Un modello murino di Gruppo B Streptococcus Colonizzazione vaginale

L'obiettivo generale di questo modello animale è quello di stabilire lo streptococco di gruppo B, o colonizzazione GBS del tratto vaginale murino. Questo metodo può aiutarci a comprendere le domande chiave sulla colonizzazione da streptococco di gruppo B, come ad esempio quali sono i fattori batterici importanti per la colonizzazione e come le risposte dell'ospite influiscono sulla persistenza vaginale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'inoculazione, in genere, si traduce in una colonizzazione superiore al 90% senza l'uso di anestesia, immunosoppressori o agenti addensanti.

Inizia facendo vorticare 0,5 milligrammi di beta-estradiolo, per topo, in un tubo conico da 15 millilitri fino a quando tutti i grumi sono stati rimossi e il beta-estradiolo appare come una polvere fine. Quindi, filtrare 100 microlitri di olio di sesamo, per topo, nel tubo attraverso un colino da 0,45 micron e far vorticare nuovamente il tubo. Quando l'ormone è distribuito come una sospensione omogenea in tutto l'olio, aspirare il reagente in una nuova siringa da 10 millilitri e collegare un ago da 18 gauge, un pollice.

Aliquotare 100 microlitri di sospensione in una siringa di tubercolina da un millilitro, per topo, e dotare ogni siringa di tubercolina di un ago sterile da 26 gauge, da mezzo pollice. Quindi, erogare 100 microlitri di beta-estradiolo nel quadrante inferiore sinistro o destro della cavità peritoneale di ciascun animale. Lo stesso giorno dell'iniezione, coltivare una coltura liquida notturna da cinque millilitri del ceppo GBS di interesse nel brodo Todd Hewitt, o THB, a 37 gradi Celsius.

La mattina successiva, sottocolture il GBS a un volume da uno a 10 in THB fresco per un'incubazione di due o tre ore a 37 gradi Celsius, fino a quando i batteri raggiungono la fase di metà logaritmica. Quindi, trasferire la sottocoltura in una provetta conica sterile da 15 millilitri e centrifugare le cellule batteriche. Risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS sterile.

Quindi, portare il volume totale della sospensione fino a un millilitro di PBS per 10 topi, per raggiungere un OD600 di 0,4 in una nuova provetta di coltura da cinque millilitri. Trasferire la coltura in una nuova provetta da 15 millilitri e ripellettare i batteri. Quindi, risospendere le cellule in PBS a un decimo del volume originale.

Riservare 50 microlitri di batteri per la diluizione e l'impiattamento in serie sull'agar THB, per determinare l'esatta CFU dell'inoculo. Quindi, aspirare 10 microlitri di GBS in un puntale di pipetta da 200 microlitri di gel e fissare manualmente la pelle flaccida alla collottola, del primo animale, tra il pollice e l'indice, seguita dall'immobilizzazione della coda. Inserire la punta della pipetta da 5 a 10 millimetri nel lume vaginale ed erogare l'intero volume dell'inoculo.

Quindi, rilascia immediatamente la collottola e solleva la coda per sollevare l'estremità posteriore dell'animale, mentre cammini con le zampe anteriori su una superficie dura. Dopo un minuto, ispezionare visivamente l'apertura vaginale per verificare la presenza di eventuali riflussi dell'inoculo. Poco prima del tampone, pre-bagnare il cotone in PBS e trattenere uno dei topi come appena dimostrato.

Inserire il tampone di 10 millimetri nel lume vaginale e ruotare delicatamente quattro volte in senso orario e quattro volte in senso antiorario, esercitando una leggera pressione sulla parete vaginale. Posizionare il tampone in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di PBS e agitare la provetta e il tampone per circa 15 secondi per rilasciare i batteri dalle fibre di cotone. Quindi, diluire in serie ogni campione in PBS e impiattare 20 microlitri da una a 10 a 10.000 diluizioni su una piastra di agar con terreno differenziale, preparata secondo le istruzioni del produttore, per l'incubazione a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Le colonie GBS appariranno di colore rosa brillante o malva. Per raccogliere la lavanda vaginale, utilizzare un puntale per pipetta da 200 microlitri di gel per erogare 20 microlitri di PBS nel lume vaginale. Pipettare delicatamente l'intero volume su e giù quattro volte all'interno del lume.

Quindi, utilizzando la stessa punta, prelevare l'intero volume. Per l'analisi del fluido di lavaggio a valle, erogare il lavaggio in una provetta per microcentrifuga da 0,7 millilitri. Per l'omogeneizzazione della dissezione tissutale, spruzzare lungo l'addome ventrale di un animale soppresso con il 70% di etanolo e utilizzare forbici sterili per aprire la cavità addominopelvica.

Sposta l'intestino in modo che il tratto riproduttivo sia esposto. Quindi, taglia entrambe le corna uterine, a metà lunghezza, tra il corpo uterino e le ovaie. Usando forbici e pinze, separa il grasso viscerale, le membrane e la vescica urinaria dal tratto riproduttivo, muovendo i tessuti caudalmente.

Quindi, taglia trasversalmente la vagina il più vicino possibile alla vulva, per separare il tratto riproduttivo dal corpo. Trasferisci il tratto riproduttivo intatto in una capsula di Petri sterile e usa una nuova lama di rasoio per separare l'utero dalla cervice in un unico taglio trasversale. Separare la cervice dalla vagina con un altro taglio trasversale.

Quindi, utilizzare una pinza sterile per trasferire ciascuno dei tessuti in singole provette da due millilitri pre-pesate contenenti 500 microlitri di PBS e perle omogeneizzanti. Pesare ogni provetta da 2 millilitri per determinare il peso del tessuto. Quindi, sigillare ermeticamente le provette con tappo a vite e omogeneizzare i tessuti, per un minuto, alla massima velocità, in un omogeneizzatore tissutale.

Per quantificare la carica batterica, diluire in serie 25 microlitri di omogeneizzato tissutale e disporre di diluizioni da una a 10 a 10.000 su piastre di agar con terreno differenziale, per un'incubazione di 24 ore, a 37 gradi Celsius. Per conservare i campioni per la quantificazione delle citochine, congelare gli omogeneizzati a meno 20 gradi Celsius. In queste immagini, vengono dimostrate le quattro fasi del ciclo dell'estro del topo, determinate dal liquido di lavaggio vaginale montato a umido.

I topi inoculati nella fase di proestro sono stati colonizzati con GBS più a lungo di qualsiasi altra fase di estro, in particolare quelli in diestro al momento dell'inoculazione. L'estro prolungato promuove la persistenza di GBS A909 nei topi CD-1 con una colonizzazione del 90% osservata due settimane dopo l'inoculazione. In un tipico esperimento con una dose di beta-estradiolo prima dell'inoculazione, solo il 40-50% dei topi è stato colonizzato una settimana dopo l'inoculazione, con un GBS medio recuperato che imita la percentuale di colonizzazione.

Dimostrando che il mantenimento di un estro continuo promuove la persistenza vaginale GBS nella maggior parte dei topi CD-1. GBS A909 persiste nel tratto vaginale nei topi CD-1 outbred e nei topi FVB inbred per, circa, una settimana. Mentre la maggior parte dei topi consanguinei BALB/c e C57BL/6 vengono colonizzati a una settimana per un mese o più.

La visualizzazione di GBS GFP positivo negli animali inoculati dimostra la presenza di GBS aderita all'epitelio vaginale murino e in prossimità di altra flora vaginale autoctona. È importante prevenire il riflusso, durante l'inoculazione, per garantire che tutti i topi vengano colonizzati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in una o due ore, a seconda del numero di animali.

Questo modello consente ai ricercatori nel campo delle interazioni ospite/patogeno di esplorare la capacità dei batteri, come lo streptococco di gruppo B, di colonizzare il tratto riproduttivo femminile. Questa procedura può essere utilizzata per testare nuovi composti o trattamenti probiotici per rispondere a ulteriori domande sugli interventi terapeutici.