Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dell'intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

L'obiettivo generale di questo protocollo di quantificazione multiplex degli acidi nucleici è quantificare digitalmente l'espressione dei microRNA nel sangue intero. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio dei disturbi digestivi. Aiuta con l'identificazione di meccanismi molecolari disregolati e firme di biomarcatori, come i microRNA.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che la quantificazione dei microRNA non si basa sull'amplificazione. Questa tecnologia conta digitalmente i bersagli molecolari ed è in gran parte automatizzata. Per purificare l'RNA totale, scongelare e incubare campioni di sangue intero precedentemente raccolti e congelati per due ore.

Utilizzare un rotore a secchiello oscillante per centrifugare le provette a 5.000 volte g a temperatura ambiente per dieci minuti. Quindi, rimuovere i surnatanti versandoli con cura o pipettandoli in una provetta di scarico, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere quattro millilitri di acqua priva di RNasi al pellet.

Riposizionare saldamente il tappo e agitare fino a quando il pellet non si è visibilmente sciolto. Quindi, centrifugare nuovamente la provetta e rimuovere il surnatante. Quindi, aggiungere 350 microlitri di tampone BM1 al pellet e agitare fino a quando il pellet non è visibilmente sciolto.

Quindi, trasferire il campione in una provetta di lavorazione da due millilitri per l'estrazione automatizzata dell'RNA totale. Utilizzando un kit di estrazione dell'RNA disponibile in commercio, eseguire una purificazione automatizzata dell'RNA intracellulare, incluso il microRNA dal campione di sangue intero, caricando i puntali delle pipette precaricati, le provette da centrifuga, i tamponi e i reagenti forniti nel kit di purificazione dell'RNA nel sistema robotizzato di estrazione dell'RNA. Dal menu di selezione dei protocolli, scegli il protocollo Blood miRNA PartA e avvia la corsa.

Completa l'estrazione dell'RNA e conserva i campioni secondo il protocollo di testo. Preparare i campioni di microRNA utilizzando prima acqua priva di RNasi per normalizzare 12 campioni di RNA a 33 nanogrammi per microlitro. Con acqua priva di nucleasi, preparare una diluizione di 1 su 500 dei controlli dei microRNA forniti nel kit di analisi e conservare in ghiaccio.

Successivamente, preparare la miscela master di ricottura combinando 13 microlitri di tampone di ricottura, 26 microlitri di reagente micro R-tag e 6,5 microlitri di controlli microRNA. A ciascuna delle 12 provette da 0,2 millilitri, aggiungere 3,5 microlitri della miscela master di ricottura, quindi aggiungere 3 microlitri del campione di RNA. Muovere le provette per mescolarle, farle girare a 2000 volte g con una mini microcentrifuga da banco e far funzionare le provette in un termociclatore utilizzando il seguente programma.

Successivamente, preparare una miscela master di legatura combinando tre microlitri di tampone di legatura e 19,5 microlitri di PEG. Quindi, aggiungere 2,5 microlitri del master mix di legatura a ciascuna delle reazioni. Dopo aver mescolato e fatto girare i tubi, rimetterli nel termociclatore a 48 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi aggiungere un microlitro di ligasi direttamente a ciascun campione mentre è ancora nel blocco termociclatore e incubare le provette utilizzando il seguente programma. Mescolare delicatamente e far girare le provette e aggiungere un microlitro di enzima di pulizia della legatura a ciascun campione. Quindi, incubare le provette nel termociclatore come mostrato qui.

Dopo l'incubazione, aggiungere 40 microlitri di acqua priva di RNasi ai campioni prima di mescolarli e farli girare. Per eseguire l'ibridazione dei microRNA, scongelare il reporter e i set di sonde di cattura forniti sul ghiaccio e farli ruotare. Aggiungere 130 microlitri di tampone di ibridazione al Reporter Code Set 2 e mescolare per creare il master mix di ibridazione.

In 12 nuove provette da 0,2 millilitri, aggiungere 20 microlitri della miscela master di ibridazione. Denaturare i campioni di microRNA appena preparati a 85 gradi Celsius per cinque minuti e raffreddarli con ghiaccio. Quindi, aggiungere 5 microlitri di campioni di microRNA a ciascuna delle provette a striscia contenenti la miscela master di ibridazione.

Programmare il termociclatore a 65 gradi Celsius, a una temperatura calcolata in volume di 30 microlitri e il coperchio riscaldato all'impostazione dell'ora Forever in modo che non scenda a 4 gradi Celsius alla fine della seduta. Aggiungere 5 microlitri del set di sonda di acquisizione a ciascun tubo e mescolare. Quindi, dopo averli fatti girare, posizionare immediatamente i tubi nel termociclatore a 65 gradi Celsius.

Incubare i campioni per non meno di 12 ore e non più di 30 ore. Impostare la stazione di preparazione riscaldando prima la cartuccia e le piastre a temperatura ambiente. Quindi centrifugare i piatti.

Per caricare la stazione di preparazione, aprire lo sportello della stazione e caricare le piastre dei reagenti, la cartuccia, i puntali delle pipette, i campioni preparati in provette da 0,2 millilitri e due provette vuote da 12 provette da 0,2 millilitri nelle posizioni appropriate del robot. Rimuovere la striscia, i cappucci delle provette e il coperchio della piastra dei reagenti. Quindi, chiudere lo sportello della stazione di preparazione ed eseguire il test appropriato dal pannello di controllo.

Per visualizzare e contare i codici a barre dei complessi tripartiti immobilizzati e orientati, rimuovere la cartuccia dalla stazione di preparazione, utilizzare il coperchio in dotazione per sigillarla e posizionarla nell'analizzatore digitale in qualsiasi slot disponibile. Utilizzare il touch screen per creare un file di definizione della cartuccia, o CDF. Assicurarsi che il file della libreria reporter appropriato sia assegnato a ciascun campione nella CDF.

Una volta completata la scansione, scaricare i file di dati dall'analizzatore digitale utilizzando un'unità USB o via e-mail, prima di elaborare e analizzare i dati, secondo il protocollo di controllo qualità e analisi associato. Il sistema di analisi della piattaforma di espressione genica riduce il rumore tecnico grazie alla sua natura altamente automatizzata e la chimica unica che utilizza produce dati di espressione genica ad alta precisione. Le repliche tecniche qui mostrate dimostrano l'elevata riproducibilità nella quantificazione dell'espressione di microRNA sia endogena che virale.

Utilizzando questo metodo, i microRNA umani codificati viralmente ed endogeni che mostrano una deviazione dall'espressione prevista, come definita dai partecipanti sani allo studio, possono essere identificati come bersagli di interesse per l'IBS. La precisione e la sensibilità del metodo consentono di rilevare le perturbazioni tra i bersagli a bassa espressione e di osservare in modo affidabile anche le perturbazioni sottili. Queste cifre mostrano alcune delle perturbazioni nei microRNA circolanti nell'IBS e nei sottotipi di IBS, rispetto ai controlli sani.

I due microRNA differenzialmente elevati più significativi nei partecipanti all'IBS sono presentati qui. Le curve in questo grafico per violino indicano la frequenza dei conteggi per il miR-150. Le barre verticali rappresentano il primo e il terzo quartile e il quadrato rosso indica il conteggio mediano.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire saggi personalizzati più mirati basati sulla stessa tecnologia al fine di convalidare le firme dei biomarcatori in coorti più ampie ed esplorare le associazioni essenziali di RNA e proteine. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca biomedica per sviluppare rapidamente, con precisione e accuratezza, pannelli di biomarcatori diagnostici per la malattia.