Name: rilevamento di Trypanosoma brucei Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri come isolare Trypanosoma brucei che esprimono specifiche glicoproteine di superficie varianti (VSG) mediante ordinamento cellulare magnetico attivato e citometria a flusso. Questo metodo rapido permette di rilevare rari parassiti switcher e quantificare l'espressione VSG nelle popolazioni.

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Vorremmo riconoscere George Cross per consigli generali sulla biologia trypanosome. Questo lavoro è stato supportato anche da un Bill e Melinda Gates Foundation GCE concessione per DS, un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.325.261) per MRM e un NIH / NIAID (grant # AI085973) al FNP. Ringraziamo Galadriel Hovel-Miner per l&#39;uso del ceppo che contiene il sito del gene e il riconoscimento I-SCEI.

NOTA: Durante la procedura, è necessario mantenere le cellule in ghiaccio. supporti a freddo dovrebbero essere utilizzati in tutto. Raccolta 1. Esempio <ol><li> Grow Lister 427 tripanosomi ceppo sangue per una densità di 0,5 - 1 milione / ml. È meglio iniziare culture con un piccolo numero di parassiti. Spin down 50 x 10 6 cellule / campione per 10 min a 1500 x g. Assicurarsi di lasciare 1 x 10 6 cellule in coltura per poi utilizzare i controlli di anticorpi come positivi e negativi. NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato anche su trypanosomes isolate dal sangue animale (vedi la discussione per i dettagli). </li><li> Pipetta o versare fuori la maggior parte del surnatante (lasciare circa 750 ml). Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Spin cellule a 4 ° C per 4 min a 5200 xg in una microcentrifuga e rimuovere il surnatante. </li></ol> 2. L&#39;etichettatura magnetica <ol><li> Risospendere le cellule in 150 microlitri terreno di coltura (HMI-9 with siero per esempio) + anticorpo anti-VSG primaria alla diluizione appropriata. NOTA: L&#39;anticorpo anti-VSG è fatta in casa e utilizzato a una diluizione 1:50. È importante utilizzare un anticorpo primario anti-VSG che non è etichettato con un fluoroforo. </li><li> cellule Vortex utilizzando un vortice adattatore 60 a velocità 6 - 8 in una camera fredda a 4 ° C per 10 min. Lavare con 800 - 1.000 ml freddo HMI-9 con siero. </li><li> Spin a 4 ° C per 4 min a 5200 xg e aspirare il surnatante. Lavare con 1 ml di HMI-9 con il siero e spin come sopra. Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in 100 ml di HMI-9 con siero. </li><li> Aggiungere 110 ml di cellule magnetiche attivate ordinamento microsfere (MSC). Usa anti-topo, anti-coniglio, o perle anti-biotina come appropriato per l&#39;anticorpo anti-VSG primaria. Mescolare bene. cellule Vortex in una camera fredda a 4 ° C per 10 min. </li><li> Mentre le cellule sono vortex, impostare una separazione colonna / campione magnetico attivato su un magnete di separazione. Assicuratevi di avere un receptacle (usiamo una provetta da centrifuga da 15 ml) sotto la colonna per raccogliere il flusso continuo. Sistemare il dispositivo in una stanza fredda. </li><li> Aggiungere 2 ml di HMI-9 con il siero di colonna Prime. Dopo innesco posto un tubo da centrifuga da 15 ml sotto la colonna per raccogliere flusso continuo di ciascun campione. </li><li> Dopo il 10 min di incubazione nel passo 2.4, aggiungere 800-1000 ml freddo HMI-9 con siero. Spin a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante per rimuovere l&#39;anticorpo non legato. Lavare con 1 ml di HMI-9 con siero e ripetere lasciando 100 ml di surnatante. </li><li> Flick la provetta vigorosamente ed ispezionare visivamente il tubo per assicurarsi che il pellet è completamente risospeso. Aggiungere 1 ml di HMI-9 con siero e pipetta su e giù per fare in modo che le cellule sono ben risospese. </li></ol> 3. La separazione magnetica <ol><li> Assicurarsi che le colonne sono preparati come descritto sopra. Applicare le cellule a colonna. Raccogliere flow-through con cellule esprimenti il ​​VS non dominanteG. 1 ml di terreno + trypanosomes prende tipicamente 6 - 7 min a fluire attraverso la colonna. </li><li> Lavare 2x con 1 ml di HMI-9 con siero raccogli flow-through nella stessa provetta come al punto 3.1. </li><li> Dividere flow-through (3 ml) in due provette da 1,5 ml microcentrifuga. NOTA: Questi possono essere combinati successivamente o mezzo possono essere utilizzati per isolare l&#39;RNA, etc. </li><li> Rimuovere colonna dal magnete. Aggiungere 3 ml di HMI-9 con il siero di colonna e immergersi colonna in un tubo da 15 ml centrifuga per ottenere cellule che esprimono la partenza, dominante VSG. Togliere 300 ml di materiale eluito per una successiva analisi. Conservare queste cellule in ghiaccio. </li><li> Per l&#39;uso come un segnale positivo e un controllo negativo, prendere circa 1 milione di cellule dalla cultura di partenza di cellule di controllo in crescita a 37 ° C (quelli che non prevede di cambiare frequentemente) e di pipetta in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. NOTA: cellule di controllo positive saranno colorate con l&#39;anticorpo fluoroforo marcato nel passaggio 4.1. Negativo cellule di controllo remanella macchia in tutto il resto del protocollo. </li><li> campioni Spin flow-through e campione di controllo degli anticorpi positivo a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante. NOTA: Un&#39;altra 300 microlitri aliquota di cellule eluite può essere usato come controllo positivo per anti-VSG colorazione. </li></ol> 4. La colorazione per identificare contaminanti e commutatori <ol><li> campioni flow-through Risospendere e cellule di controllo positivo in 100 ml di HMI-9 con siero + primaria,, anti-VSG anticorpi fluoroforo marcato alla diluizione appropriata. NOTA: L&#39;anticorpo anti-VSG marcato è fatta in casa ed utilizzato a una diluizione di 1: 1000. Il fluoroforo marcato, anti-VSG può essere dalla stessa fonte, come l&#39;anticorpo non marcato nella separazione MACS step.There dovrebbe essere di 3 ml di campione a flusso continuo in due provette da microcentrifuga seguenti step 3.5. </li><li> Per analizzare tutte le flow-through mediante citometria di flusso, unire il pellet in due provette da microcentrifuga mentre re-susin attesa dei campioni in 100 ml di HMI-9 con siero di anticorpi anti-+ VSG. Mescolare bene. </li><li> cellule Vortex in una camera fredda a 4 ° C per 10 min. Aggiungere 800 - 1.000 ml freddo HMI-9 con siero. campioni Spin a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante per rimuovere l&#39;anticorpo non legato. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml di HMI-9 con siero. campioni Spin a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante. Durante questo ultimo giro, spin down the-campioni eluiti dal punto 3.4 e il campione di controllo negativo. </li><li> Risospendere tutto il flusso-through e campioni eluiti in: 148,5 ml HMI-9 con siero, 25 microlitri conteggio sfere assoluto e 1,5 ml ioduro di propidio colorazione soluzione (175 ml in totale). Risospendere campioni di controllo degli anticorpi positivi e negativi in ​​175 ml HMI-9 con siero. Assicurarsi di registrare il numero di conteggio sfere assoluti / 25 ml per il lotto usati. </li><li> Eseguire tutti i campioni attraverso un citofluorimetro e raccogliere i dati. Le cellule morte macchiare come PI <sup&gt; +. Contaminanti macchia come PI - VSG +. Switcher macchia come PI - VSG - 8. </li><li> Calcola le frequenze con citometria a flusso di dati di commutazione. NOTA: Per le istruzioni su come calcolare frequenze di commutazione, si prega di fare riferimento al file supplementare <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">citometria a flusso Calculations.docx</a> e Tabella 1. </li></ol>

<ol><li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li>
<li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li>
<li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li>
<li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li>
<li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li>
<li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li>
<li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Rispetto alla tecnica sperimentale, il componente più critico del protocollo è mantenere tutti i campioni fredda. Trypanosomes molto rapidamente internalizzare anticorpo legato alla loro superficie 9, ma questo processo è motilità dipendente, e non influenzano il dosaggio finché le cellule sono mantenuti a 4 ° C. Tutti i campioni devono essere sempre tenuti in ghiaccio, e pipettaggio dovrebbero essere fatte rapidamente per ridurre al minimo l&#39;esposizione all&#39;ambiente C di laboratorio di 25 °. Freddo H...

Il protozoo parassita, Trypanosoma brucei, è un agente eziologico di malattie che colpiscono gli esseri umani (via Trypanosoma brucei gambiense e Trypanosoma brucei rhodesiense) e animali (via Trypanosoma brucei brucei) in tutta l&#39;Africa sub-sahariana. Si trasmette all&#39;host mammiferi attraverso la saliva del vettore mosca tsetse. Sia umane che animali africani tripanosomiasi causano un grave onere economico in regioni endemiche, e pochi farmaci sono disponibili o in fase di sviluppo per il trattamento di entrambe le malattie. La comprensione dei meccanismi di evasione immunitaria è fondamentale per lo sviluppo di farmaci per la tripanosomiasi. Variazione antigenica del denso, Variante di superficie glicoproteina (VSG) mantello che copre il parassita è uno dei mezzi principali con cui T. brucei elude la risposta anticorpale dei mammiferi. Esistono circa 2.000 varianti del gene VSG nel genoma tripanosoma, ma solo uno è trascritto in un dato momento da una delle ~ 15 expressiti di Sion. &#39;Commutazione&#39; del VSG espresso può avvenire sia con la copia di un gene VSG nel sito espressione attiva, o attraverso l&#39;attivazione trascrizionale di un sito espressione precedentemente silenziosa (rivisto in 1). Anche se molto lavoro è stato dedicato alla comprensione variazione antigenica in T. brucei, i fattori che influenzano la frequenza di commutazione sono ancora poco conosciuti. Gli studi finora sono stati ostacolati dal fatto che, mentre la commutazione avviene stocasticamente in vitro, frequenze di commutazione sono molto bassi, dell&#39;ordine di 1 a circa 10 6 cellule 2. Questo rende difficile misurare se un fattore dato aumenta o diminuisce la frequenza di commutazione, poiché commutazione è difficile da rilevare in primo luogo. Prima del 2009, i metodi per isolare switchers in una data popolazione sono stati lungo e laborioso. Questi passaging trypanosomes attraverso topi immunizzati contro il VSG dominante e quindi che raccolgono le cellule inclusiil giorno dopo 3 o contando centinaia di cellule mediante immunofluorescenza 4,5. Un&#39;altra strategia si basa sulla selezione per la resistenza ai farmaci per isolare switcher 6. Perché trypanosomes africani coltivate in vitro sono in genere costituiti da una grande popolazione che esprime una variante importante, e una popolazione molto più piccola di switcher che esprimono varianti alternative, si fa riferimento alla grande variante in questo documento come dominante, VSG partenza. Così facendo, abbiamo in nessun modo vogliamo implicare che questo importante variante ha una maggiore fitness di altre varianti nella popolazione. Qui si descrive un metodo che può attendibilmente misurare il numero di trypanosomes esprimere un VSG non dominante in una data popolazione in 3 - 4 ore. Questo metodo è particolarmente utile quando si vuole verificare se un dato manipolazione genetica o trattamento farmacologico aumenta il numero di celle commutate in una popolazione. Invece di liberare la popolazione di cellule che esprimono il faiminant, a partire VSG attraverso le droghe o con mezzi immunologici, queste cellule vengono eliminati dal primo rivestimento con sfere magnetiche accoppiate ad anticorpi contro il VSG dominante e poi isolandoli su una colonna magnetica. La popolazione commutata viene poi raccolto in flusso continuo e trattata ancora con un fluoroforo anticorpo marcato anti-VSG per identificare contaminanti. La quantificazione è ottenuta aggiungendo un numero definito di conteggio sfere assoluti ad ogni campione in modo che il rapporto di perline di cellule può essere determinato e utilizzato per quantificare il numero di commutatori nella popolazione 7.

<table><tbody><tr><td>anticorpo anti-VSG non marcato</td><td>n/a</td><td>n/a L'anticorpo</td><td>VSG è prodotto internamente</td></tr><tr><td>anticorpo anti-VSG marcato con fluoroforo</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>L'anticorpo VSG è prodotto internamente</td></tr><tr><td>Terreni HMI-9</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HMI-9 è prodotto internamente</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright perle di conteggio assoluto</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Colonne LD</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Magnete MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separatore magnetico MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>adattatore a vortice-60</td> Citometro <td>a flusso AM10014</td><td></td><td>scientifico</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Coulter</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>software di analisi per citometro a flusso</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di<em&gt; trypanosoma brucei</em&gt; switching variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare attivato ordinamento e citometria a flusso

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, un parassita protozoo che causa cicli di tripanosomiasi africana sia umana che animale (nota rispettivamente come malattia del sonno e nagana) tra un vettore tse-tse e un ospite mammifero. Elude il sistema immunitario dell'ospite dei mammiferi commutando periodicamente la glicoproteina di superficie densa e variante (VSG) che ricopre la sua superficie. Il rilevamento della variazione antigenica in Trypanosoma brucei può essere sia ingombrante che laborioso. Qui, presentiamo un metodo per quantificare il numero di parassiti che sono "passati" per esprimere un nuovo VSG in una data popolazione. I parassiti vengono prima colorati con un anticorpo contro il VSG iniziale e poi colorati con un anticorpo secondario attaccato a una perlina magnetica. I parassiti che esprimono il VSG iniziale vengono quindi separati dal resto della popolazione facendo scorrere i parassiti su una colonna attaccata a un magnete. I parassiti che esprimono il VSG iniziale dominante vengono trattenuti sulla colonna, mentre il flusso continuo contiene parassiti che esprimono un nuovo VSG e alcuni contaminanti che esprimono il VSG iniziale. Questa popolazione a flusso continuo viene nuovamente colorata con un anticorpo marcato in fluorescenza contro il VSG iniziale per marcare i contaminanti e lo ioduro di propidio (PI), che marcare le cellule morte. Alla popolazione a flusso continuo viene aggiunto un numero noto di microsfere di conteggio assoluto visibili mediante citometria a flusso. Il rapporto tra le perle e il numero di cellule raccolte può quindi essere utilizzato per estrapolare il numero di cellule nell'intero campione. La citometria a flusso viene utilizzata per quantificare la popolazione di switcher contando il numero di cellule PI negative che non si colorano positivamente per il VSG dominante iniziale. La percentuale di switcher nella popolazione può quindi essere calcolata utilizzando i dati della citometria a flusso.

Il metodo descritto qui è stato utilizzato per dimostrare che le interruzioni doppio filamento all&#39;interno del sito espressione VSG aumentato il numero di switchers in una popolazione 8. Qui, vi mostriamo i risultati rappresentativi di una popolazione di tripanosomi che sono stati indotti in modo simile per generare un doppio filamento Break presso il sito di espressione. Confrontiamo questi trypanosomes a quelli che non sono stati indotti a generare una pausa doppio filam...

I tripanosomi africani cresciuti in vitro subiscono variazioni antigeniche a un tasso basso, in modo tale che le popolazioni sono costituite da parassiti che esprimono una variante dominante di tipo glicoproteina di superficie (VSG) e una piccola popolazione di varianti "commutate". Questo protocollo descrive un metodo rapido per rilevare e quantificare queste popolazioni.

rilevamento di<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

L'obiettivo generale di questo metodo è isolare i tripanosomi che esprimono una particolare glicoproteina di superficie variabile o VSG dal resto della popolazione e identificare i parassiti che hanno effettuato un passaggio dalla VSG dominante iniziale a qualsiasi altra VSG. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia dei tripanosomi, ad esempio: quali sono i fattori o gli eventi che influenzano il passaggio della VSG in una popolazione di parassiti? Il principale vantaggio di questa tecnica è che è più rapida rispetto ai metodi pubblicati in precedenza e consente una facile quantificazione delle cellule che hanno effettuato il passaggio rispetto a quelle che non lo hanno effettuato.Quando il laboratorio ha iniziato a lavorare sulla variazione antigenica, il primo problema era come rilevare i rari cambiatori. Questo tipo di problema era stato effettivamente risolto in immunologia alcuni anni prima, attraverso l'uso del sorting cellulare attivato da campo magnetico per arricchire le cellule negative per un particolare carattere. Adattare questo processo di non-selezione alla variazione antigenica sembrava un'idea davvero promettente.Per iniziare, i tripanosomi della ceppa Lister 427 in fase ematica devono essere coltivati fino a una densità compresa tra 0,5 e 100.000 per millilitro. Aliquotare un campione di 50 × 10⁶ cellule in un tubo da 15 millilitri e quindi centrifugare. Conservare 1 × 10⁶ cellule e la coltura da utilizzare in seguito come controlli positivi e negativi per l'anticorpo.Aspirare la maggior parte del soprannatante lasciando circa 750 microlitri nel tubo. Trasferire le cellule in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri. Infine, centrifugare le cellule a quattro gradi Celsius per quattro minuti a 2800 ×g.Quindi, asportare con la pipetta tutto il sopranatante. Risospendere le cellule in 150 microlitri di mezzo di coltura, aggiungendo l'anticorpo primario anti glicoproteina di superficie variante o anti VSG al diluizione appropriata. Successivamente, vortexare le cellule a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Lavare con 800-1000 microlitri di mezzo di coltura freddo. Centrifugare le cellule a quattro gradi Celsius per quattro minuti a 5200 ×g. Dopo aver aspirato il soprannatante, lavare le cellule con un millilitro di mezzo di coltura e centrifugare nuovamente.Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 100 microlitri di mezzo di coltura. Aggiungere 110 microlitri di microsferette magnetiche per la selezione cellulare attivata da magneti del tipo appropriato per l'anticorpo primario. Mescolare accuratamente aspirando e dispensando con una pipetta, quindi vortexare.Mentre le cellule vengono sottoposte a vortex, preparare una colonna di separazione attivata magneticamente. Posizionare un tubo da 15 millilitri al di sotto per raccogliere il mezzo di condizionamento. Aggiungere due millilitri di mezzo di coltura per condizionare la colonna.Successivamente, rimuovere il campione dal vortice e aggiungere da 800 a 1000 microlitri di mezzo di coltura freddo. Centrifugare il campione e quindi rimuovere il soprannatante per eliminare l'anticorpo non legato. Lavare le cellule pellettizzate con un millilitro di mezzo di coltura e centrifugare nuovamente.In questa fase aspirare il soprannatante ma lasciare 100 microlitri nel tubo. Agitare vigorosamente il tubo da centrifuga finché il pellet non si risospende completamente. Aggiungere un millilitro di mezzo di coltura e pipettare su e giù per risospendere completamente le cellule.Rimuovere il tubo conico da 15 millimetri utilizzato per raccogliere il mezzo di condizionamento e sostituirlo con un nuovo tubo conico da 15 millilitri per raccogliere il flusso in uscita contenente i parassiti trasformati. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna condizionata. Raccogliere il flusso in uscita in un tubo da 15 millilitri posto al di sotto, operazione che richiede tipicamente da sei a sette minuti per un millilitro di mezzo più tripanosomi.Successivamente, lavare la colonna due volte con un millilitro di mezzo di coltura e raccogliere il flusso passante nel medesimo tubo. Dividere il flusso passante, che dovrebbe totalizzare circa tre millilitri, in due tubi microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, posizionare i tubi sul ghiaccio.Aggiungere tre millilitri di mezzo di coltura alla colonna e inserire la colonna in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Questo permetterà di ottenere le cellule che esprimono la VSG dominante iniziale. Prelevare 300 microlitri di questo materiale eluito e mantenerlo sul ghiaccio; il resto può essere scartato.Per creare un controllo positivo, prelevare circa 100.000 cellule dalla coltura iniziale e trasferirle con una pipetta in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitro. Ripetere l'operazione per creare un controllo negativo. Centrifugare i campioni del flusso passante e il campione di controllo positivo.E quindi rimuovere e scartare il soprannatante. Risospendere le cellule di controllo positivo in 100 microlitri di mezzo di coltura con l'anticorpo primario marcato con fluorocromo anti-VSG al diluizione appropriata. Successivamente, risospendere un pellet del flusso passante in 100 microlitri di mezzo di coltura con l'anticorpo primario marcato con fluorocromo anti-VSG alla diluizione appropriata.Utilizzare la sospensione per risospendere quindi il pellet nel secondo tubo di flusso, ottenendo un unico tubo di raccolta. Mescolare accuratamente aspirando e dispensando con la pipetta. Vortexare le cellule e poi aggiungere da 800 a 1000 microlitri di mezzo di coltura freddo.Centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius per quattro minuti a 5200 ×g, quindi eliminare il soprannatante per rimuovere qualsiasi anticorpo non legato. Lavare le cellule con un millilitro di mezzo di coltura, quindi centrifugare le cellule. I controlli positivi e negativi e le cellule eluite precedentemente conservate sul ghiaccio.Eliminare il soprannatante. Successivamente, aggiungere 148,5 microlitri di mezzo di coltura ai campioni. Poi, aggiungere 25 microlitri di perline per il conteggio assoluto, seguiti da 1,5 microlitri di soluzione colorante ioduro di propidio.Risospendere i pellet dei controlli positivo e negativo con 175 microlitri di mezzo di coltura. I campioni possono ora essere analizzati mediante citometria a flusso. Questi grafici di citometria a flusso mostrano i risultati della separazione cellulare da popolazioni di tripanosomi indotti a formare una rottura del doppio filamento del DNA rispetto a cellule non indotte.I pannelli a sinistra mostrano lo scatter in avanti rispetto allo scatter laterale, che permette di distinguere le cellule vive da quelle morte e dalle microsfere aggiunte al campione. Possono quindi essere create delle finestre (gates) che definiscono tali popolazioni in base alle caratteristiche di scattering. I pannelli a destra mostrano soltanto le cellule che possono essere classificate come vive in base alle finestre di scattering definite nei pannelli a sinistra.Il VSG iniziale dominante in questo caso era VSG due. Le cellule che si colorano positivamente per ioduro di propidio sono cellule morte. E queste si osservano nelle regioni Q uno e Q due del grafico.Le cellule che risultano positive alla colorazione per la VSG dominante e negative per il PI rientrano nel quadrante tre (Q3) e sono considerate contaminanti. Infine, le cellule nel quadrante quattro (Q4) sono cellule vitali che risultano negative alla colorazione per la VSG dominante e che vengono considerate switchers. Questo grafico mostra le frequenze di switching osservate e calcolate nelle popolazioni di tripanosomi con e senza rotture indotte.Il livello di commutazione stocastica in vitro è piuttosto basso. Sebbene l'induzione di una rottura porti a un numero significativamente maggiore di cellule che commutano al VSG non dominante. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre ore.durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere i campioni freddi per tutto il tempo e risospendere adeguatamente i pellet, in particolare prima dell'isolamento sulla colonna. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come il sequenziamento dell'RNA possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, ad esempio quali VSG vengono espressi in una popolazione in fase di commutazione. Sebbene questo metodo sia tipicamente usato per misurare il commutamento dei VSG, può anche essere impiegato per l'isolamento e la quantificazione di parassiti che esprimono qualsiasi proteina di superficie di interesse.

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Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

Un metodo per l'isolamento di aderenti leucociti infiammatori dai vasi sanguigni cerebrali...

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati

Gli invade parassita della malaria e replicati all'interno delle cellule rosse del sangue. La valutazione accurata di invasione merozoite e parassitemia è quindi fondamentale per la valutazione nel corso di infezione malarica. Qui si descrive un protocollo basato citometria a flusso per la misurazione di questi parametri in un modello murino di malaria.

In Vivo Valutazione del roditore Plasmodium parassitemia e merozoite Invasion di Citometria a flusso

Questo manoscritto descrive l'uso di un ceppo bioluminescente di tripanosomi africani per consentire il monitoraggio dell'infezione in fase avanzata e dimostra come l'imaging dal vivo in vivo possa essere utilizzato per visualizzare le infezioni all'interno del sistema nervoso centrale in tempo reale.

Bioluminescenza Imaging per rilevare fase avanzata di infezione di africani Tripanosomiasi

L'aggiunta di un tag a una proteina è un modo potente per ottenere informazioni sulla sua funzione. Qui, descriviamo un protocollo per marcare endogenamente centinaia di proteine di Trypanosoma brucei in parallelo in modo che sia possibile etichettare la scala del genoma.

High-throughput di Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

I virus o le vescicole extracellulari sono stati immunocatturati con nanoparticelle magnetiche da 15 nm accoppiate ad anticorpi che riconoscono gli antigeni di superficie. I virioni o le vescicole catturati sono stati marcati con anticorpi fluorescenti contro altri antigeni di superficie. I complessi risultanti sono stati separati in un campo magnetico elevato e analizzati con citometri a flusso convenzionali attivati a fluorescenza.

Flusso Virometry per analizzare antigenica spettri di virioni e extracellulare vescicole

Questo metodo di separazione Tripanosoma dal sangue dipende dalla loro carica superficiale essendo meno negativo rispetto a cellule del sangue dei mammiferi. Sangue infetto è collocato e trattati su una colonna di scambiatore di anioni. Questo metodo, più il montaggio diagnostico per la tripanosomiasi africana, fornisce parassiti purificati per indagini immunologiche, biologiche, biochimiche, farmaceutiche e biologia molecolare.

Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)

Fine Needle Aspiration è una tecnica, per cui le cellule sono ottenute da una lesione o un organo utilizzando un ago sottile. Il materiale aspirato viene spalmato, colorato ed esaminato al microscopio per la diagnosi o utilizzato per la biologia molecolare, la citometria o l'analisi in vitro. È economico, semplice, veloce e provoca un trauma minimo.

Rilevamento di parassiti di Trypanosoma Extravascolari da parte dell'aspirazione dell'ago fine

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire istruzioni su come misurare la capacità degli anticorpi presenti nella sera o nel plasma degli individui, naturalmente esposti all'infezione da Plasmodium falciparum, di opsonizzare e indurre la fagonitosi degli etriciti infettati da parassiti (IE).

Misurazione di anticorpi che inducono la fagonenza acquisita naturalmente ai parassiti Plasmodium falciparum mediante un'analisi basata sulla citometria del flusso

I parassiti del sangue medici in tutto il mondo sono stati sottoposti a screening automatico utilizzando semplici passaggi su una piattaforma di intelligenza artificiale low-code. La diagnosi prospettica dei film di sangue è stata migliorata utilizzando un metodo di rilevamento e classificazione degli oggetti in un modello ibrido di deep learning. La collaborazione tra il monitoraggio attivo e modelli ben addestrati aiuta a identificare i punti caldi di trasmissione del tripanosoma.

Identificazione automatica superiore dei parassiti del tripanosoma utilizzando un modello ibrido di deep learning

Descriviamo un metodo per studiare come il pH risponde ai segnali ambientali nei glicosomi della forma del flusso sanguigno dei tripanosomi africani. Questo approccio prevede l'utilizzo di un sensore di proteine ereditarie sensibile al pH in combinazione con la citometria a flusso per misurare la dinamica del pH, sia come saggio del corso temporale che in un formato di schermo ad alto rendimento.

Misurazione delle variazioni dinamiche del pH glisomiale nel Trypanosoma brucei vivente

Scopri come isolare Trypanosoma brucei che esprimono specifiche glicoproteine di superficie varianti (VSG) mediante ordinamento cellulare magnetico attivato e citometria a flusso. Questo metodo rapido permette di rilevare rari parassiti switcher e quantificare l'espressione VSG nelle popolazioni.

rilevamento di Trypanosoma brucei Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso (Video) | JoVE Journal

rilevamento di

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