un metodo di elettroforesi su gel bidimensionale che separa singole proteine da una complessa miscela proteica ottenuta da tessuti tumorali di adenoma ipofisario umano non funzionale (NFPA). Le proteine vengono separate in base alla loro carica elettrica nella prima dimensione e ulteriormente separate in base ai pesi molecolari nella seconda dimensione.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide bidimensionale: una tecnica di separazione per l'analisi delle proteine in una miscela proteica complessa basata sulla carica e sul peso molecolare

Le mucine sono glicoconiugati ad alto peso molecolare, con dimensioni che vanno da 0,2 a 200 megadalton (MDa). A causa delle loro dimensioni, le mucine non penetrano nei gel di poliacrilammide convenzionali e richiedono pori più grandi per la separazione. Forniamo un protocollo dettagliato per l'elettroforesi su gel di mucina agarosio per valutare la quantificazione relativa e studiare l'assemblaggio del polimero.

Mucina Agarosio elettroforesi su gel: Western Blotting per glicoproteine ​​ad alto peso molecolare

L'oligomerizzazione del recettore della rianodina, un canale ionico omo-tetramerico che media il rilascio di Ca2+ dai depositi intracellulari, è fondamentale per la contrazione del muscolo scheletrico e cardiaco. Qui, presentiamo metodi complementari in vivo e in vitro per rilevare l'autoassociazione proteica e determinare la stechiometria omo-oligomera.

Approcci genetici e biochimici per<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

Metodo per la stabilizzazione e la separazione complessi proteici nativi di lisato tessuto non modificato utilizzando una proteina reticolante amminico reattivo accoppiato ad un romanzo elettroforesi bidimensionale poliacrilammide sistema (PAGE) è presentato.

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

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Questo protocollo descrive la separazione dei complessi funzionali della catena di trasporto elettronico mitocondriale (Cx) IV e dei suoi supercomplexi utilizzando l'elettroforesi nativa per rivelare informazioni sulla loro struttura e struttura. Il gel nativo può essere sottoposto a immunoblotting, analisi in-gel e purificazione mediante elettroelution per caratterizzare ulteriormente i singoli complessi.

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Un protocollo per la delucidazione della pianta thylakoid proteina complessa organizzazione e composizione con blu nativo poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) e 2D-SDS-PAGE è descritto. Il protocollo è ottimizzato per Arabidopsis thaliana, , ma può essere utilizzato per altre specie di piante con modifiche minori.

Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

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Caratterizzazione delle proteine mediante cromatografia di dimensioni-esclusione accoppiata alla dispersione luminosa multi-angolo (SEC-MALS)

Scopri come caratterizzare i complessi oligomerici della proteina MxA umana mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide non denaturante e western blot direttamente da lisati cellulari A549.

Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi (Video) | JoVE Journal

Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

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