Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare il numero di subunità in complessi proteici omooligomerici in lisati cellulari utilizzando l'elettroforesi su gel di sodio dodecosolfato-poliacrilammide non denaturante. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, come lo stato oligomerico delle proteine coinvolte nei processi cellulari fondamentali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede la purificazione dei complessi proteici omooligomerici o attrezzature specializzate e costose.

Pertanto, può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori. Questo esperimento utilizza due tipi di cellule. cellule A549 che esprimono la proteina A endogena di resistenza al mixovirus, o MxA; e virocelle che sovraesprimono MxA.

Seminare le cellule A549 e le virocelle in sei piastre a pozzetti con due millilitri di terreno di crescita per pozzetto. Incubare le cellule per una notte in un incubatore per colture cellulari. Il giorno seguente, raccogli le cellule.

Lavare ogni pozzetto con un millilitro di PBS e attaccare le cellule aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% per circa cinque minuti a temperatura ambiente. Non appena le cellule si staccano dalla piastra, aggiungere 0,5 millilitri di terreno di coltura e mescolare accuratamente pipettando su e giù. Trasferire le celle di ciascun pozzetto in una provetta da due millilitri e pellettare utilizzando una centrifuga da tavolo.

Rimuovere con cautela il surnatante pipettandolo senza disturbare il pellet cellulare. Lavare le cellule aggiungendo un millilitro di PBS ghiacciato e pipettando accuratamente la sospensione cellulare su e giù. Pellettare le celle in una centrifuga da tavolo.

Rimuovere con cautela il surnatante pipettandolo senza staccare il pellet cellulare. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi ghiacciata, risospendere le cellule pipettando su e giù, quindi posizionare sul ghiaccio. Proteggere immediatamente il lisato dalla luce coprendo le provette con carta stagnola perché lo iodoacetammide nel tampone di lisi è sensibile alla luce.

Incubare con ghiaccio per 30 minuti. L'uso della iodoacetammide è fondamentale perché la iodoacetamide protegge irreversibilmente il gruppo tiolico delle cisteine libere formando un legame tioetere e previene l'aggregazione proteica artificiale. Successivamente, rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione in una centrifuga da tavolo pre-raffreddata.

Durante la centrifugazione, preparare le colonne per dialisi con un cutoff di peso molecolare di 10.000. Collegare le colonne per dialisi a una boa galleggiante e posizionarle in un becher riempito con tampone per dialisi pre-raffreddato per equilibrare le colonne. Non toccare la membrana.

Posizionare un agitatore magnetico in un bicchiere e trasferire il bicchiere nella cella frigorifera. Utilizzando l'agitatore magnetico per garantire un'agitazione delicata, equilibrare per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo 20 minuti, rimuovere le colonne dal tampone per dialisi e dalla boa galleggiante.

Trasferire i lisati chiarificati nelle colonne di dialisi preparate mediante pipettaggio senza toccare la membrana. Attacca le colonne a una boa galleggiante. Rimetterli nel becher riempito con il tampone per dialisi, quindi trasferire il becher nella cella frigorifera.

Dializzare il lisato per almeno quattro ore a quattro gradi Celsius mescolando accuratamente con un agitatore magnetico per rimuovere piccoli metaboliti e sali che potrebbero interferire con l'elettroforesi su gel di poliacrilammide non denaturante. Al termine della dialisi, trasferire ciascun campione dializzato in una provetta da 1,5 millilitri. Rimuovere i precipitati mediante centrifugazione in una centrifuga da tavolo.

L'elettroforesi deve essere eseguita immediatamente dopo la dialisi dei lisati per prevenire la dissociazione dei complessi proteici oligomerici. Riempire la camera di gel interna ed esterna con un tampone di corsa pre-raffreddato. Pre-rotografare il gel di poliacrilammide non denaturante con tampone di corsa pre-raffreddato a 25 milliampere per gel per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Mescolare 15 microlitri del lisato preparato con cinque microlitri di tampone campione 4X. Caricare uno standard proteico nativo di scelta e 15 microlitri di campione sul gel. Far funzionare il gel a 25 milliampere per quattro ore a quattro gradi Celsius.

Quando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide non denaturante è completa, smontare il gel e trasferirlo con cura nel tampone SDS. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente. Preparare due spugne, quattro fogli di carta da filtro in cellulosa e una membrana assorbente per gel e immergerli nel tampone assorbente.

Assemblare il panino come segue dal basso verso l'alto. Una spugna, due fogli di carta da filtro in cellulosa, una membrana assorbente, il gel, due fogli di carta da filtro in cellulosa e una spugna. Mettere il sandwich nella vasca di asciugatura, assicurandosi che la membrana sia rivolta verso il polo positivo, mentre il gel è rivolto verso il polo negativo.

Riempire il serbatoio di tamponamento con tampone di assorbente pre-raffreddato. Per ottenere i migliori risultati di trasferimento delle proteine, tamponare a 90 milliampere durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, smonta il panino.

Incubare la membrana nella soluzione di Ponceau S per cinque minuti a temperatura ambiente per visualizzare lo standard proteico. Smacchiare la membrana mettendola in acqua deionizzata e lavandola. Dopo aver trasferito la membrana in un vassoio, segnare le bande dello standard proteico usando una penna.

Bloccare la membrana con il tampone bloccante per almeno un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, le proteine di interesse vengono visualizzate mediante immunocolorazione utilizzando un anticorpo policlonale di coniglio diretto contro MxA come descritto nel protocollo di testo. Le virocellule prive di MxA endogena sono state trasfettate con MxA wild type ricombinante e varianza MxA monomerica e dimerica.

La migrazione della varianza MxA ricombinante al loro peso molecolare atteso ha confermato il loro stato oligomerico. Il tipo selvatico MxA espresso ectopicamente è migrato come tetramero. Queste proteine ricombinanti sono state poi utilizzate per valutare lo stato oligomerico della proteina MxA umana endogena derivata da cellule A549 stimolate con interferone-alfa.

Il risultato ha rivelato che la dimensione di MxA nei lisati delle cellule A549 stimolate con interferone-alfa corrisponde a un tetramero. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno e mezzo se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non congelare e scongelare i campioni durante l'intera procedura, poiché ciò potrebbe distruggere le interazioni proteiche o causare aggregazioni proteiche.

Inoltre, quando si lavora con reagenti sensibili alla luce, come lo iodoacetammide, è importante proteggere i campioni dalla luce durante la fase di lisi. Dopo la SDS-PAGE non denaturante, possono essere eseguiti altri metodi come l'estrazione del gel proteico e l'attività enzimatica AsiS o un PAGE di seconda dimensione per rispondere a ulteriori domande come l'attività enzimatica e la caratterizzazione di potenziali complessi etero-oligomerici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare la composizione dei complessi proteici oligomerici nelle cellule in coltura.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare lisati cellulari da colture cellulari per studiare le proteine oligomeriche nell'analisi PAGE non denaturante. Non dimenticare che lavorare con lo iodoacetamide può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e proteggere gli occhi.