rilevamento di Trypanosoma brucei Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso

L'obiettivo generale di questo metodo è isolare i tripanosomi che esprimono una particolare variante della glicoproteina di superficie o VSG dal resto della popolazione e identificare i parassiti che sono passati dal VSG dominante iniziale a qualsiasi altro VSG. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia del tripanosoma, come ad esempio, quali sono i fattori o gli eventi che influenzano il passaggio al VSG in una popolazione di parassiti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è più veloce dei metodi pubblicati in precedenza e consente una facile quantificazione delle celle di passaggio a quelle non di commutazione.

Quando il laboratorio ha iniziato a lavorare sulla variazione antigenica, il primo problema è stato come rilevare gli switcher rari. Questo tipo di problema è stato effettivamente risolto in immunologia un certo numero di anni fa, attraverso l'uso del sorting cellulare attivato da magneti per arricchire le cellule che erano negative per un particolare tratto. Trasferire il processo di non selezione alla variazione antigenica sembrava un'idea davvero promettente.

Per iniziare, i tripanosomi del flusso sanguigno del ceppo Lister 427 dovrebbero essere coltivati a una densità compresa tra 0,5 e 100.000 per millilitro. Aliquotare un campione da 50 volte 10 a sei cellule in una provetta da 15 millilitri e quindi centrifugare. Conservare una volta per 10 le sei cellule e la coltura da utilizzare in seguito come controlli anticorpali positivi e negativi.

Pipettare la maggior parte del surnatante lasciando circa 750 microlitri nella provetta. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Infine, centrifugare le celle a quattro gradi Celsius per quattro minuti a 2800 volte g.

E poi pipettare tutto il surnatante. Risospendere le cellule in 150 microlitri di terreno di coltura, più l'anticorpo primario anti variante della glicoproteina di superficie o anti VSG alla diluizione appropriata. Quindi, agitare le celle a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Lavare con 800-1000 microlitri di terreno di coltura a freddo. Centrifugare le celle a quattro gradi Celsius per quattro minuti a 5200 volte g. Dopo aver aspirato il surnatante, lavare le cellule con un millilitro di terreno di coltura e centrifugare nuovamente.

Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 100 microlitri di terreno di coltura. Aggiungere 110 microlitri di microsfere di selezione cellulare attivate magneticamente del tipo appropriato per l'anticorpo primario. Mescolare bene pipettando su e giù e poi a vortice.

Mentre le celle sono in vortici, impostare una colonna di separazione attivata magneticamente. Posizionare un tubo da 15 millilitri sotto di esso per raccogliere il mezzo di adescamento. Aggiungere due millilitri di terreno di coltura per innescare la colonna.

Quindi, rimuovere il campione dal vortice e aggiungere da 800 a 1000 microlitri di terreno di coltura freddo. Centrifugare il campione e quindi rimuovere il surnatante per rimuovere l'anticorpo non legato. Lavare le cellule pellettate con un millilitro di terreno di coltura e centrifugare nuovamente.

Questa volta aspirare il surnatante ma lasciare 100 microlitri nel tubo. Agitare energicamente la provetta da centrifuga fino a quando il pellet non è completamente risospeso. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura e pipettare su e giù per risospendere completamente le cellule.

Rimuovere il tubo conico da 15 millimetri utilizzato per raccogliere il mezzo di adescamento e sostituirlo con un nuovo conico da 15 millilitri per raccogliere il flusso contenente i parassiti commutati. Applicare la sospensione cellulare alla colonna innescata. Raccogliere il flusso in una provetta da 15 millilitri al di sotto della quale in genere ci vogliono dai sei ai sette minuti per un millilitro di terreno più tripanosomi.

Quindi, lavare la colonna due volte con un millilitro di terreno di coltura e raccogliere il flusso nella stessa provetta. Dividi il flusso, che dovrebbe ammontare a circa tre millilitri, in due provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, posizionare i tubi sul ghiaccio.

Aggiungere tre millilitri di terreno di coltura alla colonna e immergere la colonna in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Questo otterrà le cellule che esprimono il VSG dominante di partenza. Rimuovere 300 microlitri di questo materiale eluito e tenerlo in ghiaccio, il resto può essere scartato.

Per creare un controllo positivo, prelevare circa 100.000 cellule dalla coltura iniziale di cellule e pipettarle in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Ripetere l'operazione per creare un controllo negativo. Centrifugare i campioni a flusso continuo e il campione di controllo positivo.

E poi rimuovere e scartare il surnatante. Risospendere le cellule di controllo positivo in 100 microlitri di terreno di coltura con anticorpo anti-VSG marcato con fluoroforo primario alla diluizione appropriata. Successivamente, risospendere un pellet a flusso continuo in 100 microlitri di terreno di coltura con anticorpo anti-VSG primario marcato con fluoroforo alla diluizione appropriata.

Utilizzare la sospensione per quindi risospendere il pellet nel secondo tubo a flusso continuo ottenendo un tubo della piscina. Mescolare bene pipettando su e giù. Agitare le cellule e quindi aggiungere da 800 a 1000 microlitri di terreno di coltura freddo.

Centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius per quattro minuti a 5200 volte g e quindi scartare il surnatante per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Lavare le cellule con un millilitro di terreno di coltura, quindi centrifugare le cellule. I controlli positivi e negativi e le cellule eluite precedentemente conservate su ghiaccio.

Scartare il surnatante. Successivamente, aggiungere 148,5 microlitri di terreno di coltura ai campioni. Quindi, aggiungere 25 microlitri di perle di conteggio assoluto, seguite da 1,5 microlitri di soluzione colorante di ioduro di propidio.

Risospendere i pellet di controllo positivo e negativo con 175 microlitri di terreno di coltura. I campioni possono ora essere analizzati sul citometro a flusso. Questi grafici di citometria a flusso mostrano i risultati della separazione cellulare da popolazioni di tripanosomi indotte a creare una rottura del DNA a doppio filamento rispetto alle cellule non indotte.

I pannelli di sinistra mostrano la dispersione in avanti rispetto a quella laterale, che consente di chiarire le cellule vive rispetto a quelle morte e le perle aggiunte al campione. È quindi possibile generare porte che le determinano in base alle caratteristiche di dispersione. I pannelli di destra mostrano solo quelle celle che potrebbero essere classificate come attive in base alle porte di dispersione generate nei pannelli di sinistra.

Il VSG iniziale dominante in questo caso era il VSG due. Le cellule che si colorano positivamente per lo ioduro di propidio sono cellule morte. E questi si vedono nelle regioni Q uno e Q due del grafico.

Le cellule che si colorano positivamente per il VSG dominante e negativamente per il PI cadono nella regione Q tre e sono contaminanti. Infine, le cellule in Q quattro sono cellule vive che si colorano negativamente per il VSG dominante che sono considerate switcher. Questo grafico mostra le frequenze di commutazione osservate calcolate delle popolazioni di tripanosomi con rispetto a quelle senza rotture indotte.

Il livello di commutazione stocastica in vitro è piuttosto basso. Mentre l'induzione di una rottura si traduce in un numero significativamente maggiore di cellule, il passaggio al VSG non dominante. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre ore.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere i campioni freddi e risospendere adeguatamente i pellet, soprattutto prima dell'isolamento sulla colonna. Seguendo questa procedura, altri metodi come il sequenziamento dell'RNA possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali VSG vengono espressi in una popolazione switch. Questi metodi sono tipicamente utilizzati per misurare la commutazione VSG, possono anche essere utilizzati per l'isolamento e la quantificazione di parassiti che esprimono qualsiasi proteina di superficie di interesse.