Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dell'intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

L'obiettivo generale di questo protocollo di quantificazione multiplex degli acidi nucleici è quello di quantificare digitalmente l'espressione dei microRNA nel sangue intero. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio dei disturbi digestivi, facilitando l'identificazione di meccanismi molecolari alterati e di firme di biomarcatori, come i microRNA.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che la quantificazione dei microRNA non si basa sull'amplificazione. Questa tecnologia conta digitalmente i bersagli molecolari ed è in larga misura automatizzata. Per purificare l'RNA totale, scongelare e incubare per due ore campioni di sangue intero precedentemente raccolti e congelati.

Utilizzare un rotore a cestello oscillante per centrifugare i tubi a 5.000 ×g a temperatura ambiente per dieci minuti. Successivamente, rimuovere i soprannatanti versandoli con attenzione o aspirandoli con una pipetta in un tubo per rifiuti, avendo cura di non disturbare il pellet. Aggiungere quattro millilitri di acqua priva di RNasi al pellet.

Rimettere saldamente il tappo e vortexare fino a quando il pellet non sarà visibilmente disciolto. Successivamente, centrifugare nuovamente il tubo ed eliminare il soprannatante. Poi, aggiungere 350 microlitri di tampone BM1 al pellet e vortexare fino a quando il pellet non sarà visibilmente disciolto.

Quindi, trasferire il campione in una provetta da due millilitri per l'estrazione automatizzata di RNA totale. Utilizzando un kit commerciale per l'estrazione di RNA, eseguire una purificazione automatizzata di RNA intracellulare, inclusi i microRNA, dal campione di sangue intero, caricando nel sistema robotico per l'estrazione di RNA le punte di pipetta precaricate, le provette per centrifuga, i tamponi e i reagenti forniti nel kit per la purificazione di RNA. Dal menu di selezione dei protocolli, scegliere il protocollo Blood miRNA PartA e avviare la procedura.

Completare l'estrazione dell'RNA e conservare i campioni secondo il protocollo descritto. Preparare i campioni di microRNA utilizzando prima acqua priva di RNasi per normalizzare 12 campioni di RNA a 33 nanogrammi per microlitro. Con acqua priva di nucleasi, preparare una diluizione 1:500 dei controlli di microRNA forniti nel kit del saggio e mantenere in ghiaccio.

Successivamente, preparare il mix master di annealing combinando 13 microlitri di buffer di annealing, 26 microlitri di reagente micro R-tag e 6,5 microlitri di controlli per microRNA. Aggiungere a ciascuna delle 12 provette strip da 0,2 millilitri 3,5 microlitri del mix master di annealing, quindi aggiungere 3 microlitri del campione di RNA. Agitare leggermente le provette per mescolare, centrifugarle a 2000 ×g con una microcentrifuga da banco miniaturizzata e avviare le provette in un termociclatore utilizzando il seguente programma.

Successivamente, preparare una miscela madre di ligazione combinando tre microlitri del buffer di ligazione e 19,5 microlitri di PEG. Quindi, aggiungere 2,5 microlitri della miscela madre di ligazione a ciascuna delle reazioni. Dopo aver mescolato e centrifugato brevemente i tubi, riposizionarli nel termociclatore a 48 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi aggiungere un microlitro di ligasi direttamente a ciascun campione mentre i tubi sono ancora nel blocco del termociclatore, e incubare i tubi utilizzando il programma seguente. Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente i tubi, quindi aggiungere un microlitro di enzima per la purificazione della ligazione a ciascun campione. Successivamente, incubare i tubi nel termociclatore come indicato qui.

Dopo l'incubazione, aggiungere 40 microlitri di acqua priva di RNasi ai campioni prima di miscelarli e centrifugarli. Per eseguire l'ibridazione del microRNA, scongelare i set di sonde reporter e di cattura forniti ponendoli sul ghiaccio e centrifugarli. Aggiungere 130 microlitri di buffer di ibridazione al Reporter Code Set 2 e miscelare per ottenere il mix master di ibridazione.

In 12 nuovi tubi a striscia da 0,2 millilitri, aggiungere 20 microlitri della miscela maestra di ibridazione. Denaturare i campioni di microRNA appena preparati a 85 gradi Celsius per cinque minuti e raffreddarli sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 5 microlitri dei campioni di microRNA a ciascuno dei tubi a striscia contenenti la miscela maestra di ibridazione.

Impostare il termociclatore a 65 gradi Celsius, con una temperatura calcolata per un volume di 30 microlitri, e il coperchio riscaldato sulla modalità Forever in modo che non scenda a 4 gradi Celsius al termine del ciclo. Aggiungere 5 microlitri del set di sonde di cattura in ogni provetta e mescolare. Successivamente, dopo averle centrifugate brevemente, posizionare immediatamente le provette nel termociclatore a 65 gradi Celsius.

Incubare i campioni per un periodo non inferiore a 12 ore e non superiore a 30 ore. Preparare la stazione di lavoro riscaldando innanzitutto la cartuccia e le piastre alla temperatura ambiente. Successivamente, centrifugare le piastre.

Per caricare la stazione di preparazione, aprire la porta della stazione e caricare le piastre dei reagenti, la cartuccia, le punnette per pipetta, i campioni preparati in provette a strip da 0,2 millilitri e due strip di provette vuote da 0,2 millilitri da 12 tubi nelle apposite posizioni del robot. Rimuovere i tappi delle strip di provette e il coperchio della piastra dei reagenti. Quindi, chiudere la porta della stazione di preparazione ed eseguire il saggio appropriato dal pannello di controllo.

Per visualizzare e contare i codici a barre dei complessi tripartiti immobilizzati e orientati, rimuovere la cartuccia dalla stazione di preparazione, sigillarla con il coperchio fornito e posizionarla nell'analizzatore digitale in uno slot disponibile. Utilizzare lo schermo tattile per creare un file di definizione della cartuccia, o CDF. Assicurarsi che il file della libreria del reporter appropriato sia assegnato a ciascun campione nel CDF.

Al termine della scansione, scaricare i file di dati dall'analizzatore digitale utilizzando una chiavetta USB o tramite posta elettronica, prima di elaborare e analizzare i dati secondo il relativo protocollo di controllo qualità (QC) e analisi. Il sistema del test per piattaforma di espressione genica riduce il rumore tecnico grazie alla sua elevata automazione e alla chimica unica utilizzata, che produce dati di espressione genica ad alta precisione. I replicati tecnici mostrati qui dimostrano la riproducibilità elevata ottenibile nella quantificazione dell'espressione di microRNA endogeni e virali.

Utilizzando questo metodo, è possibile identificare come bersagli di interesse nell'IBS le microRNA codificate dai virus e quelle umane endogene che mostrano deviazioni rispetto all'espressione attesa, definita in base ai partecipanti sani allo studio. La precisione e la sensibilità del metodo consentono di rilevare alterazioni nei bersagli a bassa espressione, e anche piccole perturbazioni possono essere osservate in modo affidabile. Queste figure mostrano alcune delle alterazioni delle microRNA circolanti nell'IBS e nei suoi sottotipi, rispetto ai controlli sani.

I due microRNA maggiormente differenzialmente elevati nei partecipanti con IBS sono presentati qui. Le curve in questo grafico a violino indicano la frequenza dei conteggi per miR-150. Le barre verticali rappresentano il primo e il terzo quartile, mentre il quadrato rosso indica il conteggio mediano.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire saggi personalizzati più mirati, basati sulla stessa tecnologia, al fine di convalidare firme di biomarcatori in coorti più ampie ed esplorare le associazioni essenziali tra RNA e proteine. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca biomedica per sviluppare rapidamente, con precisione ed accuratezza, pannelli di biomarcatori diagnostici per le malattie.