Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

L'obiettivo generale di questo protocollo è isolare le cellule T helper murine primarie e trasdurle con costrutti di espressione retrovirale per un gene di interesse. Molti sistemi sperimentali sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi che regolano lo sviluppo e la funzione delle cellule T in una risposta immunitaria. Qui descriviamo un approccio genetico che utilizza la trasduzione retrovirale, che è economico, efficiente in termini di tempo e altamente informativo nell'identificazione dei percorsi regolatori.

Abbiamo utilizzato questa tecnica per analizzare la funzione dei microRNA, che sono importanti regolatori dell'espressione genica. Utilizzando la trasduzione retrovirale, siamo stati in grado di testare la funzione dei singoli microRNA e la differenziazione delle cellule T helper. Il mio collaboratore, Oliver Garden, dimostrerà l'isolamento primario delle cellule T e io dimostrerò la trasduzione retrovirale.

24 ore prima della trasfezione, dividere una piastra confluente di cellule con un rapporto di 1:10 in una piastra di 10 centimetri, in modo che le cellule siano circa il 50% confluenti il giorno successivo. Circa un'ora prima della trasfezione, rimuovere il terreno dalle cellule e aggiungere con cura 9 millilitri di terreno HEK293 T fresco, per evitare che le cellule si stacchino dalla piastra. In un fondo rotondo da sei millilitri, o in un tubo conico da 15 millilitri, aggiungi cinque microgrammi di DNA retrovirale, cinque microgrammi di DNA virale helper e acqua fino a un volume di 420 microlitri.

Quindi, aggiungere 80 microlitri di cloruro di calcio molare 2,5 per portare il volume finale a 500 microlitri. Successivamente, aggiungere lentamente 500 microlitri di 2x HBS goccia a goccia alla miscela di DNA, mentre si agita delicatamente, in modo che la soluzione venga continuamente miscelata e il fosfato di calcio precipiti in cristalli di dimensioni uniformi. Successivamente, trasferire la miscela di fosfato di calcio DNA in una cappa di coltura tissutale.

Aggiungere lentamente la miscela alle cellule, facendo roteare costantemente e delicatamente la piastra, prima di rimettere le cellule nell'incubatore. Per raccogliere il virus il giorno successivo, rimuovere il terreno e nutrire le cellule con 10 millilitri di terreno HEK293 T fresco, facendo attenzione a non staccare le cellule dalla piastra. La sera, nutrire le cellule con 3,5 millilitri di terreno HEK293 T fresco e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 12 ore.

Dopo circa 12 ore, raccogliere il terreno e nutrire nuovamente le cellule con 3,5 millilitri di terreno HEK293 T fresco. Ripetere la raccolta del terreno altre due volte, a intervalli di circa 12 ore, il che si traduce in una raccolta di circa 10 millilitri di scorte di virus. In questa procedura, aggiungere la milza e i linfonodi al filtro cellulare e macerare utilizzando l'estremità di uno stantuffo della siringa da cinque millilitri.

Successivamente, sciacquarli con uno o due millilitri di R10 medium. Quindi trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri e portare il volume fino a 14 millilitri con R10. Centrifugare le celle a 600 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, scartare il surnatante versandolo con un movimento pulito, per evitare di disturbare il palato cellulare. Quindi, aggiungere due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi freddi alle cellule. Mescolare, quindi mettere le cellule sul ghiaccio per 3,5 minuti mescolando delicatamente per tutto il tempo.

Quindi, aggiungere 12 millilitri di terreno R10 e centrifugare immediatamente a 600 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Eseguire le fasi di lavaggio altre due volte con il terreno R10 per rimuovere eventuali residui di tampone di lisi dei globuli rossi dalle cellule ed evitare la morte dei linfociti. In questa fase, aliquotare da otto a dieci, volte dieci per la settima cella per provetta conica e centrifugarle a 600 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Versare il surnatante con un movimento pulito, per evitare di disturbare il palato cellulare. Quindi, risospendere le celle e 100 microlitri di FBS inattivato a caldo. Quindi, aggiungere 100 microlitri di miscela di anticorpi alle cellule e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius, mescolando delicatamente su un rullo.

Dopodiché, risospendere le perle nella fiala, facendole vorticare per più di 30 secondi. Quindi trasferire le perle in un tubo conico da 15 millilitri e aggiungere 2 millilitri di terreno R10 per millilitro di perline. Posizionare il tubo nel magnete per un minuto.

Quindi scartare il surnatante e risospendere le perle in quattro millilitri di terreno R10. Lavare le cellule al termine dell'incubazione degli anticorpi, aggiungendo 10 millilitri di terreno R10 per provetta, e centrifugare a 600 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Versare il surnatante con un movimento pulito per evitare di disturbare il palato cellulare, quindi risospendere le cellule in 1 millilitro di terreno R10.

Successivamente, aggiungere 2 millilitri di perle lavate al tubo di cellule trattate con anticorpi e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius, mescolando delicatamente su un rullo. Quindi, risospendere la miscela di perline cellulari, pi petting delicatamente cinque volte prima di posizionare il tubo nel magnete per due minuti. Trasferire il surnatante contenente le cellule selezionate negativamente in una nuova provetta e ripetere la selezione negativa ancora una volta.

In questa procedura, centrifugare le cellule T CD4 positive a 600 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere in 150-200 microlitri di terreno R10 per dieci fino all'ottava cellula. Successivamente, aggiungere due microlitri di anticorpi monobobina CD25 biotinulati alle cellule e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius mescolando delicatamente su un rullo. Successivamente, lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di tampone della colonna di separazione cellulare e centrifugare a 600 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi, rimuovere quanto più surnatante possibile e risospendere le cellule fino a un volume finale di circa 90 microlitri per 10-settima cellula. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di perle di streptavidina per 10 alla settima cellula e mescolare con movimenti delicati. Quindi, incubarli per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Durante l'incubazione delle cellule, preparare le colonne MS. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di tampone della colonna di separazione cellulare e centrifugare a 600 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone della colonna di separazione cellulare, da 10 all'ottava cella.

Successivamente, applicare 500 microlitri di sospensione cellulare sulla colonna e raccogliere il flusso. Passatela ancora una volta sulla colonna e raccogliete nuovamente il flusso. Quindi, sciacquare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone per colonna di separazione cellulare e aggiungere ogni flusso alle cellule CD25 negative raccolte.

Eseguire il lavaggio, il legame con le perle di streptavidina e la preparazione della colonna di separazione cellulare come accennato in precedenza, ma utilizzare invece la colonna LS. Questa volta, scartare il flusso e lavare le celle dalla colonna con lo stantuffo in dotazione. Durante l'isolamento delle cellule T naive, rivestire una piastra di coltura di 24 tessuti selvatici con anticorpi anti CD3 e anti CD28 diluiti in DPBS e incubare per due ore a 37 gradi Celsius.

Immediatamente prima di coltivare le cellule, lavare la piastra con 250 microlitri di DPBS per pozzetto, per rimuovere l'anticorpo non legato. Quindi, rimuovere la DPBS e aggiungere 1 millilitro di cellule T CD4 positive naive in terreno R10 durante la notte. Il giorno seguente, centrifugare le celle a 900 volte G per 10 minuti a 30 gradi Celsius.

Quindi raccogliere il terreno e aggiungere 1 millilitro di surnatante di coltura virale, preparato dal protocollo di produzione del virus. Successivamente, aggiungere 1 microlitro di polibrene da otto milligrammi per millilitro e 10 microlitri di un hepes molare, per favorire l'assorbimento del virus prima di centrifugare le cellule a 900 volte G per 90 minuti a 30 gradi Celsius. Per differenziare le cellule, rimuovere con cura il surnatante della coltura virale e aggiungere 1 millilitro del terreno raccolto in precedenza, poiché contiene IL2 e altri fattori di crescita delle cellule T.

Quindi aggiungere i reagenti indicati nella Tabella 2 del manoscritto di accompagnamento e coltivare le cellule per tre o quattro giorni per differenziare le cellule in sottogruppi specifici. Questa figura mostra la purezza tipica delle popolazioni pre e post selezionate in ogni fase del protocollo di isolamento delle cellule T helper naive. I profili di espressione di CD4, CD8A, MHC II, CD25, CD62L e CD44 illustrano la perdita di cellule MHC di Classe 2, oltre a cellule T citotossiche, regolatorie e di memoria.

Ciò si traduce in una popolazione che è superiore al 95% per cento di cellule T CD4 positive, con circa l'85%-90% di cellule naive e il restante 10%-15% di cellule effettrici. In questa figura, l'espressione della GFP è mostrata nelle cellule T HEC293, che sono state non trasfettate o trasfettate, e analizzate dopo la raccolta di surnatanti di coltura virale. L'analisi GFP è stata eseguita su cellule vive dal cancello sul lotto FSE e SSE.

Le efficienze tipiche della trasfezione variano tra il 30% e il 90%Qui, l'espressione della GFP è mostrata nelle cellule T helper trasdotte retrovirali dopo la differenziazione in condizioni di polarizzazione Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 e T reg per tre giorni. Le efficienze di trasduzione variano tra il 10% e il 75% a seconda del costrutto e delle condizioni di polarizzazione. Ecco i profili rappresentativi delle citochine sulla differenziazione delle cellule T helper in diverse condizioni di polarizzazione.

Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere un modo potente per analizzare la funzione genica e aiutare lo sviluppo e la funzione delle cellule T. Ricorda solo che i risultati informativi dipendono dalla qualità delle cellule e dei reagenti. Pertanto, è importante ottimizzare i protocolli di trasduzione e l'isolamento e la differenziazione delle cellule T helper.