Name: Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Scopri la trasduzione retrovirale di cellule T helper murine per studiare la differenziazione cellulare e l'espressione genica. Questo metodo efficiente permette di analizzare il ruolo dei microRNA nello sviluppo delle cellule T.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/H018573/1) e da una sovvenzione BD Biosciences.

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</ol>

Gli autori non hanno alcun interesse conflittuale nella pubblicazione di questo lavoro.

Retrovirali mediata sovraespressione dei geni è un potente strumento per analizzare la funzione delle cellule T helper, come il loro sviluppo e la funzione è spesso determinato dal livello di espressione di regolatori chiave. Tuttavia, cauta interpretazione dei risultati è necessario perché i livelli di espressione significativamente superiori a quelli del gene endogeno possono introdurre molti manufatti. Pertanto, questa tecnica dovrebbe essere combinato con altri per verificare la pertinenza della funzione. Ad esempio, la sovraespressione dovrebbe essere integrata da un&#39;espressione ridotta utilizzando siRNA o knockout genici, se disponibile. Con miRNA, abbiamo completato gli esperimenti iperespressione con quelli del blocco utilizzando virus che overexpressed miRNA artificiale siti che hanno agito come inibitori competitivi per un miRNA 15 targeting. cellule trasdotte retrovirali possono anche essere utilizzati in saggi biochimici che coinvolgono RNA e analisi di proteine. Tuttavia, un grosso limite di questi esperimenti è l&#39;efficienza di trasduzione resulting in una popolazione mista di cellule trasdotte e non trasdotte. Pertanto, questi test saranno molto probabilmente richiederà l&#39;ordinamento della GFP + popolazione. Infine, in vitro di differenziazione dovrebbero essere combinati con esperimenti in vivo, e un modo questo può essere realizzato è trasferendo adoptively cellule T trasdotte in topi e dopo la loro differenziazione e il loro effetto sulla risposta immunitaria. Uno dei limiti principali di questo sistema è la dimensione del genoma di RNA che può essere confezionato in capside retrovirale. Nella nostra esperienza, la dimensione massima di inserimento per il sistema retrovirale MIG che dà buona produzione virus è 3-3,5 kb. Pertanto, i geni più grandi non possono essere analizzati con questo sistema, in quanto forniscono poveri titoli di virus. Tuttavia, la maggior parte dei geni sono più piccole di questa dimensione così questo sistema è utile per un&#39;ampia varietà di studi gene. Con trasduzione retrovirale, diverse alternative all&#39;interno di questi protocosono stati utilizzati ls. Molti ricercatori hanno utilizzato linee cellulari di confezionamento che esprimono stabilmente i geni retrovirali (per esempio riferimento 16). Tuttavia, abbiamo ottenuto i titoli più alti utilizzando cellule HEK 293T standard, con il co-trasfezione del vettore virus helper PCL-Eco. Isolamento di cellule T helper naive può essere ottenuta anche attraverso cell sorting piuttosto che il tallone e separazione cellulare magnetica protocollo colonna, ma questo richiede l&#39;accesso a un cell sorter, ei costi per tempo specie sono tipicamente superiori ai reagenti tallone. Infine, ci sono variazioni su condizioni di attivazione utilizzati per differenziare le cellule T helper nei diversi sottoinsiemi. Ad esempio, TCR stimolazione delle cellule per troppo tempo prima dell&#39;esposizione Treg condizioni che inducono può inibire la loro induzione 16. Questo può essere un problema perché espressione retrovirale richiede divisione cellulare indotta dalla stimolazione di cellule. Tuttavia, abbiamo trovato efficiente induzione Treg utilizzando questo protocollo con O / N activzione prima di trasduzione retrovirale. All&#39;interno di questi protocolli, applicazione di successo richiede diversi fattori. preparati retrovirus ad alto titolo hanno bisogno di efficienza trasfezione delle cellule 293T HEK DNA così alta qualità e precisione preparato 2x HBS sono importanti. Inoltre, la densità cellulare delle cellule HEK 293T deve essere circa il 50% al punto di trasfezione causa buona espressione del DNA trasfettato richiede che le cellule sono in attiva crescita, e questo saranno inibiti se le cellule sono troppo scarsi o densi. Le cellule presso la densità ottimale durante trasfezione dovrebbero raggiungere confluenza ad un certo punto durante le fasi di raccolta dei virus, ma continuerà a produrre le riserve di virus ad alto titolo tutto il percorso attraverso l&#39;ultima collezione. Differenziazione efficiente delle cellule T helper richiede una buona qualità cellulare così garantire che le cellule isolate sono la purezza di figura 1. Analogamente, la qualità delle cellule dipende dalla fr topiom cui sono stati isolati. Per questi studi, abbiamo utilizzato 6-8 settimane di età C57BL 6 topi /. topi più anziani possono avere cellule meno ingenuo, e altri ceppi possono differire nella loro differenziazione. Ad esempio, topi BALB / c sono più inclini a risposte Th2 di topi C57BL / 6 17 così come indicato in precedenza, C57BL / 6 cellule T possono essere difficili da indurre una risposta Th2. Inoltre, una delle condizioni di differenziazione può variare leggermente da laboratorio a laboratorio, e l&#39;effetto del gene sovraespressione può diventare evidente in condizioni sub-ottimali solo così può avere bisogno di essere titolato concentrazioni di citochine nelle diverse condizioni di polarizzazione. Infine, gli effetti del gene overexpressed o le condizioni di polarizzazione sulla proliferazione cellulare può influenzare l&#39;efficienza di trasduzione così effetti misurazione del gene di interesse possono richiedere ottimizzare i tempi e la concentrazione dei reagenti polarizzanti. Ottimizzazione tutti questi fattori dovrebbe portare a risultati informativi con questo sistema.

La risposta immunitaria deve essere altamente regolata per eliminare le infezioni ma prevenire gli attacchi al tessuto proprio che portano all'autoimmunità. Le cellule T helper svolgono un ruolo essenziale nella regolazione della risposta immunitaria e sono stati intrapresi molti sforzi per comprendere il loro sviluppo e la loro funzione (illustrati in diverse recenti revisioni 1-3). Tuttavia, rimangono molte domande e molti approcci sono stati utilizzati per studiare i meccanismi che controllano lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper. Questi hanno spaziato dall'uso di sistemi di coltura cellulare in vitro ad animali interi. I sistemi di coltura cellulare, in particolare quelli che utilizzano linee cellulari, offrono il vantaggio della facilità d'uso e della capacità di generare grandi quantità di materiale per eseguire sofisticate analisi biochimiche. Tuttavia, soffrono della loro limitata capacità di riprodurre le condizioni reali che si verificano in una risposta immunitaria. Al contrario, gli esperimenti su animali interi offrono il vantaggio della rilevanza, ma possono soffrire di difficoltà nella manipolazione e nella capacità di eseguire controlli precisi oltre ai loro grandi costi e implicazioni etiche. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli studi sulle cellule T helper richiede ancora l'uso di esperimenti su animali interi che coinvolgono cellule T primarie a causa dell'incapacità delle linee cellulari di duplicare i passaggi esatti che si verificano nell'intero animale. Pertanto, è essenziale utilizzare approcci convenienti e altamente informativi. 
La genetica è uno strumento potente per studiare lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper, ma i metodi tradizionali che coinvolgono knockout genici o transgeni richiedono tempo e denaro, quindi sono spesso fuori dalla portata dei piccoli laboratori. Tuttavia, la trasduzione retrovirale offre un approccio genetico potente, rapido ed economico per studiare i meccanismi di specifici prodotti genici. Pertanto, è comunemente usato nei documenti che studiano lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper. 
Abbiamo ottimizzato una procedura per la trasduzione retrovirale delle cellule T helper. Utilizza il vettore di espressione retrovirale pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein), in cui il gene di interesse può essere clonato e quindi espresso dal retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. Inoltre, a valle del gene inserito di interesse c'è una sequenza di ingresso del ribosoma interno (IRES) seguita dal gene della proteina fluorescente verde (GFP) in modo che le cellule trasdotte possano essere facilmente seguite dalla loro espressione di GFP. Il vettore è stato originariamente derivato dai vettori del virus delle cellule staminali murine (MSCV), che contengono mutazioni nei siti di legame dei repressori negli LTR che li rendono resistenti al silenziamento e quindi danno un'elevata espressione in molti tipi di cellule, comprese le cellule T helper 5,6. La produzione di retrovirus ad alto titolo richiede un semplice protocollo di trasfezione transitoria delle cellule 293T del rene embrionale umano (HEK) con il vettore MIG e un vettore virale helper che esprime i geni retrovirali GAG, Pol ed Env. Per questo, il vettore virale helper pCL-Eco 7 funziona bene nella produzione di retrovirus incompetenti ad alto titolo di replicazione. 
Qui questi protocolli per la produzione retrovirale e la trasduzione di cellule T murine primarie sono descritti in aggiunta ad alcuni dei nostri risultati utilizzando questo approccio per studiare la regolazione dei miRNA dell'espressione genica che controlla la differenziazione delle cellule T helper. I miRNA sono piccoli RNA di circa 22 nucleotidi di lunghezza che regolano post-trascrizionalmente l'espressione genica prendendo di mira sequenze omologhe in RNA messaggeri codificanti proteine e sopprimendo la traduzione e inducendo Instabilità del messaggio 8,9. I miRNA svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione genica dello sviluppo. Sono essenziali nelle prime fasi dello sviluppo, poiché gli embrioni che non possono produrre miRNA muoiono in una fase molto precoce 10. Inoltre, i miRNA sono importanti in seguito nello sviluppo di molti tessuti. Si pensa che funzionino regolando l'espressione dei geni necessari per i programmi di sviluppo 1. Nelle cellule T helper, i miRNA svolgono molteplici ruoli e sono necessari per lo sviluppo delle cellule T regolatorie (Treg) 11-14. Abbiamo utilizzato la trasduzione retrovirale come mezzo per sezionare i meccanismi di regolazione dei miRNA della differenziazione delle Treg 15. Attraverso tali studi sono stati determinati importanti miRNA individuali mediante sovraespressione mediata retrovirale. Successivamente, sono stati identificati geni rilevanti regolati da questi miRNA al fine di comprendere le vie molecolari regolate dai miRNA nel differenziamento delle cellule T helper.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina soluzione</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MIG vettoriale</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 9094</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco vector</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 12371</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Kit di cellule CD4 di topo con perline magnetiche.</td><td>Invitrogen (Dynabeads)</td><td>11415D</td><td></td></tr><tr><td>Perline di streptavidina&nbsp;</td>Colonne di separazione cellulare <td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-102</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di separazione cellulare LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD25 MAb&nbsp biotenilato</td><td>BD Biosciences</td><td>85059</td><td>clone 7D4</td></tr><tr><td>CD62L MAb&nbsp biotenilato;</td><td>BD Biosciences</td><td>553149</td><td>clone MEL-14</td></tr><tr><td>polibrene (bromuro di esadimetrina)</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>clone 145-2C11&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD28</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>clone 37.51&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IL-4</td><td>BD Biosciences</td><td>559062</td><td>clone 11B11</td></tr><tr><td>Anti-IFN-gamma</td><td>BD Biosciences</td><td>559065</td><td>clone XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-2</td><td>BD Biosciences</td><td>554425</td><td>cloneJES6-5H4</td></tr><tr><td>IL-12 ricombinante p70</td><td>eBiosciences</td><td>14-8121</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 ricombinante</td><td>BD Biosciences</td><td>550067</td><td></td></tr><tr><td>ricombinante TGF-beta</td><td>eBiosciences</td><td>14-8342-62</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 ricombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8061</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 ricombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>PMA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBiosciences</td><td>00-4506</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td>La paraformaldeide è tossica, quindi usare la dovuta cautela durante la manipolazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Set di tamponi per colorazione Foxp3</td><td>eBiosciences</td><td>00-5523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4&nbsp; FITC</td><td>eBiosciences</td><td>11-0041</td><td>clone GK1.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD8a perCP-cy5.5</td><td>eBiosciences</td><td>45-0081-80</td><td>clone 53-6.7&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-MHCII PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0920</td><td>&nbsp; clone HIS19</td></tr><tr><td>Anti-CD25 PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0251-82</td><td>&nbsp; clone PC61.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD62L PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0621-82</td><td>clone MEL-14&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD44 APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0441</td><td>clone IM7&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IFN-gamma FITC&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>11-7311-81</td><td>clone XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554435</td><td>clone 11B11</td></tr><tr><td>Anti-IL-9 PE o APC</td><td>eBiosciences/Biolegend</td><td>50-8091-82/514104</td><td>clone RM9A4</td></tr><tr><td>Anti-IL-17a PE</td><td>BD Biosciences</td><td>559502</td><td>clone TC11-18H10</td></tr><tr><td>Anti-Foxp3&nbsp; APC o PE</td><td>eBiosciences</td><td>17-5773-82/12-5773-80&nbsp;</td><td>clone FJK-16s</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio/glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, acido libero</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodico</td><td>Sigma</td><td>D2900000</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>237205</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr></tbody></table>

trasduzione retrovirale di cellule t helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper devono essere strettamente regolati per indurre una risposta immunitaria appropriata che elimini specifici agenti patogeni ma prevenga l'autoimmunità. Sono stati utilizzati molti approcci che coinvolgono diversi organismi modello per comprendere i meccanismi che controllano lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper. Tuttavia, gli studi che utilizzano modelli murini si sono dimostrati altamente informativi grazie alla disponibilità di sistemi genetici, cellulari e biochimici. Un approccio genetico nei topi utilizzato da molti laboratori prevede la trasduzione retrovirale delle cellule T helper primarie. Questo è un approccio potente grazie alla sua relativa facilità, che lo rende accessibile a quasi tutti i laboratori con competenze di base in biologia molecolare e immunologia. Pertanto, la funzione di più geni in forme wild type o mutanti può essere facilmente testata per la funzione nelle cellule T helper per comprenderne l'importanza e i meccanismi d'azione. Abbiamo ottimizzato questo approccio e descriviamo qui i protocolli per la produzione di retrovirus ad alto titolo, l'isolamento delle cellule T helper murine primarie e la loro trasduzione da parte dei retrovirus e la differenziazione verso i diversi sottogruppi helper. Infine, l'uso di questo approccio è descritto nella scoperta dei meccanismi utilizzati dai microRNA (miRNA) per regolare i percorsi che controllano lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper.

Il successo di questo sistema sperimentale richiede popolazioni altamente pure di cellule T e preparati retrovirus ad alto titolo. Risultati rappresentativi sono mostrati qui come esempi di esperimenti riusciti. Figura 1 mostra la purezza tipica delle popolazioni pre e post-selezionato a ciascuna fase del protocollo naive isolamento cellulare helper T. Figura 2 e 3 illustrano l&#39;analisi della produzione retrovirus attraverso l&#39;espressione GFP nelle cellule HEK 293T trasfettate (Figura 2) e le cellule T trasdotte (Figura 3). Efficienze di trasfezione delle cellule HEK 293T possono variare significativamente differenti costrutti retrovirali, ma spesso non correlato con il livello di produzione retrovirus osservato con il numero di cellule T + GFP. Inoltre, il numero di cellule T GFP può variare a seconda delle condizioni di polarizzazione. Inoltre, il mean livello di espressione della GFP e gene inserito può variare a seconda del numero di copie del virus integrata, l&#39;effetto del sito di integrazione sulla trascrizione, e meccanismi di regolazione post-trascrizionale influenzano la trascrizione virale. Infine, la Figura 4 mostra alcuni risultati tipici che abbiamo osservato con differenziazione delle cellule T helper quando il miRNA miR-15b / 16 sono sovraespresso. Questi risultati mostrano alcune delle variabilità che possono verificarsi all&#39;interno di un esperimento individuo in modo veri effetti devono essere giustificati da un&#39;analisi statistica dei molteplici esperimenti ripetuti utilizzando diverse preparazioni di cellule T helper. In questi esperimenti risposta Th2 può essere difficile osservare nella linea C57BL / 6 usato qui perché sono inclini a risposte Th1. Analogamente, IL-9 colorazione può essere difficile da rilevare sopra sfondo. Pertanto, è assolutamente necessario fare controlli isotipo e impostare una compensazione adeguata per garantire la corretta gating di espressione di citochine. Nei nostri risultati abbiamo scoperto che miR-15b / 16 migliora iTreg induzione inibendo la via di segnalazione mTOR attraverso sopprimendo l&#39;espressione dei componenti Rictor e mTOR 15. miR-15b / 16 a volte può influenzare Th0, Th1, Th17 e differenziazione nei singoli esperimenti, ma non vi è alcun effetto significativo quando ha esaminato in più esperimenti di ripetizione. In contrasto con miR-15b / 16 sovraespressione non sopprime in modo significativo Th9 differenziazione (vedi riferimento 18). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> Figura 1. tipico purezza delle cellule T helper in ogni fase di isolamento. Flusso rappresentante citometria risultati degli antigeni indicati sono mostrati dal cancello di cellule vive designati nella Forward Scatter (FSC) e trame Side Scatter (SSC). (A) pre e post-CD4 selezione negativa. profili di espressione di CD4,CD8a e MHCII sono mostrate. Questi illustrano l&#39;arricchimento delle cellule T helper e la perdita delle cellule T citotossiche e MHC di classe II cellule esprimenti. Un buon purificazione dovrebbe comportare ~ 90% delle cellule T CD4 + in questa fase. (B) selezione CD25. Sulla sinistra sono i profili di espressione di CD4, CD8a, e MHCII, e sulla destra sono il CD4 e CD25 espressione profili pre e post selezione. A questo punto&gt; 95% delle cellule CD25 negativamente selezionati dovrebbero essere CD4 + CD25 -. (C) CD62L selezione. CD4, CD8a, e MHCII profili di espressione vengono visualizzati sul lato sinistro. Sulla destra i profili di espressione di CD62L e CD44 sono indicati per le cellule pre e post-CD62L selezionati lungo con CD4 e CD62L profilo di espressione di cellule post selezionato. Dopo la selezione CD62L virtualmente tutte le celle di memoria (CD44 +) vengono rimossi lasciando una popolazione altamente arricchito di cellule T helper naive che contiene 10-15% delle cellule effettrici (CD62L basso). Per tuttiprofili di FACS, le impostazioni equivalenti e scale per un parametro specifico sono stati mantenuti in tutto. I numeri rappresentano la percentuale di cellule all&#39;interno di una popolazione gated. La leggera diminuzione della dimensione delle celle dopo la selezione iniziale è presumibilmente dovuto alle sollecitazioni meccaniche durante il protocollo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi delle cellule 293T HEK retrovirus trasfettate. Espressione GFP è mostrato in cellule HEK 293T che erano o untransfected o trasfettate e analizzato dopo la raccolta dei surnatanti coltura virale. analisi GFP è stato fatto su cellule vive dal cancello sulla FSC e SSC plot nel primo pannello. Numeri rappresentano la percentuale di GFP + cellule all&#39;interno della regione gated. tipico tefficienze ransfection variano tra il 30-90%. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> Figura 3. Analisi delle cellule T helper retrovirus trasdotte. Espressione GFP è mostrato in cellule T helper retrovirali-trasdotte dopo la differenziazione in Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, e le condizioni di polarizzazione Treg per tre giorni. L&#39;analisi è stata recintato su cellule vive e attivate indicati nel pannello FSC / SSC. efficienza di trasduzione possono variare tra 10-75% a seconda del costrutto e le condizioni di polarizzazione. Allo stesso modo, l&#39;intensità fluorescente mezzo di espressione GFP può variare. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 4. Effetto del miR-15b / 16 sovraespressione sul aiutante differenziazione delle cellule T in diverse condizioni di polarizzazione. Profili di citochine rappresentativi sono mostrati sul GFP + popolazione di cellule di figura 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> Tabella 1:. Buffer utilizzati in questi protocolli <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare la tabella come un foglio di calcolo di Excel.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> aiutantecondizioni di polarizzazione delle cellule T </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TH0 </td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td> ricombinante-IL-12 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2 </td><td> ricombinante IL-4 </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th9 </td><td> ricombinante TGF-β </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> ricombinante IL-4 </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17 </td><td> ricombinante TGF-β </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> ricombinante IL-6 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-2 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> ricombinante TGF-β </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> ricombinante IL-2 </td><td> 5 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabella 2: condizioni di polarizzazione sottoinsieme delle cellule T helper.

Molti sistemi sperimentali sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi che regolano lo sviluppo delle cellule T e la funzione in una risposta immunitaria. Qui un approccio genetico mediante trasduzione retrovirale è descritto, che è economica, tempo efficiente e, soprattutto, altamente informativo nell&#39;identificare vie di regolazione.

Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è isolare linfociti T helper primari murini e trasdurnarli con costrutti di espressione retrovirali per un gene di interesse. Molti sistemi sperimentali sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi che regolano lo sviluppo e la funzione dei linfociti T in una risposta immunitaria. Qui descriviamo un approccio genetico che utilizza la trasduzione retrovirale, che è economico, efficiente in termini di tempo e altamente informativo nell'identificare le vie regolatorie.Abbiamo utilizzato questa tecnica per analizzare la funzione dei microRNA, che sono importanti regolatori dell'espressione genica. Utilizzando la trasduzione retrovirale, siamo stati in grado di testare la funzione di singoli microRNA e della differenziazione delle cellule T helper. Il mio collaboratore, Oliver Garden, mostrerà l'isolamento delle cellule T primarie, mentre io mostrerò la trasduzione retrovirale.24 ore prima della trasfezione, suddividere una piastra confluenziale di cellule in un rapporto di 1:10 in una piastra da 10 centimetri, in modo che le cellule siano circa al 50% di confluenza il giorno successivo. Circa un'ora prima della trasfezione, rimuovere il mezzo dalle cellule e aggiungere con attenzione 9 millilitri di mezzo fresco per cellule HEK293 T, per evitare che le cellule si stacchino dalla piastra. In un tubo rotondo da sei millilitri o in un tubo conico da 15 millilitri, aggiungere 5 microgrammi di DNA retrovirale, 5 microgrammi di DNA del virus helper e acqua fino a un volume di 420 microlitri.Quindi, aggiungere 80 microlitri di cloruro di calcio 2,5 M per portare il volume finale a 500 microlitri. Successivamente, aggiungere lentamente 500 microlitri di HBS 2x goccia a goccia alla miscela di DNA, agitando delicatamente con un vortex, in modo che la soluzione venga mescolata continuamente e i precipitati di fosfato di calcio si formino in cristalli di dimensioni uniformi. In seguito, trasferire la miscela di DNA con fosfato di calcio in una cappa a flusso laminare per colture cellulari.Aggiungere lentamente la miscela alle cellule, agitando costantemente e delicatamente la piastra, quindi riposizionare le cellule nell'incubatore. Per raccogliere il virus il giorno successivo, rimuovere il mezzo e aggiungere alle cellule 10 millilitri di mezzo fresco per HEK293 T, avendo cura di non staccare le cellule dalla piastra. Alla sera, aggiungere alle cellule 3,5 millilitri di mezzo fresco per HEK293 T e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 12 ore.Dopo circa 12 ore, raccogliere il mezzo e aggiungere nuovamente alle cellule 3,5 millilitri di mezzo fresco per HEK293 T. Ripetere il prelievo del mezzo altre due volte, a intervalli di circa 12 ore, ottenendo in totale circa 10 millilitri di stock virale. In questo procedimento, aggiungere milza e linfonodi al colino per cellule e macerare utilizzando l'estremità dello stantuffo di una siringa da cinque millilitri.Successivamente, risciacquare con uno-due millilitri di mezzo R10. Quindi trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri e portare il volume a 14 millilitri con R10. Centrifugare le cellule a 600 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Successivamente, eliminare il soprannatante versandolo con un unico movimento pulito, per evitare di disturbare il pellet cellulare. Poi, aggiungere due millilitri di tampone freddo per la lisi dei globuli rossi alle cellule. Mescolare, quindi mettere le cellule sul ghiaccio per 3,5 minuti, mescolando delicatamente per tutto il tempo.Quindi, aggiungere 12 millilitri di mezzo R10 e centrifugare immediatamente a 600 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Eseguire ulteriori due lavaggi con mezzo R10 per rimuovere qualsiasi residuo di tampone emolitico dalle cellule ed evitare la morte dei linfociti. In questo passaggio, aliquotare da otto a dieci ×10⁷ cellule per provetta conica e centrifugare a 600 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Versare il soprannatante con un unico movimento preciso, per evitare di disturbare il pellet cellulare. Quindi, risospendere le cellule in 100 microlitri di FBS inattivato termicamente. Successivamente, aggiungere alle cellule 100 microlitri di mix di anticorpi e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius, con mescolamento delicato su un rullo.Successivamente, risospendere le perle nel vial, vortexando per più di 30 secondi. Trasferire quindi le perle in un tubo conico da 15 millilitri e aggiungere 2 millilitri di mezzo R10 per ogni millilitro di perle. Posizionare il tubo sul magnete per un minuto.Quindi eliminare il soprannatante e risospendere le perle in quattro millilitri di mezzo R10. Lavare le cellule al termine dell'incubazione con l'anticorpo aggiungendo 10 millilitri di mezzo R10 per tubo e centrifugare a 600 × g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Versare il soprannatante con un unico movimento accurato per evitare di disturbare il pellet cellulare, quindi risospendere le cellule in 1 millilitro di mezzo R10.Successivamente, aggiungere 2 millilitri delle perle lavate al tubo contenente le cellule trattate con l'anticorpo e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius, con mescolamento delicato su un rullo. Quindi, risospendere la miscela di cellule e perle, pipettando delicatamente cinque volte prima di posizionare il tubo nel magnete per due minuti. Trasferire il soprannatante contenente le cellule selezionate negativamente in un nuovo tubo e ripetere la selezione negativa un'altra volta.In questo procedimento, centrifugare le cellule T positive per CD4 a 600 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere in 150-200 microlitri di mezzo R10 per ogni 10^8 cellule. Successivamente, aggiungere due microlitri di anticorpi monoclonali biotinilati anti-CD25 in soluzione stock alle cellule e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius con mescolamento delicato su un rullo. Successivamente, lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di tampone per colonna di separazione cellulare e centrifugare a 600 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Quindi, rimuovere il più possibile il sopranatante e risospendere le cellule in un volume finale di circa 90 microlitri per 10 alla settima cellule. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di microsferette di streptavidina per 10 alla settima cellule e mescolare con leggeri colpetti. Incubare quindi per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Durante l'incubazione delle cellule, preparare le colonne MS. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di buffer per colonna di separazione cellulare e centrifugando a 600 × g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Ri-sospendere le cellule in 500 microlitri di buffer per colonna di separazione cellulare ogni 10 alla ottava cellule.Successivamente, applicare 500 microlitri di sospensione cellulare sulla colonna e raccogliere il flusso in uscita. Far passare nuovamente il flusso in uscita sulla colonna e raccoglierlo ancora una volta. Quindi, lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di buffer per colonna di separazione cellulare, aggiungendo ogni flusso in uscita alle cellule CD25 negative raccolte.Eseguire il lavaggio, il legame con le perle di streptavidina e la preparazione della colonna di separazione cellulare come indicato in precedenza, ma utilizzare la colonna LS. Questa volta, scartare il flusso passante e eluire le cellule dalla colonna con la siringa fornita. Durante l'isolamento dei linfociti T naïve, rivestire una piastra da coltura tissutale da 24 pozzetti con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 diluiti in DPBS, e incubare per due ore a 37 gradi Celsius.Immediatamente prima della coltura delle cellule, lavare la piastra con 250 microlitri di DPBS per pozzetto, per rimuovere l'anticorpo non legato. Successivamente, rimuovere il DPBS e aggiungere 1 millilitro di cellule T naive CD4 positive in mezzo R10 per tutta la notte. Il giorno seguente, centrifugare le cellule a 900 ×g per 10 minuti a 30 gradi Celsius.Quindi raccogliere il mezzo e aggiungere 1 millilitro di surnatante della coltura virale, preparato dal protocollo di produzione del virus. Successivamente, aggiungere 1 microlitro di polibrene a 8 milligrammi per millilitro e 10 microlitri di HEPES 1 molare, al fine di favorire l'assorbimento del virus prima di centrifugare le cellule a 900 ×g per 90 minuti a 30 gradi Celsius. Per differenziare le cellule, rimuovere con attenzione il surnatante della coltura virale e aggiungere 1 millilitro del mezzo raccolto in precedenza, poiché contiene IL2 e altri fattori di crescita delle cellule T.Quindi aggiungere i reagenti indicati nella Tabella 2 del manoscritto allegato e coltivare le cellule per tre-quattro giorni per differenziarle in specifici sottogruppi. Questa figura mostra la purezza tipica delle popolazioni prima e dopo la selezione a ogni stadio del protocollo di isolamento delle cellule T helper naive. I profili di espressione di CD4, CD8A, MHC II, CD25, CD62L e CD44 illustrano la perdita di cellule MHC Classe 2, oltre a cellule T citotossiche, regolatorie e a memoria.Ciò determina una popolazione composta per oltre il 95% da linfociti T positivi per CD4, di cui circa l'85-90% sono cellule naive e la restante percentuale del 10-15% sono cellule effettrici. In questa figura, l'espressione di GFP è mostrata in cellule HEC293 T, non trasfettate o trasfettate, e analizzate dopo il prelievo dei supernatanti della coltura virale. L'analisi di GFP è stata effettuata su cellule vitali selezionate tramite il gate nel grafico FSE e SSE.Le efficienze di trasfezione tipiche variano tra il 30% e il 90%. Qui, l'espressione di GFP è mostrata in cellule T helper trasdotte con retrovirus dopo la differenziazione in condizioni di polarizzazione Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 e T reg per tre giorni. Le efficienze di trasduzione variano tra il 10% e il 75%, a seconda del costrutto e delle condizioni di polarizzazione. Di seguito sono riportati i profili citochinici rappresentativi della differenziazione delle cellule T helper in diverse condizioni di polarizzazione.Una volta padroneggiate, queste tecniche possono rappresentare un metodo potente per analizzare la funzione genica e lo sviluppo e la funzione delle cellule T helper. Ricordate che risultati informativi dipendono dalla qualità delle cellule e dei reagenti. È quindi fondamentale ottimizzare i protocolli di trasduzione nonché l'isolamento e la differenziazione delle cellule T helper.

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Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

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