Name: Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere, Apis mellifera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Impara a somministrare agenti farmacologici al sistema nervoso centrale di Apis mellifera con tecniche di iniezione orale e per inalazione volatilizzata. Questi metodi consentono studi precisi sulla neurobiologia degli insetti sociali.

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Questo progetto è stato finanziato da ARC grant DP0986021 e NHMRC grant 585442. ABB è supportata da una ARC Future Fellowship (FT140100452). JAP è supportato da una borsa di studio iMQRES assegnata dalla Macquarie University e da un DAAD-Doktorandenstipendium assegnato dal Servizio di scambio accademico tedesco. JMD è supportato dal CNRS e dall'Università Paul Sabatier.

1. Drug Administration per le api da tiro <ol><li> trattamento orale <ol><li> Preparare la soluzione 1,5 M di saccarosio mescolando 257 g di saccarosio con 500 ml di acqua (è più facile per sciogliere questa quantità di saccarosio in acqua bollente). Conservare soluzione di saccarosio a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. Nota: La soluzione saccarosio fornisce un ambiente molto ospitale per alcuni microrganismi, e quindi diventa facilmente contaminato e sgradevole per le api. soluzione di saccarosio Bulk può essere aliquotati e conservati a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Stabilire una dose farmacologica appropriata (come realizzarla, è rivolta nella sezione discussione sotto), e preparare una soluzione tale che la dose farmaco preferito viene sciolto in 20 microlitri soluzione di saccarosio (ad esempio, per fornire 20 mg, diluire farmaco alla rapporto di 1 mg / ml). api cablaggio secondo il Felsenberg et al. (2011) 16. Fare questo passo, almeno 12 ore prima del trattamento farmacologico per garantire che le api sono stressati o non è piùUT da sfruttare quando la soluzione farmaco viene presentato. NOTA: per risultati più coerenti, è meglio morire di fame api (mettendo api sfruttata in un incubatore a 34 ° C e 70% di umidità) O / N. </li><li> Usando una micropipetta, toccare una goccia di 1,5 M saccarosio dell&#39;acqua all&#39;antenna di un ape sfruttato. Quando la proboscide è esteso, toccare una goccia 20 ml di 1,5 M di saccarosio contenente il farmaco direttamente alla proboscide delle api. Assicurarsi che l&#39;ape consuma tutto. Come utilizzare il controllo del veicolo da 1,5 M soluzione di saccarosio senza farmaci aggiunti. NOTA: potrebbe essere necessario un aggiustamento sulla base di piani sperimentali La quantità di soluzione di saccarosio. Se appetitive condizionata è destinato, alimentando le api appena prima della formazione possa interferire con la reattività api. </li><li> Eliminare o mettere da parte le api che non consumano tutto il saccarosio. NOTA: Se un gran numero di api non riescono a bere la soluzione di saccarosio, potrebbe essere necessario un aggiustamento del programma di alimentazione. </li></ol></li><li> Iniezione nel torace <ol><li> Preparare droga nel miele delle api Ringer 17 come segue: <ol><li> Mescolare e autoclave 7,45 g di NaCl, 0.448 g KCl, 0,812 g MgCl 2, 0,735 g CaCl 2, 54.72 g di saccarosio, 4,95 g D-glucosio e 2,48 g HEPES a 1.000 ml di acqua. Fare attenzione quando si ripone suoneria in quanto è facilmente contaminato. Aliquotare e conservare Ringer a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Sciogliere il farmaco in soluzione di Ringer e poi diluire in modo che la quantità desiderata è presente in 5 microlitri. Ad esempio, se le api devono essere trattati con 5 mg di un farmaco, 1 g può inizialmente essere sciolto in 1 ml di Ringer, prima di essere diluito 1: 1000 in Ringer per una soluzione finale di 1 mg / mL. NOTA: In alternativa, disponibile in commercio PBS (Phosphate-buffered Salin) può essere usato al posto di soluzione di Ringer. </li></ol></li><li> Fare un microscalpel rompendo l&#39;angolo di una lama a doppio taglio rasoio con offun portalama. Fissare il frammento di lama per un porta lama in modo che si fa un bel lama con un punto finale tagliente. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio, usare con cautela il microscalpel per tagliare un foro di 2 millimetri appena sopra il scutello, accanto al processo dell&#39;ala posteriore del torace di un ape. Evitare di tagliare troppo in profondità in quanto ciò potrebbe danneggiare muscoli del volo, e fare attenzione ad evitare le cerniere ala. Idealmente, tagliare solo tre lati, in modo che il lembo di cuticole può essere successivamente ripiegato per chiudere il sito di lesione. </li><li> Usando una micropipetta, deposito 5 μlL Ringer (o PBS) contenente il farmaco sulla parte superiore del foro nel torace. Monitorare attentamente al microscopio per assicurare l&#39;intera goccia è assorbito nel emolinfa. Utilizzare Ringer (o PBS) come un controllo del veicolo. </li><li> Se possibile, spostare il lembo cuticola posteriore sopra il foro. Dopo 5-10 ore, sarà ricollegare e sigillare. NOTA: In alternativa a questa tecnica, iniettare 1 ml direttamente nel torace usando una siringa di vetro, dopo aver aperto un smabuco ll nel mezzo del frenulo (linea trasversale nella regione posteriore della scutello) con una siringa (diametro: 0,6 mm G: 23). Questo aggira la necessità di tagliare prima il torace con un bisturi e il sito di iniezione è più piccolo, ma questo metodo lascerà il sito di iniezione esposto. </li></ol></li><li> iniezione ocellus NOTA: Questo è un metodo adatto per la distribuzione di molecole in tutta la capsula testa, nella emolinfa. <ol><li> Preparare farmaci come in 1.2.1, ma regolare concentrazioni di farmaco in modo tale che la dose desiderata sarà contenuto in 1 ml di Ringer o PBS (meno volume può essere assorbito attraverso il foro ocellus che attraverso il torace). </li><li> Preparare una microscalpel come in 1.2.2. Sotto uno stereomicroscopio, bloccare la testa di un ape sfruttato in posizione riempiendo la fessura collo con cera. Utilizzare fusione della cera a bassa temperatura (ad esempio, cera dentale) per evitare recettori olfattivi antennali danneggiare o altre cellule che possono essere importante per valutare il comportamento (ad esempio, l&#39;apprendimento olfattivo). Poi rimuovere con attenzione la lente della ocellus mediana inserendo la punta del microscalpel sotto la lente e rompere delicatamente la lente libera dalla capsula testa. NOTA: È anche possibile posizionare accuratamente cera sopra le antenne per impedire il movimento. </li><li> pipetta con cura droga sul foro ocellus. Attendere fino a quando tutto è preso nella capsula testa. Rimuovere impronte dentarie dalle antenne e consentire l&#39;ape a riposo per un po &#39;prima di continuare la procedura sperimentale. Utilizzare Ringer (o PBS) come un controllo del veicolo. </li></ol></li><li> Iniezione nel tratto ocellare NOTA: Il tratto ocellare contiene grandi fibre, che collega alla maggior parte delle regioni del cervello centrale 18. Questo metodo di trattamento abilita l&#39;applicazione composti solo il cervello, ma non mira sottoregioni specifiche del cervello. <ol><li> Preparare api come a 1.3.2. e rimuovere il cristallino ocellus mediana con il tip di un microscalpel come in 1.3.3. NOTA: Questo può essere fatto fino a 2 ore prima dell&#39;iniezione. Sulla base della nostra esperienza, le api Fed sono meglio in grado di far fronte a questo tipo di chirurgia dalle api Starved </li><li> Riempire una siringa di vetro 10 ml dotato di un piccolo calibro (ad esempio, 33, diametro: 210 micron) ago con soluzione di droga preparata come a 1.3.1. </li><li> Utilizzando un micromanipolatore manuale, inserire la punta della siringa attraverso la retina ocellare nella capsula testa ad una profondità di 50 micron e iniettare 250 nl di soluzione. </li><li> Dopo l&#39;uso, lavare la siringa 3 volte con acqua distillata, quindi 3 volte con etanolo al 75%. </li></ol></li><li> Microiniezione in particolari strutture cerebrali NOTA: Oltre ai trattamenti sistematici di cui sopra, è possibile eseguire microiniezioni in particolari strutture cerebrali. Questo permette la manipolazione farmacologica di una o più regioni cerebrali, lasciando inalterati gli altri. Questo funzionameglio con le regioni del cervello che sono facili da riconoscere dalla superficie del cervello anteriore (ad esempio, lobi antennali, calici di funghi corpo o lobi verticali, o lobi ottici), ma in altre regioni sono stati presi di mira. Si prega di notare che l&#39;orientamento (anteriore / posteriore, dorsale / ventrale) si riferisce alle all&#39;asse del corpo, piuttosto, che al nevrasse 19. <ol><li> Preparare il farmaco in Ringer o PBS nello stesso modo come in 1.2.1, aggiungendo un fluorescente (ad esempio, 0,5 mg / ml destrano, Alexa 546 o 568 fluoro) o colorante nonfluorescent (ad esempio, 1 mM blu di metilene). NOTA: L&#39;aggiunta di un colorante fluorescente consentirà la verifica della posizione di iniezione dopo l&#39;esperimento è finito (utilizzando la microscopia confocale, seguendo dissezione cerebrale), considerando coloranti nonfluorescent consentono il monitoraggio diretto durante l&#39;esperimento. </li><li> Per rendere pipette di vetro per l&#39;iniezione, inserire capillari di vetro del diametro corretto in morsetti titolare di un estrattore elettrodi (1,0 mm per la tenuta di serieER incluso per microinjector menzionata nella lista dei materiali). Regolare le impostazioni di trazione e di calore per la produzione di un lungo circa 0,5 cm punta (impostazioni sarà diverso per ogni estrattore, anche se lo stesso modello è utilizzato). NOTA: Idealmente, i due pipette tirato da un bicchiere dovrebbero avere la stessa lunghezza e forma, in modo che entrambi possono essere usati. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio, rompere le punte avere un diametro esterno di circa 10-15 micron, basato sulla stima visiva utilizzando una scala su un reticolo inserito nel oculare. I livelli sulla scala sono definiti dal produttore e possono essere corrette per l&#39;ingrandimento utilizzato. </li><li> Poi, riempire le pipette di vetro con la soluzione da iniettare. Se si usano capillari di vetro con filamenti, riempire la pipetta mettendo la parte posteriore nella soluzione di droga, altrimenti riempire punta con punte microloader. </li><li> Inserire la pipetta di vetro riempito nel supporto capillare di un microinjector, che è controllato da un mi manuale o elettronicocromanipulator. </li><li> Calibrare il microinjector per iniettare il volume desiderato (0,5-2 nl, a seconda delle dimensioni della struttura cerebrale mirato). Per questo, iniettare direttamente in una piccola capsula di Petri contenenti olio minerale e misurare il diametro della goccia con il reticolo. Modificare le impostazioni fino a raggiungere il volume desiderato. </li><li> Fissare la testa di un ape sfruttato con cera dentale morbido come in 1.3.2, prima di tagliare un&#39;apertura nella parte anteriore della capsula testa, utilizzando un microscalpel, con tre tagli: uno appena sotto il ocellus mediana (ventrale), uno alla il bordo di destra o occhio sinistro e uno sopra l&#39;antenna steli (dorsale). Usare un pezzo di cera dentale per tenere il lembo aperto nel posto. </li><li> Spingere con cautela ghiandole e trachea si trova in cima del cervello da parte utilizzando una pinza sottile, poi fare una piccola rottura nella neurolemma (membrana molto sottile intorno al cervello) al di sopra della struttura del cervello mirati. NOTA: Se molti api sono da trattare in una sola volta, questa procedurapuò essere eseguito in precedenza; tuttavia, fare attenzione a non lasciare le api in questo stato troppo a lungo (non più di 30 minuti), in quanto il loro cervello potrebbero essiccare. </li><li> Inserire la punta nella regione del cervello desiderato e regolare la profondità perpendicolarmente alla superficie del cervello (ad esempio, 60 micron per calici corpo di funghi). Iniettare il volume preimpostato. Per le regioni del cervello laterali, iniettare bilaterale (cioè fare una iniezione per ogni emisfero). Se viene utilizzato un colorante nonfluorescent, garantire l&#39;iniezione avvenuta nella regione di destra sull&#39;osservazione durante l&#39;iniezione. Se viene utilizzato un colorante fluorescente fare lo stesso sotto luce fluorescente utilizzando uno stereomicroscopio con un sistema di visualizzazione a fluorescenza. </li><li> Successivamente, posizionare il lembo aperto indietro sopra la testa del ape. Sciogliere un cristallo di eicosano, che è di circa 1 mm di diametro, con un sottile filo avvolto attorno alla punta di un saldatore micro (temperatura di fusione è 35-37 ° C) e sigillare i tagli. Questo ridurrà di molto la mortalità. </li><li> Rilasciare ilape dal cablaggio per l&#39;analisi comportamentale (ma si veda la discussione), o tenere nel cablaggio per esperimenti sulle api trattenuti - per esempio, l&#39;estensione proboscide reflex (PER) test 20. </li><li> Se è stato utilizzato un colorante fluorescente, affinché l&#39;iniezione colpito la zona di interesse dopo l&#39;esperimento è finito utilizzando un confocale a scansione laser microscopio (fig. 1). NOTA: Questo è particolarmente utile quando si mira aree cerebrali profonde (in cui sarebbe difficile vedere colorante nonfluorescent durante la fase di iniezione). </li></ol></li></ol> 2. Metodi Drug Administration per le api in volo libero <ol><li> trattamento orale <ol><li> Preparare farmaco nello stesso modo come in passaggi 1.1.1-1.1.2. Aggiungere la soluzione farmaco per un alimentatore e posto in frigorifero per lo stoccaggio. NOTA: Ogni alimentatore farà, come un tappo di bottiglia capovolta o un vaso rovesciato su carta velina. </li><li> Addestrare le api ad un alimentatore gravità contenente 1 M o 0,5M soluzione di saccarosio, ponendo un alimentatore vicino al alveare. Una volta api iniziano foraggiamento al alimentatore, gradualmente allontanarlo finché è a una distanza confortevole per evitare essere punti (minimo 5 m). </li><li> api Paint-marchio al fine di tenere traccia delle singole api mellifere. Fate una lista di tutte le combinazioni di colori che verranno utilizzati. Quando un ape atterra l&#39;alimentatore, segnano con cura il suo addome con due colori, e fare una nota della lista che la combinazione è preso. </li><li> Scambiare l&#39;alimentatore a gravità per un alimentatore contenente la soluzione medicinale / saccarosio. Prendete nota delle api marcate che visitano l&#39;alimentatore. Cattura ogni ape non marcato visita l&#39;alimentatore come le api sono reclutatori prolifici, e il numero di api che visitano l&#39;alimentatore drogato può ottenere rapidamente fuori controllo. Questo è particolarmente problematico se lo stesso esperimento deve essere eseguita in giorni successivi, come api naive potrebbero non essere più naive. NOTA: In alternativa alla formazione singole api ad un alimentatore, autore precedentes hanno alimentato con successo l&#39;acqua saccarosio farmaco-cucita ad un intero alveare 21 - 23. </li></ol></li><li> Il trattamento topico NOTA: L&#39;obiettivo è di sciogliere il composto di interesse in un solvente che può penetrare l&#39;insetto cuticola cerosa. Diversi solventi possono essere utilizzati per questo scopo. Il più comunemente usato includono acetone, dimetilformammide (DMF) e dimetilsolfossido (DMSO). <ol><li> Valutare quale solvente funziona meglio per il composto a portata di mano. Se un forte fenotipo è prevista da un sovradosaggio (ad esempio, paralisi o morte), api ossequio (fase 2.2.2) con una dose elevata (ad esempio, 20 mg di cocaina 7) sciolti in ciascuno dei diversi solventi e monitorare attentamente tempo fino paralisi o la morte. </li><li> Utilizzando un microcapillare 1 ml (o una microsiringa, che può essere montato su un dispensatore a ripetizione appropriato) e porta microcapillari, disegnare 1 ml di soluzione di farmaco (ad esempio, 381; g / ml di cocaina) nel capillare. Espellere la goccia, e con attenzione dipingere sul torace di un&#39;ape marcata. Coprire più grande di una zona una possibile con la soluzione, piuttosto che lasciare un solido goccia, come l&#39;ape è quindi probabile sposo fuori. Fare attenzione a non permettere al prodotto di contattare l&#39;ala cerniere, o questo può trarre fuori il torace e lungo le ali dove evaporerà senza essere assorbiti nel emolinfa. NOTA: A seconda del obiettivo di ricerca, questo metodo può essere utilizzato anche per somministrare farmaci per l&#39;addome dell&#39;ape. Tuttavia, i farmaci raggiungono il sistema nervoso centrale più veloce e in grandi quantità quando applicato al torace metodo di 24 .Questo funziona altrettanto bene con sfruttato come con le api volo libero. </li></ol></li><li> trattamento volatilizzato <ol><li> Sciogliere la droga (in precedenza questo metodo è stato utilizzato per fornire la cocaina alle api 10) su 100% di etanolo. Per garantire la solubilità, non utilizzare un cloridrato o altre forme di sale didi droga, se possibile. Quando si effettua una diluizione prepararlo in modo che l&#39;importo da erogare un ape è presente in 100 microlitri. Utilizzare etanolo puro come un controllo del veicolo. </li><li> Per creare un filamento, utilizzare la stessa procedura McClung e Hirsh 25. <ol><li> Brevemente ha spiegato: finire filo nichelcromo strettamente intorno un chiodo e collegare a due fili elettrici (uno per ogni estremità del filamento). Rimuovere il chiodo. La bobina nichelcromo rimanente viene indicato come il filamento. </li><li> Infilare i due fili attraverso fori praticati con attenzione nel coperchio di un 50 ml provetta da centrifuga, che dovrebbe essere resistente alla temperatura prescelta. Incollare i cavi in ​​posizione con silicone liquido. NOTA: Questo renderà la tenuta d&#39;aria tubo. Ciò è essenziale per evitare l&#39;esposizione secondaria allo sperimentatore ed assicurare che le api sono trattati con la dose appropriata. </li></ol></li><li> Collegare i fili che portano al filamento di una fonte di alimentazione. Utilizzo di una termocoppia per misurare la temperatura diil filamento, esperimento con tensione diversa / combinazioni correnti fino uno che si traduce in un profilo di temperatura appropriata per il farmaco in questione, idealmente, quella che consente per 10 sec di riscaldamento o meno. Questo è molto importante, fare riferimento alla letteratura rilevante (ad esempio, in modo che la cocaina volatilizzare deve essere riscaldato ad almeno 200 ° C, ma a temperature oltre 350 ° C viene suddiviso in composti secondari 26). </li><li> pipetta con cautela 100 ml di farmaco contenente soluzione di etanolo sul filamento. Distribuire il liquido sulla superficie del filamento per quanto possibile in quanto ciò aumenterà l&#39;efficienza evaporazione. Lasciare il filamento esposto a temperatura ambiente fino a quando tutto l&#39;etanolo evaporato. NOTA: Se l&#39;etanolo non è sufficientemente evaporato, api saranno trattati sia con il farmaco di scelta ed etanolo. Le api sono estremamente sensibili a etanolo, e alcuni farmaci avere interazioni sinergiche con l&#39;etanolo, che sarà pregiudizi exrisultati sperimentali. </li><li> Una volta che l&#39;etanolo sia completamente evaporata (farmaco precipitato di solito può essere visto sul filamento secca al microscopio), prendere un ape in volo libero in un tubo da 50 ml. chiudere con cautela il coperchio contenente il filamento. </li><li> Accendere l&#39;alimentazione per 10 secondi, spegnere il dispositivo e attendere altri 50 secondi (per consentire il composto volatilizzato raffreddare e quindi condensare o un deposito). Rilasciare l&#39;ape. NOTA: Anche se questo metodo di trattamento funziona in modo eccellente per le api in volo libero, può essere utilizzato in modo altrettanto efficace con le api bardati. È sufficiente collegare l&#39;ape imbrigliato all&#39;interno di un tubo da 50 ml. Ricaricare il filamento come descritto in 2.3.4 tra le api. Per maggiore produttività, più filamenti possono essere utilizzati in parallelo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi di cui sopra consentono un trattamento semplice, efficace e robusto sia priva di volare o api mellifere bardati. Questi metodi sono compatibili con molti paradigmi sperimentali e questioni biologiche (Tabella 1). Tutti i metodi in volo libero può essere facilmente applicato per le api bardati. Il contrario è meno successo, tuttavia, dal momento moderazione temporanea e metodi di trattamento invasivo spesso possono compromettere la capacità volare api. I metodi sono ...

Dal momento che Karl von Frisch chiarito il loro linguaggio della danza 1, le api sono rimasti una specie di studio richiesti per i ricercatori in comportamento animale e neurobiologia. Negli ultimi anni una miriade di nuove discipline sono emerse nel punto di intersezione di questi due campi, e diverse altre discipline (ad esempio, la biologia molecolare, la genomica e informatica) sono sorti al loro fianco. Questo ha portato a un rapido sviluppo di nuove teorie e modelli per comprendere come il comportamento deriva da attività nei sistemi nervosi. A causa dello stile di vita unico, ricco repertorio comportamentale, e la facilità di manipolazione sperimentale e farmacologica, le api sono rimasti in prima linea in questa rivoluzione. Le api da miele sono stati utilizzati per studiare domande neurobiologici di base come quelli alla base dell&#39;apprendimento e della memoria 2,3, il processo decisionale 4, 5 olfattiva, o elaborazione visiva 6. Negli ultimi anni, la honey ape è stato anche utilizzato come modello per lo studio di argomenti generalmente riservati per la ricerca medica, come ad esempio gli effetti di sostanze stupefacenti 7 - 11, 12 sonno, invecchiamento 13, oppure i meccanismi alla base di anestesia 14. A differenza dei classici organismi modello genetico (per esempio, D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), ci sono pochissimi strumenti genetici disponibili per la manipolazione di funzioni neurali di api mellifere, anche se questo è attualmente cambiando 15. Invece, gli studi api sono principalmente affidamento su manipolazioni farmacologiche. Questo è stato un grande successo; tuttavia, la diversità della ricerca ape è tale che sono necessari una serie di metodi per la somministrazione farmacologica. La ricerca con le api affronta questioni molto diverse, è studiata da ricercatori provenienti da diverse discipline e contesti, e utilizza una varietà di approcci sperimentali. molti RESEdomande arco richiedono api per essere o volo libero, liberamente interagire nella loro colonia, o entrambi. Questo può rendere difficile tenere traccia dei singoli animali da esperimento, e rende moderazione o incannulamento irrealizzabile. Per accogliere la diversità delle ricerche miele d&#39;api, sono necessari una varietà di metodi di somministrazione dei farmaci, consentendo per la somministrazione robusto e flessibile, garantendo nel contempo che i profili farmacocinetici e farmacodinamica, invasività del metodo, e la sua affidabilità, soddisfare il paradigma in questione. A causa di queste diverse esigenze, la maggior parte dei gruppi di ricerca hanno sviluppato i propri metodi di gestione della droga unici. Finora, questo è stato un punto di forza della comunità di ricerca delle api; ha portato allo sviluppo di array di metodi che consentono la somministrazione del farmaco stesso in circostanze diverse. Il nostro obiettivo non è quello di sviluppare un unico metodo standardizzato per manipolazioni farmacologiche di api, ma piuttosto mettere in evidenza i metodi chehanno dimostrato di essere particolarmente efficace, e aiutare i ricercatori adottano questi. Discutiamo i principi di base di come funzionano, così come i loro vantaggi e svantaggi.

<table><tbody><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>Qualsiasi fornitore farà</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49159</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato (PBS)</td><td>Cera protettiva Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dentaurum</td><td>124-305-00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>dimetilformammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>95% Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>23 G Ago NanoFil</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Forsceps molto fine</td><td>Dumont</td><td>0208-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo estrattore</td><td>SRI</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet Microiniettore</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.01</td><td></td></tr><tr><td>Eicosane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>219274</td><td></td></tr><tr><td>micromanipolatore manuale</td><td>Brinkmann Instrumentenbau</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>micromanipolatore elettronico</td><td>Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik</td><td>Unità junior Stereomicroscopio XYZ</td><td></td></tr> Saldatore <tr><td></td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Weller</td><td>WESD51</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 546, 10.000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 568, 10.000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22912</td><td></td></tr><tr><td>piccola piastra di Petri</td><td>Olio minerale Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 50 ml</td> Pinza <td>per 339652</td><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Australian Entomological Supplies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portalama e rompilama</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E130</td><td></td></tr><tr><td>Feather lama di</td> <td>rasoio a doppio taglioThermoFisher Scientific</td><td>50-949-135</td><td></td></tr><tr>Filo <td></td><td></td><td>di nicromo</td><td>Qualsiasi fornitore farà</td></tr><tr><td>Cavi</td><td></td><td></td> elettrici <td>Qualsiasi fornitore farà</td></tr><tr><td>Vernice per modelli</td><td>Tamiya USA</td><td>Dipende dal colore</td><td></td></tr><tr><td>Dispenser ripetuto</td><td>Hamilton company</td><td>PB-600-1</td><td></td></tr><tr><td>Siringa in vetro</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>sistema di visualizzazione della fluorescenza</td><td>Nightsea</td><td>SFR-GR</td><td></td></tr><tr><td>reticolo</td><td>ProSciTech</td><td>S8014-24</td><td></td></tr><tr><td>microcapillare con supporto</td><td>Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Silicone</td><td></td><td></td> liquido <td>Qualsiasi fornitore farà</td></tr><tr><td>Termocoppia</td><td>Digitech</td><td>QM-1324</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,<em&gt; apis mellifera</em

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Le api da miele dimostrano capacità di apprendimento sorprendenti e il comportamento sociale avanzata e la comunicazione. Inoltre, il loro cervello è piccolo, facile da visualizzare e studiare. Pertanto, le api sono stati a lungo un modello preferito tra i neurobiologi e neuroethologists per studiare le basi neurali del comportamento sociale e naturale. È importante, tuttavia, che le tecniche sperimentali utilizzate per studiare le api non interferiscono con i comportamenti oggetto di studio. Per questo motivo, è stato necessario sviluppare una gamma di tecniche per la manipolazione farmacologica di api. In questo lavoro abbiamo dimostrato metodi per il trattamento api mellifere trattenuto o volo libero con una vasta gamma di agenti farmacologici. Questi includono entrambi i metodi non invasivi come trattamenti per via orale e topica, nonché metodi più invasivi che consentono precisa somministrazione di farmaci sia in modo sistemico o localizzato. Infine, si discute i vantaggi e gli svantaggi di ciascun metodo e descriviamoostacoli comuni e come superare meglio di loro. Concludiamo con una discussione sull&#39;importanza di adattare il metodo sperimentale per le questioni biologiche, piuttosto che il contrario.

Una selezione di risultati rappresentativi per i metodi di cui sopra sono riportati, in primo luogo per dimostrare che i metodi consentono agenti farmacologici per raggiungere il cervello e influenzano il comportamento delle api il miele. Effetti specifici sui processi cerebrali possono essere facilmente ottenuti dopo l&#39;iniezione del torace. Poiché gli agenti farma...

Questo manoscritto descrive diversi protocolli per la somministrazione di agenti farmacologici alle api, tra cui semplici metodi non invasivi per le api in volo libero, così come le varianti più invasive che consentono preciso trattamento localizzato delle api trattenuti.

Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

L'obiettivo generale di queste procedure è somministrare in modo affidabile e robusto agenti farmacologici al sistema nervoso centrale di api mellifere o di insetti simili. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della sociobiologia, della neuroetologia e dell'apicoltura, ad esempio esplorando i meccanismi neurobiologici del comportamento sociale. Il principale vantaggio di queste tecniche è che permettono lo studio della neurobiologia in organismi non modello, come l'ape mellifera, in cui attualmente gli strumenti genetici sono limitati.La procedura sarà dimostrata da Jenny Plath, una studentessa laureata del Laboratorio di Neuroetologia della Macquarie University. I farmaci possono essere somministrati per via orale o mediante iniezione. Le iniezioni possono essere effettuate nel torace, nell'ocello o nel tratto ocellare.Le iniezioni nell'ocellus permettono di somministrare farmaci a tutta la testa, mentre le iniezioni nel tratto ocellare mirano a regioni specifiche del cervello. Per tutte le iniezioni, realizzare un microbisturi spezzando l'angolo di una lametta a doppio taglio con un manico per lamette. Fissare il frammento di lametta al manico in modo da ottenere un buon bisturi con una punta affilata.Per un'iniezione toracica, praticare un foro di due millimetri appena sopra lo scutello, accanto al processo posteriore dell'ala nel torace di un'ape. Evitare di tagliare troppo in profondità, poiché si potrebbero danneggiare i muscoli del volo, e fare attenzione a non danneggiare i cardini delle ali. Idealmente, tagliare solo tre lati in modo che la linguetta di cuticola possa essere ripiegata successivamente per chiudere la sede della ferita.Ora iniettare il farmaco nel torace. Successivamente, riposizionare la lamella del cuticolo sopra il foro e dopo dieci ore si riattaccherà e si sigillerà. Per accedere al cervello, fissare la testa di un'ape imbragata riempiendo la fessura del collo con cera dentale riscaldata a mano, in modo da evitare di danneggiare i recettori olfattivi delle antenne o altre cellule che potrebbero essere importanti per il comportamento dell'ape.L'antenna può anche essere fissata con cera dentale. Quindi, utilizzando il microscalpello, rimuovere con attenzione la lente dell'ocello mediano inserendo la punta del microscalpello sotto la lente e staccando delicatamente la lente dalla capsula del capo. Per consentire al farmaco di penetrare nell'intera capsula del capo, pipettare con cura il farmaco sul foro dell'ocello e attendere che venga assorbito.In alternativa, si possono prendere di mira sottoregioni del cervello mediante iniezione attraverso il tratto ocellare, ad esempio iniettando 250 nanolitri di farmaco a una profondità di 50 micrometri per raggiungere le strutture cerebrali adiacenti all'ocello. Successivamente, rimuovere la cera da dentista e lasciare riposare l'ape per un po' prima di proseguire con la procedura sperimentale. Per preparare gli aghi per iniezione, tirare tubi di vetro di un millimetro di diametro in modo da ottenere una punta lunga circa 0,5 centimetri.Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico, rompere le punte per creare un'apertura con un diametro esterno di circa 10-15 micron. Questa misura può essere effettuata utilizzando una scala su un reticolo. A questo punto, caricare un ago da iniezione con la soluzione del farmaco.Quindi, al sistema di iniezione, fissare l'ago di iniezione caricato al micromanipolatore. Testare il sistema di iniezione nell'olio minerale e calibrarlo per erogare una bolla di 0,5-2 nanolitri, a seconda delle dimensioni della struttura cerebrale bersaglio. Utilizzando un reticolo, misurare il diametro delle goccioline per calcolarne il volume.Per fissare la testa di un'ape imbragata, utilizzare della cera dentale morbida, come in precedenza. Quindi praticare un'apertura nella parte anteriore del capo utilizzando un microbisturi con tre incisioni: una appena sotto l'ocello mediano; una al margine dell'occhio destro o sinistro; e una sopra le basi delle antenne. Utilizzare un pezzo di cera dentale per mantenere il lembo aperto in posizione.Successivamente, spostare con attenzione le ghiandole e la trachea utilizzando pinzette fini ed effettuare una piccola rottura nella neurilemma sopra la struttura cerebrale bersaglio. Inserire ora la punta della pipetta di vetro nella regione cerebrale desiderata, idealmente in modo perpendicolare alla superficie del cervello e alla profondità necessaria per raggiungere la struttura bersaglio. Quindi iniettare il bolo di farmaco.Quando si prendono di mira regioni cerebrali accoppiate, effettuare un'iniezione in ciascun emisfero per interessare entrambi gli emisferi. Se un colorante fluorescente viene iniettato insieme al bolo, le regioni cerebrali superficiali possono essere osservate utilizzando luce fluorescente. Altre regioni possono essere verificate successivamente mediante microscopia confocale.Dopo l'iniezione, riposizionare la falda della cuticola e sigillare il taglio sciogliendo un cristallo di eicosano di circa un millimetro di diametro sulla cuticola, utilizzando un filo sottile collegato a un microsaldatore. Ciò ridurrà notevolmente la mortalità. Per somministrare un farmaco così volatile mediante un filamento riscaldato al nichel-cromo, prepararlo disciolto in etanolo puro.Per praticare con attenzione dei fori nel coperchio di una provetta da 50 millimetri, fai passare i due fili attraverso i fori. Per creare un filamento, avvolgi strettamente il filo di nichel-cromo attorno a un chiodo, collega il filo di nichel-cromo a due fili elettrici e quindi rimuovi il chiodo. Successivamente, fissa i fili e sigilla i fori con silicone.Ora collegare i fili a una fonte di alimentazione. Utilizzare una termocoppia per misurare la temperatura del filamento. Per calibrare il dispositivo, pipettare con attenzione due microlitri di soluzione del farmaco sul filamento e lasciare evaporare completamente l'etanolo a temperatura ambiente.Regolare la tensione in modo che il bolo di farmaco si volatilizzi entro dieci secondi dall'applicazione della corrente. Il farmaco non deve essere distrutto da decomposizione termica. Un precipitato può solitamente essere osservato sul filamento asciutto se ispezionato con attenzione.Per somministrare i farmaci a un'ape, inserire un'ape libera o immobilizzata nel tubo e fissare con attenzione il coperchio con i fili all'esterno. Quindi accendere la fonte di alimentazione per 10 secondi e attendere altri 50 secondi affinché il composto volatilizzato venga completamente assorbito dall'ape prima di rimuoverla. Effetti specifici sui processi cerebrali possono essere facilmente ottenuti mediante iniezione nel torace.Ad esempio, bloccanti della trascrizione sono stati somministrati mediante questa tecnica per identificare le fasi della memoria che richiedono l'espressione genica. Sono stati ottenuti effetti selettivi e dipendenti dal tempo su compiti di memoria. La diffusione delle molecole nell'emolinfa della testa porta a effetti rapidi e dipendenti dalla dose, ottenuti tramite iniezione nell'ocello. A determinate concentrazioni di dose, allatostatine diffuse-concentrate hanno ridotto le prestazioni in un saggio di apprendimento olfattivo. Per verificare le proprietà spaziali e temporali di specifiche regioni cerebrali, api immobilizzate sono state addestrate in un paradigma di condizionamento olfattivo della risposta di estensione del muscolo proboscideo (PER) e successivamente iniettate con procaina nei calici del corpo fungiforme o nei lobi verticali. Quando le api sono state successivamente sottoposte a test di richiamo, le prestazioni sono risultate compromesse solo nelle api iniettate bilateralmente.In un'arena con più beverini, le api sono state catturate delicatamente mentre stavano per staccarsi da un beverino contenente saccarosio ad una concentrazione di un molare. Le api catturate sono state trattate con 100 microgrammi di cocaina in forma libera volatilizzata, il che ha determinato un aumento del foraggiamento presso i beverini con concentrazione pari a mezzo molare, ma non presso quelli con concentrazione di due molari. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come somministrare farmaci ad api in volo libero o immobilizzate, sia mediante iniezione che per volatilizzazione.Una volta acquisite, queste tecniche possono essere eseguite facilmente su un gran numero di api in un paio d'ore. Dopo questa procedura, è possibile effettuare altri metodi, come il condizionamento dell'estensione del proboiscide, per rispondere a ulteriori domande sulla neurobiologia dell'apprendimento e della memoria.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Dimostriamo come implementare un metodo di farmacologia comportamentale in un paradigma di condizionamento appetitivo olfattivo nelle api (Apis mellifera) mediante l'applicazione sistemica di farmaci. Questo metodo permette di indagine del processo di apprendimento dei meccanismi di base e formazione della memoria in modo semplice e affidabile.

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

In questo protocollo si mostra come condizione sfruttata api a stimoli tattili e introdurre un 2D tecnica del motion capture per analizzare la cinematica di fine scala modello di campionamento antenne.

Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

In questo protocollo, si descrive due strategie che sopprimono contemporaneamente due geni (doppia knockdown gene) di api mellifere. Poi ci presentiamo come usare la risposta estensione proboscide (PER) test per studiare l'effetto di doppio knockdown gene sul miele d'api percezione gustativa.

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Il protocollo di condizionamento Proboscis Extension Response (PER), sviluppato per l'ape mellifera (Apis mellifera), fornisce un mezzo ecologicamente rilevante e facilmente quantificabile per studiare diversi meccanismi di apprendimento in molte specie di insetti.

Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Registrazioni simultanee extracellulari lungo termine provenienti da due diversi neuropiles cerebrali o due diversi tratti anatomici sono stati stabiliti nelle api. Queste registrazioni permettono lo studio di aspetti temporali del trattamento neuronale attraverso diverse aree cerebrali del singolo neurone, così come a livello di complesso in un animale comportarsi.

Registrazioni simultanee a lungo termine in due fasi neuronale Processing in Comportarsi api

Viene descritto un nuovo test comportamentale per studiare le risposte gustative a breve termine dell'apparato boccale dei bombi che si muovono liberamente (Bombus terrestris) nei confronti di nutrienti e tossine in soluzione.

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Qui si descrive il nostro protocollo dettagliato per la preparazione di colonie di api singola coorte - uno strumento utile per analizzare la fisiologia dei lavoratori di ruolo associati. Descriviamo anche protocolli dettagliati per il trattamento di lavoratori con ormone giovanile e ecdysone per valutare il coinvolgimento di questi ormoni nella regolazione del comportamento dei lavoratori e / o la fisiologia.

Preparazione di singole colonie-coorte e trattamento ormonale di lavoratore api per analizzare Fisiologia associati con il ruolo e / o sistema endocrino

La perdita di colonie di api è una sfida per la raccolta dei servizi di impollinazione. Le attuali pratiche di protezione dell'impollinatore garantiscono un approccio alternativo per ridurre al minimo il contatto delle api con pesticidi nocivi utilizzando chimiche repellenti. Qui forniamo metodi dettagliati per un protocollo di monitoraggio visivo per la visualizzazione dei deterrenti per le api.

Protocollo di monitoraggio video a chimici detergenti dello schermo per le api di miele

Questo protocollo descrive i passaggi per utilizzare il nuovo software, SwarmSight, per il monitoraggio di frame-by-frame di posizioni dell'antenna e proboscide dell'insetto dal video fotocamera web convenzionale utilizzando computer convenzionali. Il software gratuito, open-source elabora frame circa 120 volte più veloce di esseri umani e si esibisce al meglio di precisione umano.

SwarmSight: Monitoraggio in tempo reale dei movimenti di Antenna dell'insetto e proboscide estensione Reflex utilizzando una preparazione comune e Hardware convenzionali

Per verificare gli effetti inibitori di agenti farmacologici sulla fosfolipasi C (PLC) in diverse regioni del cervello dell'ape mellifica, presentiamo un'analisi biochimica per misurare l'attività del PLC in quelle regioni. Questo test potrebbe essere utile per confrontare attività PLC tra tessuti, così come tra le API che esibiscono comportamenti diversi.

Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape

Presentato qui è un protocollo per utilizzare il sistema CRISPR-Cas9 per ridurre la produzione di una proteina nel cervello delle api adulte per testare la specificità degli anticorpi.

Test anticorpale sui recettori anti-RDL e anti-mGlutR1 nelle sezioni del cervello di Honeybee utilizzando CRISPR-Cas9

Impara a somministrare agenti farmacologici al sistema nervoso centrale di Apis mellifera con tecniche di iniezione orale e per inalazione volatilizzata. Questi metodi consentono studi precisi sulla neurobiologia degli insetti sociali.

Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,

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