Name: Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dellintestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Scopri la quantificazione digitale dei microRNA nel sangue per lo studio dei disturbi digestivi. Questa piattaforma automatizzata identifica meccanismi molecolari disregolati e biomarcatori nella sindrome dell'intestino irritabile senza amplificazione.

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Gli autori riconoscono il finanziamento da parte del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani degli Stati Uniti, il National Institutes of Health, il National Institute of Nursing Research e la Division of Intramural Research a Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; i premi per la formazione alla ricerca intramurale a Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey e Leeanne B. Sherwin; e il sostegno speciale del Burroughs Wellcome Fund a Ralph M. Peace, ricercatore Howard Hughes-NIH. 
Le opinioni espresse nel presente documento e l'interpretazione e la segnalazione di questi dati sono responsabilità dell'autore (o degli autori) e non devono essere viste come una raccomandazione, interpretazione o politica ufficiale del National Institutes of Health o del governo degli Stati Uniti.

La ricerca descritta qui è stato approvato dal Institutional Review Board del National Institutes of Health (Clinicaltrial.gov # NCT00824941). 1. Raccolta di campioni di sangue intero <ol><li> Raccogliere campioni di sangue intero (2,5 ml) di partecipanti allo studio tramite prelievo venoso in provette per il prelievo del sangue contenenti una soluzione di RNA di stabilizzazione (che consente per la conservazione a lungo termine), e conservarli a -80 ° C fino a quando la purificazione di RNA. </li></ol> 2. RNA totale purificazione <ol><li> Scongelare e incubare le provette di sangue per 2 ore, quindi si centrifuga utilizzando un rotore swing-out per 10 min a 5000 x g. Rimuovere il surnatante con attenzione versando o pipettando fuori in un tubo di scarico, facendo attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Lavare il pellet con l&#39;aggiunta di 4 ml di acqua priva di RNasi, sostituire il tappo in modo sicuro, e vortex fino a quando il pellet è visibilmente sciolto. Centrifuga utilizzando un rotore basculante a 5.000 xg per 10 min e rispostare il surnatante, come descritto al punto 2.1. </li><li> Aggiungere 350 pl di tampone di BM1 (fornita) al pellet. Vortex il pellet finché non viene visibilmente sciolta e trasferisce ad un tubo di elaborazione 2 ml per l&#39;estrazione di RNA totale automatizzato. </li><li> Eseguire la purificazione automatizzata di RNA intracellulare, compresi miRNA, dal sangue intero utilizzando un kit di estrazione di RNA in commercio, che può essere automatizzato in un sistema di estrazione di RNA robotico. NOTA: Il sistema robotico automatizzato abbiamo usato può elaborare dodici campioni alla volta, e richiede 3 ore per il protocollo di purificazione dell&#39;RNA per completare. <ol><li> Caricare i puntali pre-caricati, provette da centrifuga, tamponi e reagenti forniti nel kit di purificazione dell&#39;RNA nel sistema di estrazione di RNA robotico. </li><li> Selezionare il protocollo &quot;Blood miRNA Parte A&quot; dal menu di selezione del protocollo e iniziare la corsa. NOTA: Vedere materiali supplementari per una descrizione delle procedure automatizzate. </li><li> Una volta che il robot ha completed parte A del protocollo automatizzato di purificazione miRNA, svuotare il contenitore dei rifiuti e rimuovere i materiali plastici utilizzati e contenitori dei reagenti dal sistema robotico. </li><li> Chiudere i coperchi su tutti i tubi di micro-centrifuga contenenti RNA eluizione e metterli l&#39;adattatore shaker. Selezionare &quot;Blood miRNA Parte B&quot; dal menu di selezione del protocollo per incubare i campioni a 65 ° C per 5 min. </li><li> Una volta che il robot ha completato l&#39;esecuzione, parte B del protocollo di purificazione miRNA, rimuovere immediatamente i campioni e li raffreddare sul ghiaccio. </li></ol></li><li> Quantificare e valutare la qualità dell&#39;RNA purificato utilizzando uno spettrofotometro. NOTA: Come per le raccomandazioni di protocollo per il dosaggio miRNA, una concentrazione minima di 33 ng / ml è richiesto, e tutti i campioni devono soddisfare o superare un rapporto 280/260 di 1,9 e un rapporto minimo 260/230 di 1,8 per garantire l&#39;assenza di contaminazione organica significativa, che può influenzare le prestazioni del dosaggio (vedi riferimento 17). </li><li> Conservare i campioni a -80 ° C. </li></ol> 3. miRNA Preparazione del campione <ol><li> Normalizzare 12 campioni di RNA a 33 ng / ml con acqua priva di nucleasi. </li><li> Preparare una diluizione 1: 500 dei controlli miRNA forniti nel kit di analisi utilizzando acqua priva di nucleasi. Tenere in ghiaccio. </li><li> Preparare la master mix di ricottura: unire 13 ml di buffer di ricottura (in dotazione), 26 ml di miRtag reagenti (in dotazione), e 6,5 ml di controlli miRNA (previste al punto 3.2) utilizzando 10- e pipette 20-microlitri. </li><li> Usando una pipetta 10 microlitri, aggiungere 3,5 microlitri della master mix ricottura e 3 ml di campione di RNA (cioè, 100 ng) a ciascuno dei dodici tubi striscia 0,2 ml. Flick per mescolare, girare verso il basso con un banco frigo microcentrifuga (2.000 xg), e posto nel termociclatore (94 ° C per 1 min, 65 ° C per 2 minuti e 45 ° C per 10 min; tenere a 48 ° C) . </li><li> Preparare la master mix legatura combinando 3 μl di tampone di ligasi (fornito) e 19,5 ml di polietilenglicole (PEG; forniti) usando una pipetta 20 microlitri. Aggiungere 2,5 ml di master mix legatura a ciascuno dei tubi striscia dal passaggio 3,4 utilizzando una pipetta 10 microlitri. <ol><li> Mescolare delicatamente, spin down con un mini microcentrifuga (2.000 xg), e tornare al termociclatore a 48 ° C per 5 min. Dopo 5 minuti, utilizzando una pipetta da 10 ml, aggiungere 1 ml di ligasi direttamente a ciascuna provetta nel termociclatore ed incubare loro a 48 ° C per 3 minuti, 47 ° C per 3 minuti, 46 ° C per 3 minuti, 45 o C per 5 min, e 65 o C 10 min; tenere a 4 ° C. </li></ol></li><li> Rimuovere i tubi dal termociclatore, mescolare delicatamente, girare giù utilizzando un banco mini microcentrifuga (2.000 xg), e aggiungere 1 ml di legatura enzima clean-up (in dotazione). Incubare le provette nel termociclatore (37 ° C per 1 ora e 70 ° C per 10 min; mantenere a 4 o </sup&gt; C). Utilizzare una pipetta 10 microlitri. </li><li> Rimuovere i tubi e, utilizzando una pipetta da 100 ml, aggiungere 40 ml di acqua priva di nucleasi, mescolare e far girare verso il basso con un mini microcentrifuga (2.000 x g). </li></ol> 4. miRNA Ibridazione <ol><li> Scongelare il giornalista e set sonda di cattura (in dotazione) sul ghiaccio e spin giù utilizzando un mini microcentrifuga (2.000 x g). </li><li> Usando una pipetta da 200 ml, aggiungere 130 ml di tampone di ibridazione per il tubo set di codici giornalista (130 ml) per creare il master mix di ibridazione. Mescolare e far girare verso il basso con un mini microcentrifuga (2.000 x g). NOTA: Reporter e cattura le sonde sono specifici e standard per ogni miRNA incluso nel pannello. pannelli personalizzati e di cattura e sonda set progettate dall&#39;utente possono essere progettati. </li><li> In 12 nuovi tubi striscia di 0,2 ml, aggiungere 20 microlitri della master mix di ibridazione con una pipetta da 20 ml. </li><li> Denaturare i campioni miRNA dal punto 3.7 a 85 ° C FOr 5 min e raffreddare su ghiaccio. Aggiungere 5 microlitri di ciascuno dei tubi di passaggio 4,3 utilizzando una pipetta 10 microlitri. </li><li> Programmare il termociclatore a 65 ° C in 30 microlitri volume-calcolata la temperatura e coperchio riscaldato al sempre impostazione dell&#39;ora (non programmarlo di rampa fino a 4 ° C al termine della corsa). </li><li> Usando una pipetta 10 ml, aggiungere 5 ml della sonda cattura impostato su ciascun tubo, mescolare, girare verso il basso con un banco frigo microcentrifuga (2.000 xg), e collocare immediatamente nel termociclatore a 65 ° C. Incubare per non meno di 12 ore e non più di 30 ore. </li></ol> Stazione della preparazione 5. e analizzatore digitale <ol><li> Caricare la stazione della preparazione. <ol><li> Aprire la porta della stazione e caricare le piastre dei reagenti (in dotazione), la cartuccia (fornito), puntali (in dotazione), campioni preparati in dodici tubi striscia di 0,2 ml, e dodici vuoti tubi striscia 0,2 ml (fornito). Rimuovere i tappi dei tubi striscia e la copertura del piatto reagente. Chiudere il prep-stationporta ed eseguire il dosaggio appropriato dal pannello di controllo. NOTA: l&#39;elaborazione post-ibridazione è lo stesso, indipendentemente dal dosaggio in esecuzione. Tutti i reagenti e prodotti di plastica sono preconfezionate e non richiedono preparazione, diverso portandoli a temperatura ambiente e girare le piastre a 96 pozzetti contenenti reagenti a 2.000 xg per 2 min. Tutti i componenti vengono caricati in posizioni ben definite nella stazione di preparazione. Vedere materiali supplementari per una descrizione delle procedure automatizzate. </li></ol></li><li> Visualizzare e contare i codici a barre dei complessi tripartiti immobilizzati e orientate. <ol><li> Rimuovere la cartuccia dalla stazione della preparazione, sigillare con le scivola copertura fornita, e posizionarlo nella analizzatore digitale nello slot sopra l&#39;ottica della fotocamera. </li><li> Selezionare il dosaggio appropriato (saggio pannello miRNA) e la versione test indicato sul kit di analisi ed eseguire il programma. NOTA: L&#39;analizzatore digitale poi prende campo di visualizzare le immagini per ogni posizione campione di unt quattro lunghezze d&#39;onda di eccitazione, permettendo i codici a barre fluorescenti per essere letti e decodificati. Codici a barre specifici, corrispondenti ad una specifica miRNA, sono contati. </li><li> Esportare i file di dati a una porta USB o direttamente al server tramite un collegamento internet. </li></ol></li></ol> 6. Elaborazione dati e analisi <ol><li> Fare clic sulla scheda &quot;dati grezzi&quot; e selezionare &quot;Importa RCC Files&quot;. Selezionare la cartella contenente i file RCC (file di dati grezzi) dal USB. </li><li> Fare clic su &quot;Avanti&quot;, selezionare tutte le caselle di controllo di qualità, e fare clic su &quot;Importa&quot;. </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Nuovo studio&quot;. Nome e descrivere lo studio e risparmiare. </li><li> Nel nuovo studio, selezionare la scheda &quot;nuovo esperimento&quot; e il nome e descrivere il nuovo esperimento. Fai clic su &quot;Avanti&quot; e selezionare la cartella RLF dal riquadro sinistro che contiene i file di dati grezzi rilevanti che sono stati caricati. Una volta selezionato, cliccare su &quot;Keep Selected&quot;, e quindi fare clic su &quot;Avanti&quot;. </li><li> Aggiungerele annotazioni se desiderato e fare clic su &quot;Avanti&quot;. </li><li> Selezionare il metodo di sottrazione dello sfondo; o controllo negativo, corsia sottrazione vuoto, o una sottrazione definita dall&#39;utente possono essere selezionati. Una volta selezionato, cliccare su &quot;Next&quot;. NOTA: Determinare l&#39;approccio correzione del fondo più appropriato in base ai parametri tecnici e contesto biologico dello studio. NOTA: Conti sono meno precisi per gli obiettivi a bassa abbondanza. Ai fini dello studio descriviamo qui, i dati sono stati prima trattati senza la correzione del fondo al fine di esaminare i parametri di controllo di qualità e di esaminare la variazione della conta per miRNA di differenti abbondanze attraverso replicati tecnici. I dati sono stati poi rielaborati con una soglia di sfondo 25-count. </li><li> Selezionare la &quot;Top 100&quot; normalizzazione, e quindi fare clic su &quot;Avanti&quot;. </li><li> Per ottenere i dati del rapporto, selezionare i parametri di rapporto, e quindi fare clic su &quot;Avanti&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;Finito&quot;. </li><li> Fare clic sul nome dell&#39;exsperi- nel riquadro di sinistra per rivelare un menu a tendina contenente &quot;Raw&quot;, &quot;normalizzata&quot;, &quot;raggruppato&quot;, &quot;Rapporto di dati&quot;, e &quot;Analisi dei dati&quot;. </li><li> Clicca su &quot;dati grezzi&quot; e osservare un rapporto di controllo di qualità nel riquadro di destra. Osservare una bandiera accanto ai campioni che non passano i parametri di default QC. Costruire un nuovo &quot;Studio&quot;, che non include i campioni contrassegnati e rielaborare come descritto, o semplicemente escludere contrassegnate campioni QC dalla fase di analisi dei dati selezionando &quot;Escludi campioni di QC bandiera / normalizzazione&quot;. <ol><li> Export &quot;prime&quot;, &quot;normalizzato&quot;, o file di dati &quot;raggruppato&quot; nel CVS o un altro formato di file compatibile per l&#39;analisi in un altro software statistico o microarray. </li></ol></li><li> Selezionare &quot;normalizzato dati&quot; dal riquadro a sinistra e selezionare i campioni da includere nell&#39;analisi nel riquadro di destra. </li><li> Clicca su &quot;Analisi&quot; e selezionare il tipo di analisi desiderata (ad esempio, &quot;Heat Map &amp; #34 ;, &quot;Violino Plot&quot;, &quot;Box Plot&quot;, &quot;Scatter Plot&quot;, o &quot;Istogramma Plot&quot;). Selezionare le caselle desiderate criteri di esclusione (ad esempio, escludere i campioni outlier o geni, escludere i campioni da bandiere QC, escludere i geni di controllo, e / o escludere le sonde di normalizzazione di analisi dei dati). </li><li> Selezionare singoli campioni da escludere dall&#39;analisi, se lo desideri. </li><li> Selezionare singoli geni ad essere escluso o incluso nell&#39;analisi, se lo desideri. </li><li> Selezionare i parametri per la manipolazione statistica o la visualizzazione dei dati selezionati e fare clic su &quot;Fine&quot;. </li></ol>

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W.A.H., S.K.A., N.H.F. e R.M.P. sono titolari di un brevetto statunitense (n. PCT/US14/38638) per una firma di miRNA circolante di IBS derivante dalla ricerca qui descritta.

I passaggi critici all&#39;interno del protocollo Per il saggio miRNA in particolare, è fondamentale non usare lisati non purificati (questi possono essere utilizzati in mRNA e saggi proteici), come i reagenti non sono stati ottimizzati per l&#39;uso con lisati e reazioni preparazione del campione sono suscettibili di essere inibita. Inoltre, i contaminanti riportati dal gradini lisi e RNA depurazione (per esempio, composti guanidinio, etanolo, e fenoli) possono inibire le reazioni legatura e purificazione del campione. RNA buona qualità è quindi fondamentale per la sensibilità e l&#39;accuratezza del test miRNA. Utilizzando un termociclatore con un coperchio riscaldato è fondamentale per garantire il controllo della temperatura adeguata per migliorare il rendimento di tutte le fasi di reazione. Durante il passaggio 3.5.1, è importante non rimuovere le strisce del termociclatore in modo da mantenere la temperatura durante l&#39;aggiunta della ligasi. Rimuovere le strisce per aggiungere la ligasicomprometterà la reazione. Quando si esegue la procedura di ibridazione, è fondamentale per evitare di muovere vigorosa, pipettaggio, o sfogliando durante la miscelazione dei reagenti nei tubi, in quanto ciò potrebbe tosare le sonde Reporter. Per garantire prestazioni ottimali e consistenza, è importante per mescolare completamente i reagenti nei tubi delicatamente sfogliando. girare sempre verso il basso le reazioni dopo la miscelazione, e utilizzare una nuova pipetta punta ogni volta che un reagente viene erogata per garantire pipettaggio preciso e per evitare accidentali contaminazione incrociata. Modifiche e risoluzione dei problemi I set di codici possono essere personalizzati per includere solo gli obiettivi di interesse. In questo modo, i costi possono essere equilibrati per consentire la verifica di grandi insiemi di campioni quando ulteriori indagini o la convalida di un bio-firma. Sonde personalizzate possono essere progettati per geni o meno destinazioni disponibili dal menu a la carte. La sensibilità per gli obiettivi meno abbondanti o RNA a bassa concentrazione può esseremanipolato consentendo per un tempo più lungo di ibridazione e / o utilizzando conteggio digitale risoluzione superiore. Nel nostro studio abbiamo usato il predefinito 800 bersaglio pannello di miRNA con RNA totale da sangue intero; tuttavia, i test possono essere personalizzati per includere un minor numero di miRNA, se è necessario un approccio più mirato. Un totale di 24 campioni può essere preparato in un solo giorno, sfalsati in due gruppi di 12, perché due cartucce possono comodamente essere passati attraverso l&#39;elaborazione post-ibridazione sulla stazione della preparazione robotica e ripreso l&#39;analizzatore digitale il giorno successivo. trasformazione sfalsato dei campioni in lotti di 12 è importante per standardizzare il tempo di ibridazione. Le cartucce che sono stati immaginati possono essere salvati e conservati a 4 ° C per essere di nuovo a scansione se le analisi di dati suggeriscono che una scansione a risoluzione più elevata può migliorare l&#39;individuazione dei miRNA più rari. Il rilevamento di molecole più rari può anche essere migliorata ibridare i campioni più a lungo; tuttavia, l&#39;ibridazione prolungato può Result in sovrasaturazione e può solo migliorare i risultati se le concentrazioni di partenza di RNA sono bassi (come nel extracellulare RNA vescicole-derivato). la sensibilità e la precisione della piattaforma permettono relativamente miRNA bassa abbondanza da contare in modo affidabile. LIMITI DELLA TECNICA La piattaforma di test di espressione genica descritto può ospitare solo fino a 800 bersagli per array. Non è quindi adatto per gli studi trascrittoma intero complesso miRNA-trascrittoma /. Solo noti, descritti, e gli obiettivi specifici possono essere rilevati utilizzando la piattaforma, quindi non è adatto per la scoperta di nuove specie molecolari. Altri metodi, come RNA-Seq o altri metodi tradizionali microarray, sono più adatti a tutto il trascrittoma studi esplorativi. Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi / IBS è caratterizzato da una combinazione di sintomi, prinpalmente tra cui dolori addominali; ipersensibilità viscerale; e cambiamenti nelle abitudini intestinali, come diarrea frequente, costipazione, o una combinazione di entrambi 9,10. Sintomi di IBS non hanno causa organica conosciuta, ed i pazienti non presentano con l&#39;infiammazione clinicamente significativa, perturbazioni istopatologiche di tessuti gastrointestinali, o marcatori sistemici 9-12. La ricerca suggerisce che disregolazione biologica in IBS è sottile, subclinica, ed eterogeneo, con temi comuni emergenti di tutto l&#39;infiammazione e immune funzione 10. Pertanto, abbiamo bisogno di controllare la variazione sperimentatore-introdotto e utilizzare una piattaforma che era in grado di rilevare in modo affidabile perturbazioni sottili di espressione genica. Le caratteristiche uniche del saggio e del sistema standardizzare campione di trasformazione e di ridurre sperimentatore gestione attraverso l&#39;automazione, la riduzione della varianza tecnica di produrre dati altamente riproducibili. Queste caratteristiche consentono di indagini mirate e producono molto preciso e rdati eplicable. Questo permette la rilevazione di perturbazioni sottili e perturbazioni tra obiettivi bassa espressione che può essere trascurato o sommersi dai segnali di bersagli più abbondanti utilizzando intensity- o amplificazione basati i metodi. microarrays basati sulla PCR e metodi di RNA-Seq sono valide alternative per l&#39;utilizzo della piattaforma descritto e possono essere attraente come alternativa quando throughput più elevati sono necessari o quando l&#39;obiettivo è quello di caratterizzare l&#39;intero trascrittoma o per cercare nuove molecole. Tuttavia, alternative non possono eseguire così in modo accurato e sensibile il rilevamento e la quantificazione degli obiettivi rare e perturbazioni sottili. Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica Di circolazione miRNA nei partecipanti IBS ha mostrato una serie di perturbazioni che sono stati trovati ad essere sia significativo e coerente all&#39;interno delle categorie. I miRNA identificati sono stati associati con pathwa rilevantiys e condizioni patologiche, tra cui una condizione funzionale del dolore (miR-342-3p: dolore vescicale cronica) 8 e l&#39;infiammazione (miR-150) 13. Lo studio esempio è stato basato su una coorte esplorativo utilizzato per definire obiettivi e sistemi di interesse. Una più mirato, più piccola serie miRNA è stata poi costruita, abbassando il costo per ogni campione e consentendo coorti molto più grandi da analizzare in un modo economicamente efficace, al fine di convalidare e perfezionare le firme e biomarcatori. Il sistema di analisi piattaforma di espressione genica rappresenta un equilibrio tra la natura esplorativa tradizionale del microarray e più mirato, la raccolta dei dati ipotesi-driven per affinare e testare le firme molecolari e biomarcatori 14-16. Il metodo viene usato per esaminare perturbazioni molecolari e proteine in vivo e in vitro dove i miRNA bersaglio descritti sono sperimentalmente over-espressa o inibita. Nuovi saggi consentono la quantificazione simultanea di mRNA e proteins direttamente da lisati di cellule e tessuti. Inoltre, ottimizzando la purificazione di frazioni specifiche di sangue periferico e escrementi (ad esempio, l&#39;urina) e di ottimizzare e migliorare alcuni parametri del test, i profili molecolari e firme di frazioni concentrazione molecolare basso (ad esempio, frazioni exosomal) saranno esaminati.

Sindrome dell&#39;intestino irritabile (IBS) è la diagnosi ambulatoriale più comune in Gastroenterologia, affligge 10 - 15% della popolazione generale e rappresenta un onere rilevante per i servizi sanitari. Biomarker diagnostici Attualmente, non esistono generalmente accettato per IBS (vale a dire, la diagnosi si basa sui sintomi clinici e di escludere altre patologie organiche, come GI tumori maligni, malattie infiammatorie intestinali, e gastrointestinale (GI) infezioni). Quando si studiano i profili di espressione genica in condizioni comuni con istopatologia subclinico, come IBS, alta sensibilità e precisione (riproducibilità) sono necessari, come perturbazioni in profili di espressione genica sono spesso sottili 1-3. miRNA sono stati identificati come obiettivi sia diagnostiche e funzionali in IBS 4,5, e siamo particolarmente interessati a valutare il loro uso come biomarcatori di IBS-associati perturbazioni biologiche 3,4,6,7 circolanti. L&#39;utilizzo clinico di circulabiomarcatori Ting è di interesse attuale a causa della facilità e della natura minimamente invasiva della collezione della fonte di biomarcatori &#39;(ad esempio, sangue periferico) da pazienti. Gene test piattaforma di espressione, a causa della loro chimica unica e semplificata, il flusso di lavoro in gran parte automatizzato, forniscono una piattaforma microarray che fornisce ampia e personalizzabile di copertura (800 obiettivi in ​​una singola reazione) del trascrittoma per la scoperta mirata. Essi producono anche di alta precisione e linearità su un ampio spettro di livelli di espressione nella quantificazione degli obiettivi di trascrittomica. Il test non richiede la trascrizione inversa di RNA, l&#39;amplificazione del cDNA risultante, o altre reazioni enzimatiche. Pertanto, eventuali errori introdotti dai numeri cicli elevati di amplificazione da specie di RNA a bassa abbondanza o varianti di splicing rare sono ridotte dal processo di conteggio digitali. Ciò significa che una grande varietà di tipi di campioni, come totale purificatoRNA (cioè, mRNA + miRNA), RNA da (FFPE) campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina, nonché lisati di tessuto greggio e cellulari, può essere utilizzato con i saggi. RNA di interesse vengono rilevati utilizzando una coppia di sonde (cattura e sonde giornalista), ciascuno contenente una specifica sequenza bersaglio che riconosce una regione corrispondente RNA bersaglio. Al fine di garantire il rilevamento di RNA corte (cioè, miRNA), la sequenza miRNA maturo è allungato da ricottura a tag oligonucleotide unico (miRtag) all&#39;estremità 3 &#39;della molecola. Un oligonucleotide ponte, che è gratuito per una parte sia del bersaglio maturo miRNA e miRNA specifico miRtag, viene utilizzato per garantire la sequenza specificità. Cattura e giornalista sonde legare al 3 &#39;e 5&#39; estremità del complesso maturo miRNA-miRtag, rispettivamente. Le sonde di cattura hanno un&#39;etichetta biotina all&#39;estremità 3 &#39;, che consentono loro di attaccarsi alla superficie di un vetrino streptavidina rivestite, Fixing la cattura della sonda-miRNA-miRtag-giornalista complesso sonda alla diapositiva. Una corrente elettrica viene quindi utilizzato per orientare il complesso sulla superficie di scorrimento, consentendo barre fluorescenti effettuate dalla sonda reporter estremità 5 &#39;per essere osservata con un microscopio e charge-coupled device fotocamera (CCD). I codici a barre sono contati e decodificati, ottenendo un conteggio degli specifici miRNA bersaglio. Il codice a barre fluorescenti consiste di sei posizioni che possono essere occupati da uno dei quattro colori fluorescenti, che possono essere usati per costruire oltre 4.000 combinazioni di colore-codici a barre, ciascuna codifica per un RNA specifico. Preparazione del campione (cioè, purificazione dell&#39;RNA o cellule / tessuti Preparazione lisato), così come l&#39;ibridazione delle sonde di cattura e giornalista, vengono eseguite al banco. Dodici i campioni possono essere multiplex su una singola diapositiva. Dopo l&#39;ibridazione overnight, ogni ulteriore preparazione del campione viene effettuata da una stazione di preparazione robotica. I vetrini caricati vengono poi trasferiti annuncioanalizzatore igital per l&#39;imaging, il conteggio, la decodifica e l&#39;elaborazione dei dati. I dati risultanti vengono importati al software di accompagnamento, in cui vengono successivamente trattati con un alto grado di controllo utente. La chimica unica, semplice preparazione, la natura automatizzata, semplice tipo di dati (conteggi), e flusso di lavoro complessivo del saggio facilitare ad alta precisione l&#39;espressione genica quantificazione, che lo rende uno strumento utile per lo studio circolanti profili di espressione dei miRNA e firme in condizioni funzionali come IBS.

<table><tbody><tr><td>nCounter Prep-Station</td><td>Nanostring</td><td>N/A</td><td>Analizzatore</td></tr><tr><td>digitale nCounter</td> Essential <td>Nanostring</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td> essenziale <td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Può utilizzare</td></tr> una <tr><td>centrifuga</td> equivalente adatta <td>Qualsiasi</td><td>N/A</td><td>Può utilizzare</td></tr> una <tr><td>MiniMicroCentrifuga</td> equivalente adatta <td>Qualsiasi</td><td>N/A</td> Può <td>utilizzare Pipette equivalenti adatte</td></tr><tr><td>(1.000, 100, 20, 10 &#181; l)</td><td>Qualsiasi</td><td>N/A</td><td>Può utilizzare l'equivalente adatto</td></tr><tr><td>Qiacube</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>Può utilizzare l'equivalente adatto</td></tr><tr><td>PAXgene Blood miRNA Kit</td><td>Qiagen</td><td>763134</td><td>Può utilizzare l'equivalente adatto</td></tr><tr><td>PAXgene Blood Tubes</td><td>VWR</td><td>77776-026</td><td>Può utilizzare l'equivalente adatto</td></tr><tr><td>nCounter Human miRNA Assay Kit</td><td>Nanostring</td><td>150625</td><td>Essential</td></tr><tr><td>nCounter Master Kit</td><td>Nanostring</td><td>100050</td><td>Essential</td></tr><tr><td>nSolver</td><td>Nanostring</td><td>N/A</td><td>Essential</td></tr></tbody></table>

perturbazioni di circolazione mirna nella sindrome dell&#39;intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Il saggio piattaforma di espressione genica permette robusta e altamente riproducibili quantificazione dell&#39;espressione di fino a 800 trascritti (mRNA o miRNA) in una singola reazione. Il saggio miRNA conta trascrizioni per l&#39;imaging diretto e contando digitalmente molecole miRNA che sono etichettati con i set di colorati fluorescenti codice a barre della sonda (una sonda giornalista e una sonda di cattura). I codici a barre sono ibridate direttamente a maturare miRNA che sono stati allungati legando un tag oligonucleotide unico (miRtag) alla fine del 3 &#39;. trascrizione inversa e l&#39;amplificazione delle trascrizioni non sono richiesti. sonde Reporter contengono una sequenza di sei posizioni a colori popolate utilizzando una combinazione di quattro colori fluorescenti. I quattro colori oltre sei posizioni sono utilizzati per costruire una sequenza di colori del codice a barre gene-specifica. l&#39;elaborazione post-ibridazione è automatizzato su una stazione della preparazione robotica. Dopo l&#39;ibridazione, le sonde in eccesso vengono spazzate via, e le strutture tripartite (Capture Proessere-miRNA-giornalista sonda) sono fissati ad una slitta streptavidina rivestite tramite la sonda di cattura marcato con biotina. Imaging e codice a barre il conteggio viene fatto utilizzando un analizzatore digitale. I miRNA con codici a barre immobilizzati vengono visualizzati e ripreso con un microscopio e fotocamera, e i codici a barre unici sono decodificati e contati. il controllo di qualità dei dati (QC), la normalizzazione, e l&#39;analisi sono facilitate da un software di elaborazione e analisi dei dati custom-designed che accompagna il software di analisi. Il saggio dimostra elevata linearità su una vasta gamma di espressione, così come l&#39;alta sensibilità. Campione e la preparazione del test non comporta reazioni enzimatiche, trascrizione inversa, o di amplificazione; ha pochi passi; ed è in gran parte automatizzato, riducendo gli effetti investigatore e conseguente elevata consistenza e riproducibilità tecnica. Qui, descriviamo l&#39;applicazione di questa tecnologia per identificare circolanti perturbazioni miRNA nella sindrome dell&#39;intestino irritabile.

perturbazione trascrittomica in disturbi funzionali può essere sottile, e al fine di rilevare in modo affidabile i sottili cambiamenti nell&#39;espressione, quantificazione dell&#39;espressione genica deve essere preciso. Il sistema di espressione genica saggio piattaforma riduce il rumore tecnica attraverso la sua natura altamente automatizzato, e la chimica unica utilizza produce dati di espressione genica di alta precisione. Tecnico replica i mostrato in Figura 1 dimostrano l&#39;alta riproducibilità in entrambe le endogeni (punti blu) e virali miRNA (puntini arancioni; geni housekeeping sono rappresentati da puntini gialli) espressione quantificazione che è possibile con questo metodo. Utilizzando questo metodo, virale (Figura 2a) ed endogeno (Figura 2b) miRNA che mostrano deviazione dalla espressione, come definita dai partecipanti allo studio sani, possono essere identificati come bersagli di interesse IBS. Va notato che non è chiaro se i miRNA viralirilevato qui derivano da geni virali integrate nel genoma umano o da carica virale. Come il saggio conta solo miRNA maturi con singolo nucleotide specificità, ibridazione incrociata con simili miRNA umani endogeni è improbabile. Tuttavia, i livelli differenziali steady-state di queste molecole sono di interesse come biomarcatori. La precisione del metodo consente perturbazioni tra obiettivi ridotti espressione da rilevare, il rilevamento accurato di tali trascrizioni non sono sommersi da trascritti più abbondanti. Perturbazioni sottili possono anche essere affidabile osservate. Le figure 3 e 4 mostrano alcune di queste perturbazioni in circolazione miRNA in IBS e IBS-sottotipi rispetto ai controlli sani, e figure 5 e 6 (sia adattato da 3) mostrano i due più significativi miRNA differenziale elevati (Figura 5: miRNA 342-3p, Figura 6: miRNA 150). nei partecipanti IBS figura 6<html> è un esempio di uscita grafica dei risultati generati dal software collegato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig1.jpg" /> . Figura 1: Conti normalizzati da due repliche tecniche tecnico replica i eseguito su due cartucce separate mostrano un&#39;alta correlazione lineare (R 2 = 0,90, y = 1.03x - 0,4) su tutta la gamma della normalizzato (al top 100 hanno espresso miRNA) miRNA conteggi (conteggi log2 sulla X e Y). Il grafico a dispersione include i dati per miRNA umani endogeni in blu (654 miRNA), miRNA virali endogeni in arancione (80 miRNA), e geni housekeeping in giallo (8 geni). miRNA virali endogeni erano disponibili sulle versioni precedenti del test (versione 1.4 è stato utilizzato qui), ma non sono più inclusi nel test standard, anche se sono disponibili come aggiunte personalizzate./54693fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig2.jpg" /> Figura 2:. Conti normalizzata virale ed endogeni miRNA umani in IBS-costipazione (IBS- C) rispetto a controlli sani Perturbazioni in (a) virale (arancione) e (b) miRNA umani endogeni (blu) sono evidenti in questo esempio, in cui conta miRNA (log2 trasformati) dei partecipanti IBS-C (asse y) sono regrediti contro i conteggi dei miRNA (log2 trasformata) di controlli sani (asse x). La maggior parte dei miRNA esprimere molto simile in entrambe le popolazioni, ma alcuni in particolare si discostano dalla correlazione. Queste deviazioni sono evidenti sia tra i bersagli e rare abbondantemente espressi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig2large.jpg" target="_blank">Si prega</a>clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig3.jpg" /> Figura 3:. MiRNA sono significativamente ed uniformemente differentemente espressi in IBS rispetto ai controlli sani differentemente espressi miRNA in IBS sono rivelate secondo il metodo dimensione lineare discriminante effetto di analisi, che combina i test di significatività statistica con i controlli per coerenza all&#39;interno delle categorie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig4.jpg" /> Figura 4:. MiRNA sono significativamente ed uniformemente differentemente espressi in IBS sottotipi rispetto ai controlli sani miRNA sono stati differentially espresso in IBS-sottotipi (-D: diarrea, -C: costipazione). rispetto ai controlli sani con il metodo dimensione lineare discriminante effetto di analisi, che combina i test di significatività statistica con i controlli per coerenza all&#39;interno delle categorie <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig5.jpg" /> Figura 5:. Espressione differenziale di miRNA-342-3p cronico dolore addominale di eziologia sconosciuta è un sintomo principale della IBS. Il box plot dimostra che miR-342-3p (conteggi normalizzati sul asse y), un miRNA associata a dolore vescicale cronica ad eziologia sconosciuta, è stato trovato ad essere presenti in circolazione alla conta più elevati in tutti i sottotipi di IBS rispetto ai controlli sani. Le barre rappresentano la gamma non outlier, la casellaes la gamma inter-quartile e il quadrato blu il conteggio mediana. Modificato da 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig6.jpg" /> Figura 6: Espressione differenziale dei miRNA-150 Una trama violino che mostra che i partecipanti IBS era significativamente più elevata miR-150 conta circolanti rispetto ai controlli sani (log2 conta trasformati sul asse y).. Le curve indicano la frequenza di conteggi della categoria, le barre verticali rappresentano il 1 ° e 3 quartili RD, e il quadrato rosso indica il conteggio mediana. Modificato da 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Descriviamo l'uso di una piattaforma di espressione genica multiplexata ad alto rendimento che quantifica l'espressione genica mediante codifica a barre e conteggio di molecole in substrati biologici senza la necessità di amplificazione. Abbiamo utilizzato la piattaforma per quantificare l'espressione di microRNA (miRNA) nel sangue intero in soggetti con e senza sindrome dell'intestino irritabile.

Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dell&#39;intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di quantificazione multiplex degli acidi nucleici è quello di quantificare digitalmente l'espressione dei microRNA nel sangue intero. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio dei disturbi digestivi, facilitando l'identificazione di meccanismi molecolari alterati e di firme di biomarcatori, come i microRNA.Il vantaggio principale di questa tecnica è che la quantificazione dei microRNA non si basa sull'amplificazione. Questa tecnologia conta digitalmente i bersagli molecolari ed è in larga misura automatizzata. Per purificare l'RNA totale, scongelare e incubare per due ore campioni di sangue intero precedentemente raccolti e congelati.Utilizzare un rotore a cestello oscillante per centrifugare i tubi a 5.000 ×g a temperatura ambiente per dieci minuti. Successivamente, rimuovere i soprannatanti versandoli con attenzione o aspirandoli con una pipetta in un tubo per rifiuti, avendo cura di non disturbare il pellet. Aggiungere quattro millilitri di acqua priva di RNasi al pellet.Rimettere saldamente il tappo e vortexare fino a quando il pellet non sarà visibilmente disciolto. Successivamente, centrifugare nuovamente il tubo ed eliminare il soprannatante. Poi, aggiungere 350 microlitri di tampone BM1 al pellet e vortexare fino a quando il pellet non sarà visibilmente disciolto.Quindi, trasferire il campione in una provetta da due millilitri per l'estrazione automatizzata di RNA totale. Utilizzando un kit commerciale per l'estrazione di RNA, eseguire una purificazione automatizzata di RNA intracellulare, inclusi i microRNA, dal campione di sangue intero, caricando nel sistema robotico per l'estrazione di RNA le punte di pipetta precaricate, le provette per centrifuga, i tamponi e i reagenti forniti nel kit per la purificazione di RNA. Dal menu di selezione dei protocolli, scegliere il protocollo Blood miRNA PartA e avviare la procedura.Completare l'estrazione dell'RNA e conservare i campioni secondo il protocollo descritto. Preparare i campioni di microRNA utilizzando prima acqua priva di RNasi per normalizzare 12 campioni di RNA a 33 nanogrammi per microlitro. Con acqua priva di nucleasi, preparare una diluizione 1:500 dei controlli di microRNA forniti nel kit del saggio e mantenere in ghiaccio.Successivamente, preparare il mix master di annealing combinando 13 microlitri di buffer di annealing, 26 microlitri di reagente micro R-tag e 6,5 microlitri di controlli per microRNA. Aggiungere a ciascuna delle 12 provette strip da 0,2 millilitri 3,5 microlitri del mix master di annealing, quindi aggiungere 3 microlitri del campione di RNA. Agitare leggermente le provette per mescolare, centrifugarle a 2000 ×g con una microcentrifuga da banco miniaturizzata e avviare le provette in un termociclatore utilizzando il seguente programma.Successivamente, preparare una miscela madre di ligazione combinando tre microlitri del buffer di ligazione e 19,5 microlitri di PEG. Quindi, aggiungere 2,5 microlitri della miscela madre di ligazione a ciascuna delle reazioni. Dopo aver mescolato e centrifugato brevemente i tubi, riposizionarli nel termociclatore a 48 gradi Celsius per cinque minuti.Quindi aggiungere un microlitro di ligasi direttamente a ciascun campione mentre i tubi sono ancora nel blocco del termociclatore, e incubare i tubi utilizzando il programma seguente. Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente i tubi, quindi aggiungere un microlitro di enzima per la purificazione della ligazione a ciascun campione. Successivamente, incubare i tubi nel termociclatore come indicato qui.Dopo l'incubazione, aggiungere 40 microlitri di acqua priva di RNasi ai campioni prima di miscelarli e centrifugarli. Per eseguire l'ibridazione del microRNA, scongelare i set di sonde reporter e di cattura forniti ponendoli sul ghiaccio e centrifugarli. Aggiungere 130 microlitri di buffer di ibridazione al Reporter Code Set 2 e miscelare per ottenere il mix master di ibridazione.In 12 nuovi tubi a striscia da 0,2 millilitri, aggiungere 20 microlitri della miscela maestra di ibridazione. Denaturare i campioni di microRNA appena preparati a 85 gradi Celsius per cinque minuti e raffreddarli sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 5 microlitri dei campioni di microRNA a ciascuno dei tubi a striscia contenenti la miscela maestra di ibridazione.Impostare il termociclatore a 65 gradi Celsius, con una temperatura calcolata per un volume di 30 microlitri, e il coperchio riscaldato sulla modalità Forever in modo che non scenda a 4 gradi Celsius al termine del ciclo. Aggiungere 5 microlitri del set di sonde di cattura in ogni provetta e mescolare. Successivamente, dopo averle centrifugate brevemente, posizionare immediatamente le provette nel termociclatore a 65 gradi Celsius.Incubare i campioni per un periodo non inferiore a 12 ore e non superiore a 30 ore. Preparare la stazione di lavoro riscaldando innanzitutto la cartuccia e le piastre alla temperatura ambiente. Successivamente, centrifugare le piastre.Per caricare la stazione di preparazione, aprire la porta della stazione e caricare le piastre dei reagenti, la cartuccia, le punnette per pipetta, i campioni preparati in provette a strip da 0,2 millilitri e due strip di provette vuote da 0,2 millilitri da 12 tubi nelle apposite posizioni del robot. Rimuovere i tappi delle strip di provette e il coperchio della piastra dei reagenti. Quindi, chiudere la porta della stazione di preparazione ed eseguire il saggio appropriato dal pannello di controllo.Per visualizzare e contare i codici a barre dei complessi tripartiti immobilizzati e orientati, rimuovere la cartuccia dalla stazione di preparazione, sigillarla con il coperchio fornito e posizionarla nell'analizzatore digitale in uno slot disponibile. Utilizzare lo schermo tattile per creare un file di definizione della cartuccia, o CDF. Assicurarsi che il file della libreria del reporter appropriato sia assegnato a ciascun campione nel CDF.Al termine della scansione, scaricare i file di dati dall'analizzatore digitale utilizzando una chiavetta USB o tramite posta elettronica, prima di elaborare e analizzare i dati secondo il relativo protocollo di controllo qualità (QC) e analisi. Il sistema del test per piattaforma di espressione genica riduce il rumore tecnico grazie alla sua elevata automazione e alla chimica unica utilizzata, che produce dati di espressione genica ad alta precisione. I replicati tecnici mostrati qui dimostrano la riproducibilità elevata ottenibile nella quantificazione dell'espressione di microRNA endogeni e virali.Utilizzando questo metodo, è possibile identificare come bersagli di interesse nell'IBS le microRNA codificate dai virus e quelle umane endogene che mostrano deviazioni rispetto all'espressione attesa, definita in base ai partecipanti sani allo studio. La precisione e la sensibilità del metodo consentono di rilevare alterazioni nei bersagli a bassa espressione, e anche piccole perturbazioni possono essere osservate in modo affidabile. Queste figure mostrano alcune delle alterazioni delle microRNA circolanti nell'IBS e nei suoi sottotipi, rispetto ai controlli sani.I due microRNA maggiormente differenzialmente elevati nei partecipanti con IBS sono presentati qui. Le curve in questo grafico a violino indicano la frequenza dei conteggi per miR-150. Le barre verticali rappresentano il primo e il terzo quartile, mentre il quadrato rosso indica il conteggio mediano.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire saggi personalizzati più mirati, basati sulla stessa tecnologia, al fine di convalidare firme di biomarcatori in coorti più ampie ed esplorare le associazioni essenziali tra RNA e proteine. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca biomedica per sviluppare rapidamente, con precisione ed accuratezza, pannelli di biomarcatori diagnostici per le malattie.

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