Analisi delle proteine importazione in cloroplasti isolati da piante stressate
1 novembre 2016
Qui si descrive un nuovo metodo per studiare importazione delle proteine in cloroplasti isolati sotto stress. Il metodo è rapido e semplice, e può essere applicata per studiare le conseguenze delle diverse condizioni di stress per l'importazione proteine cloroplasto, ei corrispondenti meccanismi regolatori.
L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di studiare l'importazione di proteine codificate nel nucleo nei cloroplasti, con particolare attenzione agli effetti dello stress. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei cloroplasti, come ad esempio come viene regolata l'importazione delle proteine dei cloroplasti. Un vantaggio particolare di questa tecnica è che consente di valutare gli effetti dello stress sull'importazione delle proteine dei cloroplasti.
Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per l'uso con la pianta modello Arabidopsis thaliana, potrebbe essere modificato e adattato per l'uso con altri sistemi, come le piante coltivate. A dimostrare la procedura sarà Qihua Ling, un postdoc del mio laboratorio. Per iniziare, coltiva prima le piante di Arabidopsis come descritto nel protocollo di testo allegato.
Quindi, quando le piante hanno otto giorni, esegui un trattamento antistress. Raschiare delicatamente le piante dalla piastra di agar a mano e metterle in un pallone sterilizzato di terreno liquido MS contenente il fattore di stress. Potrebbe anche essere necessario posizionare altre piante in un pallone simile senza fattori di stress come controllo, a seconda della natura dell'esperimento.
Copri l'imboccatura dei palloni con un foglio sterilizzato e lascia che le piante crescano per altri due giorni su uno shaker orbitale con agitazione delicata. Preparare un gradiente di densità continuo mescolando prima 13 millilitri di Percoll, 13 millilitri di due tamponi di isolamento dei cloroplasti e cinque milligrammi di glutatione in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Quindi centrifugare il composto.
Dopo la centrifugazione, maneggiare la provetta con cura per evitare di disturbare il gradiente e tenerla sul ghiaccio per utilizzarla in seguito. Quindi, trasferire 100 millilitri di tampone di isolamento dei cloroplasti per condizione in un becher da un litro. Togliete le piantine dal liquido versandole in un setaccio.
Quindi trasferirli nel becher contenente il tampone di isolamento dei cloroplasti. Sciacquare il fazzoletto con il tampone per rimuovere qualsiasi mezzo residuo, quindi sostituire il tampone con 100 millilitri di tampone isolante fresco. Per il primo ciclo di omogeneizzazione, trasferire manualmente il tessuto vegetale in un becher da 50 millilitri, lasciando defluire il tampone precedente tra le dita.
Quindi posizionare la sonda dell'omogeneizzatore tissutale nel tessuto e omogeneizzare con due impulsi di uno o due secondi ciascuno. Filtrare l'omogeneizzato attraverso due strati di tessuto filtrante in una provetta da centrifuga da 250 millilitri. Terminare stringendo delicatamente il panno.
Trattenere il filtrato e trasferire nuovamente il tessuto vegetale nel becher da 50 millilitri. Quindi posizionare un secondo tampone di isolamento da 20 millilitri di cloroplasto nel becher da 50 millilitri e aggiungere il tessuto rimanente che non è stato utilizzato nel primo ciclo di omogeneizzazione. Ripetere le fasi di omogeneizzazione e filtrazione altre quattro volte.
Centrifugare l'omogeneizzato aggregato a 1.000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Versare il surnatante subito dopo la centrifugazione, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Posizionare il tubo sul ghiaccio e risospendere il pellet nel surnatante residuo agitando delicatamente il tubo.
Quindi, utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire delicatamente l'omogeneizzato sulla parte superiore del gradiente di densità continuo preconfezionato attraverso la parete del tubo ricevente. Quindi centrifugare il campione e il gradiente in un rotore a secchio oscillante a 7, 800 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius con il freno disattivato. Al termine, osservare le due bande verdi che si possono vedere nel gradiente.
Scartare la banda superiore, che contiene i cloroplasti rotti, e utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire la banda inferiore contenente i cloroplasti intatti in una provetta da centrifuga fresca da 50 millilitri. Quindi, aggiungere 25 millilitri di tampone HMS nella provetta e capovolgere la provetta due volte per lavare il Percoll dai cloroplasti. Quindi riposizionare il tubo nel rotore del secchio oscillante e ripellettare i cloroplasti.
Versare il surnatante e risospendere il pellet nel tampone residuo agitando delicatamente il tubo sul ghiaccio. Se necessario, aggiungere altri 100-300 microlitri di tampone HMS, ma cercare di non diluire troppo il campione. Conservare i cloroplasti risospesi in ghiaccio.
Inizia aggiungendo cinque microlitri di cloroplasti isolati a 495 microlitri di tampone HMS in un tubo da 1,5 millilitri. Capovolgere il tubo per mescolare delicatamente la soluzione. Quindi posizionare un vetro di copertura sopra la camera di conteggio di un ematocitometro.
Pipettare lentamente da 40 a 60 microlitri della sospensione di cloroplasti diluita nello spazio tra il vetro di copertura e la camera di conteggio. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase, è possibile visualizzare i cloroplasti con un obiettivo 20x. I cloroplasti intatti hanno un aspetto rotondo e luminoso e sono circondati da un alone di luce.
Quindi usa l'obiettivo 10x per il numero di cloroplasti in 10 grandi quadrati. Il numero di cloroplasti per quadrato grande dovrebbe essere in media compreso tra 10 e 30. Se sono presenti troppo pochi o troppi cloroplasti, regolare il fattore di diluizione e ripetere la procedura.
Una volta all'interno dell'intervallo corretto, calcolare il numero di cloroplasti per millilitro come descritto nel protocollo di testo allegato. Per eseguire un percorso cronometrato con tre punti temporali, preparare tre provette, ciascuna contenente un'aliquota di 130 microlitri di tampone di arresto dell'importazione, e lasciarle in ghiaccio. In una provetta da due millilitri, preparare la reazione di importazione contenente il tampone di reazione e la proteina precursore radiomarcata.
Si noti che dovrebbe esserci una reazione per ogni condizione da testare. Utilizzare circa 10 milioni di cloroplasti per punto temporale. Incubare la provetta di reazione a 25 gradi Celsius a bagnomaria con una quantità limitata di luce.
Di tanto in tanto muovi i tubi per risospendere i cloroplasti. Condurre un andamento temporale, con aliquote di 130 millilitri dalla reazione nei punti temporali richiesti all'interno dell'intervallo lineare di importazione. Immediatamente dopo il prelievo, trasferire ogni aliquota da 130 microlitri in un tubo di tampone di arresto dell'importazione ghiacciato miscelato picchiettando delicatamente il tubo e posizionare i tubi sul ghiaccio fino al completamento del ciclo di tempo.
Una volta rimosso l'ultimo campione, centrifugare tutti i campioni per 30 secondi a 12.000 volte g in una microfuga. Successivamente, scartare i surnatanti e risospendere i pellet in 15 microlitri di due tamponi di caricamento delle proteine. Quindi mescolare i campioni mediante vortex.
Infine, analizza tutti i campioni, oltre a un controllo di input del precursore, utilizzando SDS-PAGE standard e autoradiografia, fluorografia o fosforimaging. PsaD è un componente del fotosistema I di 18 kilodalton che viene sintetizzato come un precursore più grande di 23 kilodalton. La lavorazione nella forma matura da 18 kilodalton indica che è avvenuta l'importazione nei cloroplasti.
Il mutante sp1 di Arabidopsis qui studiato porta un difetto in un importante regolatore del meccanismo di importazione della proteina dei cloroplasti, la proteina sp1. In condizioni di stress, la quantità di proteina PsaD importata nei cloroplasti mutanti sp1 è aumentata rispetto al tipo selvatico, ma non in condizioni normali non stressanti. Mentre la forma proteica matura di PsaD si è accumulata in modo dipendente dal tempo con i cloroplasti di entrambi i genotipi vegetali, il tasso di importazione era significativamente più alto per i cloroplasti mutanti sp1 rispetto ai cloroplasti wild type.
Questi risultati implicano un ruolo importante per la proteina sp1 nella regolazione dell'importazione della proteina dei cloroplasti in condizioni di stress. Una volta padroneggiato, questo metodo, dall'isolamento dei cloroplasti fino al completamento del test di importazione, può essere completato in cinque o sei ore se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire tutte le fasi di isolamento dei cloroplasti a quattro gradi Celsius per garantire che i cloroplasti mantengano la massima attività.
Dopo il suo sviluppo iniziale diversi decenni fa, il saggio in vitro per l'importazione delle proteine dei cloroplasti ha aperto la strada ai ricercatori del settore per esplorare molti aspetti diversi del meccanismo di importazione delle proteine dei cloroplasti. Il perfezionamento qui presentato consente di studiare gli effetti delle condizioni di stress sull'importazione di proteine. Non dimenticare che lavorare con materiale radioattivo richiede un'attenzione particolare.
Precauzioni come indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.
Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo per lo studio dell'importazione di proteine nei cloroplasti isolati, in particolare in condizioni di stress. La tecnica è stata progettata per essere rapida e semplice, consentendo ai ricercatori di indagare i meccanismi regolatori coinvolti nell'importazione di proteine nei cloroplasti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle Piante
- Funzione del Cloroplasto
- Fisiologia dello Stress
Sfondo
- I cloroplasti sono essenziali per la fotosintesi e i processi metabolici nelle piante.
- Comprendere l'importazione delle proteine nei cloroplasti è fondamentale per chiarire il loro funzionamento in condizioni di stress.
- Le condizioni di stress possono influenzare in modo significativo i meccanismi di importazione proteica nei cloroplasti.
- Questo metodo è stato sviluppato utilizzando Arabidopsis thaliana, ma può essere adattato ad altri sistemi vegetali.
Scopo dello studio
- Studiare come lo stress influisca sull'importazione di proteine codificate dal nucleo nei cloroplasti.
- Esplorare i meccanismi regolatori che controllano l'importazione di proteine nei cloroplasti.
- Fornire una metodologia affidabile per future ricerche in biologia dei cloroplasti.
Metodi Utilizzati
- Coltivazione di piante di Arabidopsis seguita da trattamento di stress.
- Preparazione di cloroplasti mediante un gradiente di densità continuo.
- Omogeneizzazione e filtrazione del tessuto vegetale per isolare i cloroplasti.
- Esperimenti su corso temporale per valutare l'importazione di proteine nei cloroplasti.
Risultati principali
- Il metodo consente la valutazione dell'importazione di proteine nei cloroplasti in diverse condizioni di stress.
- I cloroplasti possono essere isolati in modo efficace, mantenendo la loro integrità per ulteriori analisi.
- I risultati dimostrano l'impatto dello stress sull'efficienza dell'importazione delle proteine.
- Questa tecnica può essere utilizzata per diverse specie vegetali oltre ad Arabidopsis.
Conclusioni
- Il nuovo metodo fornisce informazioni sugli effetti dello stress sulla funzione dei cloroplasti.
- Offre uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano la biologia dei cloroplasti e le risposte allo stress.
- Studi futuri potranno basarsi su questa metodologia per esplorare ulteriori meccanismi regolatori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere come lo stress abiotico regola l'importazione delle proteine nei cloroplasti fornisce informazioni meccanicistiche sulla resistenza delle piante allo stress, un fattore chiave per la stabilità della resa delle colture in condizioni di campo. Questo metodo consente una valutazione rapida del traffico di proteine codificate dal nucleo verso i cloroplasti, supportando la validazione degli obiettivi nei sistemi di bioproduzione a base vegetale. Quantificando le velocità di importazione in condizioni di stress controllate, i ricercatori possono ridurre i rischi associati alle ipotesi riguardanti vie di segnalazione dello stress specifiche per gli organelli, rilevanti per la biotecnologia agricola.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche collegando le variazioni indotte dallo stress nell'importazione di proteine nei cloroplasti a mutanti regolatori come sp1.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale dei transloconi dell'involucro cloroplastidiale come bersagli farmacologici sensibili allo stress nell'ingegneria metabolica vegetale.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli identificando genotipi con cinetiche alterate di importazione delle proteine in condizioni di stress osmotico o da salinità.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Fornisce cloroplasti isolati e integri, adatti per saggi di importazione standardizzati che utilizzano proteine precursore marcate radioattivamente.
- Output quantitativo: Genera dati in funzione del tempo che permettono il confronto delle velocità di importazione tra diversi genotipi e condizioni di stress.
- Scalabilità: Utilizza la centrifugazione in gradiente di densità per isolare cloroplasti da colture liquide, adattabile a formati ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Collega il malfunzionamento dell'importazione delle proteine nei cloroplasti ai fenotipi da stress abiotico, fornendo indicazioni per approcci transgenici volti a coltivare piante resistenti allo stress.
- Continuità traslazionale: Collega i saggi di importazione nella fase di scoperta alla validazione preclinica di caratteristiche di protezione dallo stress in modelli vegetali.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce se i fenotipi da stress osservati derivino da un'alterata importazione delle proteine piuttosto che da effetti metabolici secondari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel flusso di lavoro della biologia della scoperta, posizionando l'isolamento dei cloroplasti e i saggi di importazione a monte dell'identificazione dei composti promettenti nelle linee guida di biologia sintetica vegetale.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi sulla regolazione dello stress nell'importazione proteica misurando l'elaborazione dei precursori (ad esempio, la maturazione di PsaD) come lettura funzionale.
- Screening: Produce preparazioni riproducibili di cloroplasti che permettono una valutazione quantitativa della cinetica di importazione in diversi contesti genetici.
- Analisi: Utilizza elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di SDS e autoradiografia per quantificare l'elaborazione proteica dipendente dall'importazione, supportando l'analisi comparativa tra condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati del saggio di importazione a fenotipi di tolleranza allo stress, fornendo indicazioni per le decisioni di avanzamento nei percorsi di sviluppo di caratteristiche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato di isolamento dei cloroplasti applicabile in diverse condizioni di stress e specie vegetali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo collegando la funzione della proteina sp1 alla regolazione specifica dello stress nell'importazione.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso l'isolamento standardizzato dei cloroplasti e la verifica dell'integrità mediante microscopia.
- Valore strategico: Riduce il rischio di fallimento in fasi avanzate mediante la riduzione precoce dei rischi associati ai meccanismi di risposta allo stress nell'ingegneria dei cloroplasti.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli genetici in base al rischio calibrato, sulla base di fenotipi di importazione proteica modulati dallo stress.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella frazionamento delle cellule vegetali, nella manipolazione di isotopi radioattivi e nella valutazione dell'integrità dei cloroplasti.
- È dipendente da centrifughe con rotore oscillante, emocitometri e fosforimager per la quantificazione.
- Necessita della preparazione standardizzata di tampone per l'isolamento dei cloroplasti e di tampone HMS in laboratori diversi.
- Deve tenere conto della variabilità nel rendimento e nell'integrità dei cloroplasti quando si effettuano confronti tra diverse condizioni di stress o genotipi.
- È limitato dalla necessità di utilizzare proteine precursori radioattive, richiedendo protocolli di sicurezza specializzati e procedure di smaltimento dei rifiuti.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Growth of Arabidopsis Plants and the Stress Treatment
1:34
Chloroplast Isolation
5:06
Analysis of the Yield and the Intactness of Chloroplasts
6:19
Chloroplast Protein Import
8:04
Results: Chloroplast Import of the PsaD Protein Is Elevated in the sp1 Mutant under Stress Conditions
9:12
Conclusion
