Name: Analisi delle proteine importazione in cloroplasti isolati da piante stressate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Scopri l'importazione di proteine nei cloroplasti isolati da piante stressate di Arabidopsis thaliana. Questo metodo rapido permette di studiare i meccanismi di regolazione sotto stress ambientale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di PJ dalla Biotecnologia e Scienze Biologiche Research Council (BBSRC; concedere rif BB / K018442 / 1.).

1. La crescita di piante di Arabidopsis e il trattamento dello stress <ol><li> Preparare 1 L di Murashige e Skoog (MS) aggiungendo 4,3 g di MS Basal Salt miscela, 10 g di saccarosio, 0,5 g 2- (N-morfolino) etano solfonico (MES) in acqua deionizzata fino a 1 L e regolare il pH a 5,7 con idrossido di potassio (KOH). Aggiungere 6 g di phytoagar e autoclave per 20 min a 120 ° C. <ol><li> Prima di solidificazione, versare il terreno in piastre di Petri rotonde (diametro 9 cm, altezza 1,5 cm, con 20 - 25 mL MS medio per piastra). Lasciare le piastre ad asciugare per ~ 1 h in una cappa a flusso laminare prima di chiudere le palpebre. </li></ol></li><li> Posizionare semi Arabidopsis thaliana in un mL provetta 1.5 per sterilizzazione superficiale aggiungendo 1 ml di 70% (v / v) etanolo contenente 0,02% (v / v) Triton X-100 e continuamente agitazione per 5-10 min. Per ciascun genotipo / condizione, preparare 10 piatti di Petri ogni trasportano ~ 100 - 150 piantine. </li><li> Attendere circa 10 s fino a quando i semi si depositano alfondo del tubo, e quindi scartare il surnatante pipettando. Aggiungere 1 ml di etanolo al 100%, e agitare nuovamente il tubo per 10 min. </li><li> Preparare la cappa a flusso laminare, mentre i semi sono sterilizzando. Prendete un pezzo di carta da filtro per campione, piegarlo a metà per facilitare la semina, e immergerlo in 100% di etanolo nella cappa. Attendere che si asciughi completamente. Si noti che l&#39;etanolo 100% è usato come evapora più velocemente del 70% di etanolo. </li><li> Trasferire i semi sulla carta da filtro pipettando utilizzando un 1 ml punta della pipetta taglio ~ 5 mm dalla fine fine. Lasciarli asciugare, che dovrebbe prendere circa 10 - 15 min. </li><li> Seminare ~ 100 - 150 semi sterilizzati in modo uniforme su ogni piatto MS medio Petri, e sigillare ogni piatto con del nastro adesivo chirurgico. </li><li> Conservare le piastre a testa in giù a 4 ° C per 2 - 4 d incoraggiare e sincronizzare la germinazione. I vecchi semi possono avere bisogno di rimanere più a lungo (fino ad una settimana) a 4 ° C. </li><li> Trasferire le piastre di una camera di coltura di tessuti vegetali e lasciarli a testa in su.Far crescere le piante per 8 d nell&#39;ambito di un ciclo di lunga giornata (16 h 100 micromol · m - 2 · s - 1 luce, 8 h scuro) a 20 ° C. </li><li> Per il trattamento di stress, quando le piante sono 8 d vecchia, nella cappa a flusso, trasferirli dal mezzo agar, da loro raschiando delicatamente a mano indossando guanti di etanolo-sterilizzati, in un pallone sterilizzato del mezzo MS liquido contenente il fattore di stress (ad esempio, 200 mm mannitolo). Evitare di portare su agar. Coprire bocca pallone in un foglio sterilizzato e consentono alle piante di crescere nelle stesse condizioni come al punto 1.8 per ulteriori 2 d su agitatore orbitale con agitazione delicata (~ 100 rpm). </li></ol> 2. Fare un proteina precursore in vitro Trascrizione / Traduzione Nota: Questo protocollo assume l&#39;uso di Arabidopsis fotosistema I subunità D precursore (pPsaD) come modello / preproteina, ma il metodo è compatibile con gli altri. <ol&gt; <li> Clonare la sequenza codificante (CDS) del pPsaD nel sito di clonaggio multiplo (MCS) del vettore pBlueScript II SK (o qualsiasi altro vettore simile con un promotore T7 upstream) 13. Purificare il plasmide (pBSK-pPsaD) utilizzando un kit di isolamento del DNA e verificare la sequenza dal sequenziamento del DNA. NOTA: Tutte queste operazioni impiegano tecniche standard di clonazione molecolare. </li><li> Determinare la concentrazione plasmide DNA pBSK-pPsaD utilizzando uno spettrofotometro impostato per misurare l&#39;assorbanza a 260 nm. Diluire il plasmide ad una concentrazione finale di 10 ng / ml. </li><li> Eseguire un 20 microlitri PCR (per 35 cicli) utilizzando il plasmide diluito come modello. Preparare la reazione nel modo seguente: 2 ml di buffer 10 × polimerasi, 2 microlitri 2 mM dNTP, 1 ml 5 mM M13 Forward Primer (5&#39;-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 &#39;), 1 ml 5 mM M13 primer reverse (5 &#39;-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3&#39;), 1 ml diluito pBSK-pPsaD plasmide, 1 U Taq polimerasi, e acqua distillata per rendere il volume totale di reazione fino a20 ml. Utilizzare un programma PCR standard, come segue: 95 ° C, 5 min; 35 cicli di [95 ° C, 30 sec; 56 ° C, 30 sec; 72 ° C, 30 sec); e 72 ° C, 5 min. </li><li> Eseguire 5 microlitri del prodotto di PCR su un 1% (w / v) gel di agarosio in TAE tampone (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM di acido acetico, 1 mM EDTA) per verificare la corretta amplificazione del cDNA, e quantificare il relativo banda rispetto agli standard per confermare la concentrazione. Conservare il resto del prodotto a -20 ° C per ulteriori applicazioni. </li><li> Preparare una reazione di 50 microlitri utilizzando un sistema di reticolociti di coniglio lisato base privo di cellule di trascrizione / traduzione compatibile con PCR DNA, come segue: 40 microlitri lisato di reticolociti dal sistema di trascrizione / traduzione, 2,5 microlitri radiomarcato [35 S] metionina, 11 pCi / mL (attività specifica:&gt; 1.000 Ci / mmol), acqua distillata 2,5 ml sterili, e 5 ml di prodotto pPsaD PCR (100-800 ng). Attenzione: Indossare guanti, indumenti di laboratorio e vetro di sicurezzases durante la manipolazione di materiale radioattivo. Monitorare e decontaminare la superficie di lavoro e le attrezzature. Smaltire tutti i rifiuti radioattivi in ​​un contenitore per rifiuti approvato. </li><li> Incubare la reazione per 90 min in un bagno d&#39;acqua a 30 ° C. Arrestare la reazione ponendo il campione sul ghiaccio. </li><li> Rimuovere 1 ml della reazione come campione di prova (lo stesso volume può anche servire come un controllo di input per step 5.7) per la verifica su gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide standard (SDS-PAGE) seguita da autoradiografia, fluorography o l&#39;imaging fosforo. Un buon risultato è indicato dalla osservazione di una banda distinta e forte corrispondente al peso molecolare di pPsaD (~ 23 kD). Conservare il resto della reazione a -80 ° C per ulteriori applicazioni. </li></ol> 3. Isolamento Cloroplasto <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni madre: <ol><li> Preparare isolamento Cloroplasto Buffer (CIB, 2x): 0.6 M sorbitolo, 10 mM cloruro di magnesio(MgCl 2), 10 mM glicole etilenico tetraacetico (EGTA), 10 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 20 mM di bicarbonato di sodio (NaHCO 3), 40 mm 4- (2-idrossietil) piperazina-1-etansolfonico acido (HEPES) ; regolare a pH 8,0 con KOH. Preparare 2 L di 2x CIB, fare aliquote e tenerli a -20 ° C per una conservazione a lungo termine, o a 4 ° C per una conservazione a breve termine. Per rendere 1x CIB, diluire il 2x CIB 1: 1 con acqua distillata; questo può essere preparato fresco il giorno dell&#39;esperimento isolamento cloroplasto. </li><li> Preparare HEPES-MgSO 4 -Sorbitolo tampone (HMS, 1x): 50 mm HEPES, 3 mM solfato di magnesio (MgSO 4), 0,3 M sorbitolo; regolare a pH 8,0 con idrossido di sodio (NaOH). Preparare 400 ml di tampone, rendere aliquote e tenerli a -20 ° C per una conservazione a lungo termine, o a 4 ° C per una conservazione a breve termine. </li></ol></li><li> Effettuare tutte le seguenti procedure nella cella o su ghiaccio. Preraffreddare tutte le soluzioni, dispositivi, attrezzature, e rotori prima starting. </li><li> Preparare un gradiente di densità continua miscelando 13 ml di Percoll, 13 mL 2x CIB buffer e 5 mg di glutatione in una provetta da centrifuga 50, e centrifugando la miscela a 43.000 xg per 30 min (freno off) a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, gestire il tubo con cura per evitare di disturbare il gradiente e tenerlo in ghiaccio per un uso successivo. </li><li> Trasferire 100 ml di 1x CIB per il genotipo / condizione a un 1 L bicchiere. <ol><li> Rimuovere le piantine dal mezzo liquido da loro ribaltamento in un setaccio, e trasferirli in un altro bicchiere CIB contenenti; poi, risciacquare il tessuto con il CIB per rimuovere liquido residuo prima di sostituirla con 100 mL di CIB fresco. </li></ol></li><li> Per omogeneizzazione, usare un totale di 100 ml di 1x CIB per campione in cinque turni consecutivi di omogeneizzazione, ogni turno usando 20 mL di CIB fresche presenti in un bicchiere da 50 ml. <ol><li> Per il primo turno di omogeneizzazione, trasferire il tessuto vegetale nel beaker da 50 ml a mano, consentendo laPrecedente buffer di detenzione di defluire attraverso le dita. Provate ad utilizzare la maggior parte del tessuto al primo turno, ma assicurarsi che sia immerso con tampone; se ciò non è possibile, introdurre il tessuto non utilizzato residuo al secondo turno. </li></ol></li><li> Posizionare sonda del omogeneizzatore tessuto nel tessuto e omogeneizzare con due impulsi di 1 - 2 s ciascuna. Filtrare l&#39;omogeneizzato attraverso due strati di tessuto di filtrazione in un 250 mL provetta delicatamente spremitura. Conservare il filtrato, e trasferire il tessuto indietro al ml bicchiere da 50. </li><li> Posizionare un secondo 20 ml CIB aliquota in ml bicchiere 50, l&#39;aggiunta di qualsiasi tessuto rimanente non utilizzato nel primo turno di omogeneizzazione, e ripetere la procedura di omogeneizzazione e filtrazione. Quindi, ripetere i punti 3.5 e 3.6 fino a quando tutti i 100 ml di CIB è stata utilizzata (ad esempio, 5 aliquote di 20 ml), e combinare i filtrati risultanti. </li><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato pool a 1.000 g per 5 min (freno) a 4 ° C, e versare offil surnatante immediatamente dopo il completamento della centrifugazione, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere il pellet nel surnatante residua nella provetta agitando delicatamente la provetta in ghiaccio. Non risospendere vigorosamente pipettando o vortex. </li><li> trasferire delicatamente l&#39;omogeneizzato sulla parte superiore del gradiente di densità continua premade, usando una pipetta Pasteur per applicarlo attraverso la parete del tubo ricevente. Evitare di disturbare il gradiente. Centrifugare in un rotore oscillante secchio a 7.800 xg per 10 min (freno off) a 4 ° C. NOTA: Due bande verdi possono essere visti nel gradiente dopo la centrifugazione: la banda inferiore contiene cloroplasti intatti, e la banda superiore contiene cloroplasti rotti. </li><li> Eliminare la banda superiore pipettando, e poi trasferire la banda inferiore con una pipetta Pasteur in un fresco 50 mL provetta da centrifuga, mantenendo un volume di fino a 8 ml per gradiente. </li><li> Aggiungi ~ 25 ml di 1x HMS tampone nel tubo e capovolgere il tubo per due volte to lavare il Percoll dai cloroplasti. Riposizionare il tubo nel rotore oscillante-benna e centrifugare a 1000 g per 5 min (freno) a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet con cura dei cloroplasti nelle HMS residua nel tubo agitando delicatamente la provetta in ghiaccio. Aggiungere ulteriori 100 - 300 ml di HMS se necessario (in base alle dimensioni del pellet e il conteggio nella sezione 4), ma cercate di non diluire il campione troppo. <ol><li> Mantenere i cloroplasti sul ghiaccio. Ogni volta prima che i cloroplasti sono utilizzati per applicazioni a valle, agitare il tubo per sospendere di nuovo loro. Usare sempre un puntale di taglio (con pori allargata) per trasferire i cloroplasti. </li></ol></li></ol> 4. Analisi del rendimento e integrità dei cloroplasti <ol><li> Aggiungere 5 ml di cloroplasti isolati a 495 microlitri di buffer di 1x HMS in una provetta da 1,5 ml, e poi mescolare delicatamente invertendo il tubo per ottenere una diluizione 1: 100. </li><li> PlaCe un vetro di copertura sulla sommità della camera di conteggio del dell&#39;emocitometro. Lentamente pipetta ~ 40 - 60 microlitri della sospensione cloroplasto diluita nella fessura tra il vetro di copertura e la camera di conteggio. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 10X o 20X, cloroplasti intatte aspetto rotondo e luminose e sono circondate da un alone di luce. NOTA: Sotto il microscopio, vi è un&#39;area di 1 mm 2 conteggio con 25 grandi piazze, ciascuno contenente 16 piccoli piazze del centro della camera di conteggio. </li><li> Contare il numero di cloroplasti in 10 grandi piazze. Il numero di cloroplasti per piazzale dovrebbe media tra il 10 e il 30. Se troppo pochi o troppi cloroplasti sono presenti, regolare il fattore di diluizione (al punto 4.1) di conseguenza, e ripetere la procedura. </li><li> Calcolare il numero di cloroplasti per ml (concentrazione) come segue: n (il numero medio di cloroplasti per piazzale calcolata al punto 4.3) × 25 (numero totale di grandi piazze) × 100 (il fattore di diluizione) × 10 4 (fattore di scala per esprimere i dati per 1 ml, in quanto il volume di sopra dei 25 quadrati è di 0,1 mm 3). </li><li> Calcolare la resa effettiva dei cloroplasti moltiplicando la concentrazione del volume di sospensione cloroplasto ottenuta nello stadio 3.12. Normalmente, più di 50 × 10 6 cloroplasti possono essere ottenuti. </li></ol> 5. Cloroplasto proteine ​​Import <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni madre: <ol><li> Preparare 10x HMS buffer: 500 mm HEPES, 30 mM MgSO 4 e 3.0 M sorbitolo; regolare a pH 8,0 con NaOH. Preparare 50 ml di questo buffer, aliquota, e conservare a -20 ° C per una conservazione a lungo termine e a 4 ° C per una conservazione a breve termine. </li><li> Preparare Importa buffer di arresto: 50 mm EDTA sciolto in 1x HMS buffer. Preparare 50 ml di questo buffer, aliquota, e conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare 2x tampone proteico caricamento: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) glicerolo, 2% (w/ V) di SDS, 0,005% (w / v) di bromofenolo blu. Fare 50 ml, e conservare a 4 ° C. Appena prima dell&#39;uso, aggiungere 100 ml di 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT) a 900 ml di tampone. </li></ol></li><li> Per eseguire una volta portate con 3 punti temporali, preparare 3 tubetti contenenti ciascuno una un&#39;aliquota 130 ml di tampone arresto di importazione, e lasciarli sul ghiaccio. Preparare una reazione di importazione 450 microlitri in un tubo di 2 ml (per genotipo / condizione). Scongelare tutti gli ingredienti appena prima dell&#39;uso. <ol><li> Per una reazione di importazione, di solito utilizzare 10 × 10 6 cloroplasti in un volume microlitri; per esempio, se la concentrazione cloroplasto è 2,5 × 10 8 / mL, utilizzare 40 microlitri di sospensione cloroplasto. Tre punti temporali avranno bisogno di 3 × A microlitri (ad esempio, 120 ml nel nostro esempio). </li><li> Miscelare i componenti reazioni sul ghiaccio nel seguente ordine: acqua distillata (per rendere il volume totale di 600 microlitri), B microlitri 10x HMS tampone (dove B = [600-3 × A] / 10, cioè 48 nel nostro esempio), 12 microlitri1 M di acido gluconico (sale di potassio), 6 ml 1 M NaHCO 3, 6 microlitri 20% (w / v) BSA, 30 microlitri 100 mM adenosina 5&#39;-trifosfato sale di magnesio (MgATP), 24 microlitri 250 mM metionina (non radiomarcato ), e 30 microlitri proteina precursore. Immediatamente prima di iniziare la reazione di importazione, aggiungere 3 × Un ml di cloroplasti e mescolare picchiettando delicatamente il tubo. </li></ol></li><li> Incubare la provetta di reazione a 25 ° C in un bagno di acqua sotto 100 mmol · m - 2 · s - 1 luce. Di tanto in tanto sfogliare i tubi per risospendere cloroplasti. </li><li> Per condurre un time-corso, ritirare 130 aliquote microlitri dalla reazione al time-punti richiesti entro il campo lineare di importazione, che per pPsaD è fino a ~ 12 min (4, 8 e 12 min di tempo sono adatti in questo caso). Il periodo di gamma lineare può variare per diverse proteine 14. Pertanto, si suggerisce di verifica di ogni singolo preproteina prima di ottimizzare tlui punti di tempo. </li><li> Subito dopo il ritiro, trasferire ogni aliquota 130 ml ad un tubo di tampone arresto importazione ghiacciata, Mescolare agitando leggermente il tubo, e mantenere tutti i tubi in ghiaccio fino al momento-corso è stato completato. </li><li> Centrifuga tutti i campioni per 30 s a 12.000 × g in una microcentrifuga, scartare il surnatante pipettando, e pellet risospendere in 15 ml di 2x tampone proteico di carico con il vortex. </li><li> Analizzare tutti i campioni, più il controllo di input pPsaD (contenente pPsaD pari al 10% dell&#39;importo aggiunto per ogni reazione di importazione, dal punto 2.7) secondo le norme SDS-PAGE e autoradiografia, fluorography o immagini fosforo 15. Utilizzare immagine software di analisi per quantificare e analizzare i risultati. Per fornire un&#39;indicazione dell&#39;efficienza importazione, la quantità di proteina importato in differenti genotipi / condizioni può essere valutata misurando la radioattività associata con ciascuna banda maturo. </li></ol>

<ol><li>Jarvis, P., Lòpez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+regulation+of+photosynthetic+and+related+metabolism+under+environmental+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses.</a> Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Chua, N. H., Schmidt, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis%2C+transport%2C+and+assembly+of+ribulose+1%2C5-bisphosphate+carboxylase+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits.</a> Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).</li>
<li>Highfield, P. E., Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+transport+of+the+small+subunit+of+chloroplast+ribulose+bisphosphate+carboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase.</a> Nature. 271, 420-424 (1978).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Froehlich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Arabidopsis+envelope+protein+localization+and+topology+using+thermolysin+and+trypsin+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases.</a> Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).</li>
<li>Flores-Pérez, Ú, Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+suborganellar+fractionation+of+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts.</a> Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).</li>
<li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+ppi1+mutant+is+specifically+defective+in+the+expression+chloroplast+import%2C+and+accumulation+of+photosynthetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins.</a> Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).</li>
<li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+amongst+the+Arabidopsis+Toc159+family+of+chloroplast+protein+import+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors.</a> Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).</li>
<li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+binding+and+dimerization+at+the+chloroplast+pre-protein+import+receptor%2C+atToc33%2C+are+not+essential+in+vivo+but+do+increase+import+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency.</a> Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).</li>
<li>Huang, W., Ling, Q., Bédard, J., Lilley, K., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analyses+of+the+roles+of+essential+Omp85-related+proteins+in+the+chloroplast+outer+envelope+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane.</a> Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual.+Second+edn%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn</a>. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monogalactosyldiacylglycerol+deficiency+in+Arabidopsis+thaliana+affects+pigment+composition+in+the+prolamellar+body+and+impairs+thylakoid+membrane+energization+and+photoprotection+in+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves.</a> Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+Arabidopsis+chloroplasts+and+their+use+for+in+vitro+protein+import+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays.</a> Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).</li>
<li>Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+plants+lacking+the+PSI-D+subunit+of+photosystem+I+suffer+severe+photoinhibition%2C+have+unstable+photosystem+I+complexes%2C+and+altered+redox+homeostasis+in+the+chloroplast+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma.</a> J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).</li>
<li>Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preparation+of+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants.</a> Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).</li>
<li>Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+the+role+of+atTic20+in+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts.</a> Plant Cell. 14, 641-654 (2002).</li>
<li>Miras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+transit+peptide+for+import+into+the+chloroplast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast.</a> J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).</li>
<li>Nada, A., Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+envelope+protein+32+is+imported+into+chloroplasts+by+a+novel+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway.</a> J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo recentemente dimostrato che l&#39;importazione di proteine cloroplasto può essere regolata attivamente da stress, che è fondamentale per la funzione cloroplasto e impianto di sopravvivenza a 3. In questo studio, per monitorare tale regolamentazione, abbiamo modificato il nostro isolamento cloroplasto e nelle procedure di test in vitro di importazione al fine di consentire di accertare la capacità di importazione di piante coltivate in condizioni di stress. I risultati hanno indicato un ruolo importante per il SP1 nel cloroplasto regolamento importazione delle proteine. Convenzionali in vitro di importazione utilizzano piante coltivate su MS standard di agar medio 6,17,18. Nel caso del mutante sp1 qui descritto, tali dosaggi convenzionali non hanno evidenziato differenze nella proteina importazione relative al WT 3. Tuttavia, il ruolo di SP1 nella regolazione importazione delle proteine si rivela chiaramente quando importazione proteina viene valutata in condizioni di stress utilizzando i metodi descritti di seguito (Figura 1). Mentre may non essere possibile confrontare direttamente importare dati dal saggio condizioni di stress con quelli ottenuti da test convenzionali (come i metodi impiegano piante coltivate in coltura liquida e su agar, rispettivamente), i confronti tra le condizioni di stress e non stress sono fattibili a condizione che le piante sono cresciuti nello stesso terreno di coltura liquido, con o senza stress. Rispetto al trattamento stress sul terreno agarizzato, coltura liquido è più conveniente per il trattamento del gran numero di piante necessarie in vitro importazione. Inoltre, facilita l&#39;applicazione uniforme del fattore stressante per tutte le piante, che è particolarmente importante per i trattamenti di stress a breve termine. Il metodo qui presentato è stato applicato per studiare lo stress osmotico mediante trattamento mannitolo, ma potrebbe essere facilmente adattato ad una vasta gamma di altre sollecitazioni; per esempio, lo stress sale a breve termine e lo stress ossidativo, per i quali i corrispondenti fattori di stress potrebbero be allo stesso modo applicato su supporto MS liquido. Per altri tipi di stress, si consiglia il grado di stress viene prima ottimizzata; eccessivamente trattamenti gravi possono avere effetti negativi sulla resa e / o di competenza importazione dei organelli isolati. Ci sono diversi passaggi importanti all&#39;interno del protocollo a cui si deve prestare particolare attenzione, come di seguito dettagliato. La concentrazione agar ottimale per il mezzo MS possono differire (0,6 - 0,9%, w / v) a seconda del produttore. Pertanto, si raccomanda di ottimizzare empiricamente la concentrazione di agar prima di iniziare esperimenti. Il mezzo non dovrebbe essere così morbido che si attacca al tessuto nella fase di raccolta (passo 1,9), non dovrebbe essere così difficile che inibisce lo sviluppo delle radici delle piante. La concentrazione di saccarosio può essere regolato secondo le piante utilizzate. Quando si lavora con mutanti particolarmente malati, medie MS completato con 2 - 3% (w / v) di saccarosio può aiutare le piante a crescere meglio. quando appsdraiato trattamenti di stress, non è buono per il trasferimento molto vecchi impianti al mezzo liquido (per esempio,&gt; 14 giorni di età). Questo è perché le radici più sviluppati delle piante più vecchie sono più facilmente danneggiati durante trasferimento. Per quanto riguarda il sistema di trascrizione / traduzione, ci sono 2 sistemi principali: quelle a base di germe di grano, e quelle a base di reticolociti di coniglio. Questi kit possono utilizzare diversi modelli, come plasmidi linearizzati, plasmidi unlinearized, o prodotti di PCR. I kit sono anche specifici per i promotori T3, T7 e SP6. Si noti che il kit si consiglia qui è adatto solo per l&#39;uso con i prodotti di PCR e il promotore T7. Tuttavia, per ragioni sconosciute, alcune preproteine ​​radiomarcati realizzati con questo sistema potrebbero non funzionare in modo efficiente nel saggio di importazione; in questi casi, si può considerare cercando un sistema di estratto di germe di grano o di un sistema di lisato di reticolociti significato per modelli plasmidi. Si può anche migliorare il risultato della trascrizione / traduzione reazione modificando le condizioni di reazione secondo il manuale del produttore. È importante iniziare isolamento cloroplasto prime ore del mattino (o ravvicinata alla luce ciclo della camera di crescita), al fine di evitare l&#39;accumulo di amido all&#39;interno cloroplasti causa di fotosintesi, che possono ostacolare l&#39;isolamento di organelli intatti. La procedura di isolamento cloroplasto deve essere fatto rapidamente senza inutili ritardi, e cloroplasti isolati deve essere mantenuta sempre freddo. Questo è quello di mitigare l&#39;osservazione che isolato cloroplasti gradualmente perdono la loro vitalità, che non è buono. Se si utilizza CIB appena scongelati o buffer di HMS, assicuratevi di mescolare il buffer bene prima dell&#39;uso per ottenere una soluzione omogenea. Le condizioni ottimali per l&#39;omogeneizzazione del materiale vegetale sono state stabilite empiricamente, e possono variare se si utilizza un diverso omogeneizzatore tessuto. Se i diversi genotipi vegetali contengono similalivelli di clorofilla r, clorofilla quantificazione può essere usato come un modo alternativo per normalizzare i campioni prima di effettuare i test di importazione. Clorofilla può essere determinato spettrofotometricamente dopo l&#39;estrazione di un campione dei cloroplasti isolati in 80% (v / v) di acetone acquoso 19,20. Tuttavia, se i tassi di importazione di piante che presentano diversi contenuti di clorofilla (ad esempio, mutanti con fenotipi clorotiche) devono essere confrontati, utilizzare il numero cloroplasto contare per normalizzare i campioni cloroplasti nei saggi di importazione. È particolarmente importante per risospendere le cloroplasti accuratamente nel passo 3.11. risospensione insufficiente può lasciare aggregati di cloroplasti, che renderà difficile contare i numeri in modo accurato e, quindi, ostacolerà il corretto caricamento nelle reazioni di importazione. Se grave aggregazione è visto al microscopio (ad esempio, aggregati con&gt; 10 cloroplasto unite), continuare scuotendo il campione cloroplasto in ghiaccio fino al aggregatES vengono rimossi. E &#39;più facile risospendere le cloroplasti in un volume più piccolo di tampone. E &#39;importante essere consapevoli che le reazioni importazione delle proteine ​​(sezione 5) devono essere condotte con le opportune precauzioni a causa della loro natura radioattiva. precauzioni necessarie includono: indossare guanti monouso, indumenti da laboratorio e occhiali di sicurezza, il monitoraggio e la decontaminazione del piano di lavoro e le attrezzature, e lo smaltimento di tutti i rifiuti radioattivi in ​​un contenitore per rifiuti approvato. Anche tenere presente che la corretta pressione osmotica è fondamentale per mantenere l&#39;integrità dei cloroplasti durante le reazioni di importazione, e questo è principalmente mantenuto dal buffer HMS. Perché 10x HMS è viscoso, occorre in primo luogo riscaldato a RT, e poi accuratamente miscelati, e applicato con un puntale di taglio al fine di garantire la misurazione dei volumi accurati. Nella reazione di importazione, si aggiunge metionina freddo per inibire l&#39;incorporazione di metionina radioattivo libera in chloropl estraneiproteine ​​AST attraverso una versione organelli durante la fase di incubazione, mentre BSA viene utilizzato per minimizzare proteolisi agendo come substrato per proteasi.

Cloroplasti sono organelli molto abbondanti che esistono nei tessuti verdi delle piante. Essi sono ben noti per il loro ruolo fondamentale nella fotosintesi, un processo che utilizza l&#39;energia della luce per convertire l&#39;anidride carbonica allo zucchero e sostenere così quasi tutta la vita sulla terra 1. Inoltre, cloroplasti (e l&#39;ampia famiglia di organelli correlati chiamati plastidi) svolgono molte altre funzioni vitali nella piante, tra la biosintesi degli aminoacidi, lipidi, pigmenti, e il rilevamento di segnali ambientali come la gravità e la sfida patogeno. La fotosintesi genera specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) come sottoprodotti, che in determinate circostanze hanno un ruolo utile, ma se overproduced può causare effetti dannosi o addirittura letali. La sovrapproduzione di ROS è particolarmente promossa da condizioni ambientali avverse, e quindi cloroplasti sono strettamente legate alle risposte a stress abiotici, come salinità e stress osmotico 2. Chloroplasts hanno una struttura complessa. Ogni cloroplasto è circondato da uno strato esterno doppio membrana chiamata busta, che consiste di membrane esterne ed interne. Internamente, vi è un altro sistema di membrana chiamata tilacoidi, dove le reazioni luce della fotosintesi avvengono. Tra i due sistemi a membrana vi è un vano chiamata acquosa stroma, che è coinvolto nella fissazione del carbonio. Un cloroplasto può contenere fino a ~ 3.000 proteine diverse, e la stragrande maggioranza di queste proteine sono sintetizzate nel citoplasma in forma precursori e devono essere importati nella organello attraverso translocons proteine dedicati nelle membrane busta 1. È interessante notare che, recente lavoro ha indicato che l&#39;importazione di proteine ​​cloroplasto è regolata attivamente, e così è in grado di esercitare un importante livello di controllo sul proteoma cloroplasto. Ad esempio, è stato riferito nel 2015 che l&#39;importazione di proteine ​​in grado di rispondere a stress abiotici attraverso la regolazione diretta dell&#39;abbondanza di The translocon a livello della membrana busta esterna dei cloroplasti (TOC) da parte del sistema ubiquitina-proteasoma 3. Utilizzando cloroplasti purificati e in vitro sintetizzato proteine precursori, importazione delle proteine può essere ricostituito in vitro 4,5. Così, metodi in vitro possono essere utilizzati per valutare i tassi di importazione in diverse piante mutanti 6, che è stato un approccio critico per l&#39;analisi delle componenti putativi del macchinario importazione delle proteine e per scoprire i meccanismi alla base importazione delle proteine e la sua regolamentazione. Inoltre, cloroplasti possono essere trattati con un ulteriore frazionamento o proteasi digestione, a seguito di importazione in vitro, che può facilitare studi sulla localizzazione sub-organelli e la topologia delle proteine cloroplasti 7,8. Per studiare la regolazione di importazione delle proteine ​​da stress, abbiamo modificato il nostro metodo di isolamento dei cloroplasti di routine come descriveremoQui. Importante, cloroplasti sono stati isolati da piante che erano state coltivate in serie Murashige e Skoog (MS) agar per 8 giorni e poi trasferite in un mezzo liquido MS supplementato con stress, fornendo un tempo relativamente breve, stress trattamento controllato. Il rendimento e la competenza dei cloroplasti isolati da tali impianti stress trattati siano compatibili con la valle di proteine vitro importazione 3. Oltre al protocollo di isolamento cloroplasto, presentiamo il nostro metodo di routine per vitro importazione proteina, che ha dimostrato di essere robusto ed è ampiamente usato 3,9-12.

<table><tbody><tr><td>Sale basale di Murashige e Skoog</td><td>Melford</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>fitoagar</td><td>Melford</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morfolino) acido etano solfonato (MES)</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BPE151-500</td><td></td></tr><tr><td>nastro chirurgico (ad es. , Micropore, 3M)3M</td><td></td> <td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>carta da filtro</td><td>Fisher</td><td>FB59023</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fisher</td><td>10607095</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilenglicole tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>D/0700/53</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-idrossietil)piperazina-1-etanosolfonico acido (HEPES)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>panno filtrante (Miracloth)</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 50 mL</td><td>Fisher</td><td>CFT-595-040M</td><td></td></tr><tr><td>Flacone da centrifuga da 250 mL</td><td>Fisher</td><td>CFT-891-V</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (es., Kinematica PT10-35)</td><td>Sonda Fisher</td><td>11010070</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (es., Kinematica PTA20S)</td><td>Fisher</td><td>11030083</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga (es., Beckman Coulter Avanti JXN-26, per provette da 50 e 250 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34182</td><td></td></tr><tr><td>rotore ad angolo fisso per 250&nbsp; Bottiglie da ml (es., JLA-16.250)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363930</td><td></td></tr><tr><td>rotore ad angolo fisso per 50&nbsp; provette mL (es., JA-25.50)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td></td></tr><tr><td>rotore a secchiello oscillante per provette da 50 mL (es., JS-13.1)</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>metationina radiomarcata [35S]</td><td></td><td></td> sistema di traduzione senza cellule basato NEG072002MC <td></td></tr><tr><td>su lisato di reticolociti di coniglio (TNT T7 Quick kit per PCR DNA)</td><td>Microscopio a</td> contrasto di fase Promega <td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>(ad es. , Nikon Eclipse 80i)</td><td>Emocitometro Nikon</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>(camera Neubauer BS748 migliorata)</td><td>Hawksley Technology</td><td>AC1000</td><td>0,1 mm di profondità, 1/400 mm2</td></tr><tr><td>occhiali</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td>22 mm e tempi; 22 mm, spessore 0,13-0,17 mm</td></tr><tr><td>1,5 mL provette per microfuge</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>provette per microfuge da 2 mL</td><td>Starlab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>microfuge (es., Eppendorf 5415D)</td><td>Eppendorf</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Nanodrop 2000 o simile</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPR-700-310L</td><td></td></tr><tr><td>acido gluconico (sale di potassio)</td><td>Fisher</td><td>22932-2500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>metionina</td><td>Sigma</td><td>M6039</td><td></td></tr><tr><td>blu di bromofenolo</td><td>Fisher</td><td>B/P620/44</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Fisher</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>S/5200/53</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base&nbsp;</td><td>Melford</td><td>B2005</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitolo (DTT)</td>Software di analisi delle immagini <td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>(es., Aida Image Analyzer)</td><td>Raytest</td><td>non disponibile</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi delle proteine ​​importazione in cloroplasti isolati da piante stressate

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Cloroplasti sono organelli con molti ruoli vitali nelle piante, che comprendono non solo la fotosintesi, ma numerose altre funzioni metaboliche e di segnalazione. Inoltre, i cloroplasti sono fondamentali per le risposte delle piante a vari stress abiotici, come la salinità e stress osmotico. Un cloroplasto può contenere fino a ~ 3.000 proteine ​​diverse, alcune delle quali sono codificati dal proprio genoma. Tuttavia, la maggior parte delle proteine ​​cloroplasti sono codificati nel nucleo e sintetizzata nel citosol, e queste proteine ​​devono essere importati nel cloroplasto attraverso translocons le membrane dei cloroplasti busta. Recenti studi hanno dimostrato che l&#39;importazione delle proteine ​​cloroplasto può essere regolata attivamente da stress. Per indagare biochimicamente tale regolazione di importazione delle proteine ​​in condizioni di stress, abbiamo sviluppato il metodo descritto qui come una procedura rapida e semplice che può essere facilmente realizzato in qualsiasi laboratorio. In questo metodo, le piante vengono coltivate in conditio normalens e quindi esposti a condizioni di stress in coltura liquida. materiale vegetale viene raccolto, e cloroplasti sono poi rilasciato dalla omogeneizzazione. L&#39;omogenato grezzo viene separato per centrifugazione in gradiente di densità, consentendo isolamento dei cloroplasti intatti. resa cloroplasto è valutata mediante conteggio e integrità cloroplasto viene controllato al microscopio. Per i saggi di importazione delle proteine, i cloroplasti purificate vengono incubate con 35 S radioattivo in vitro tradotto proteine precursori, e sono condotte esperimenti time-corso per consentire il confronto dei tassi di importazione tra i genotipi in condizioni di stress. Presentiamo dati generati con questo metodo che mostrano che il tasso di importazione delle proteine ​​in cloroplasti da un mutante normativo è specificamente alterata in condizioni di stress osmotico.

Un esempio proteine cloroplasto esperimento importazione di 3 punti temporali è mostrato in Figura 1. PSAD è un componente ~ 18 kD del fotosistema esposi al stroma, con una forma precursore di ~ 23 kD 16. PSAD è stato scelto qui per la proteina saggio di importazione in vitro perché i suoi livelli di steady-state sono elevati nel mutante sp1, rispetto al WT, in condizioni di stress, che suggerisce un cambiamento nella sua efficienza importazione nel mutante 3. Il mutante sp1 porta un difetto in un importante regolatore del cloroplasto macchinari importazione delle proteine - la proteina SP1 3. Per cloroplasti isolati da piante coltivate in condizioni normali, non vi era alcuna differenza evidente in importazione PSAD tra SP1 e WT (dati non riportati) 3. Tuttavia, utilizzando i metodi descritti qui per valutare PSAD importazione in cloroplasti isolati da osmoticamentepiante stressate, è stata rilevata una differenza chiara. Mentre abbiamo osservato l&#39;accumulo di forma proteina matura in un modo dipendente dal tempo con entrambi i genotipi, il tasso di importazione era significativamente più basso per i cloroplasti WT che per cloroplasti SP1 (Figura 1), che è coerente con i nostri risultati precedenti 3, e rivela un ruolo importante per la proteina SP1 nel regolare l&#39;importazione cloroplasto di PSAD in condizioni di stress. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" /> Figura 1. Una proteina Importa test condotti utilizzando cloroplasti isolati da piante coltivate in condizioni di stress osmotici. I cloroplasti sono stati isolati da un WT 10 giorni di età (Col-0) e un SP1 mutanti piante di Arabidopsis coltivate in condizioni di stress (200 mm mannitolo) per 2 d. Importazione (A) della proteina è stata condotta utilizzando [35 S] -methionine marcato pPsaD e lasciata procedere per 4, 8 e 12 minuti prima analisi mediante SDS-PAGE e l&#39;imaging fosforo. In parallelo, il controllo di input del 10% pPsaD che comprende in vitro tradotto proteine (IVT) è stato analizzato. Il precursore (pre) e maturo (mat) forme di pPsaD sono indicati, mentre in mezzo ci sono due band che probabilmente corrispondono ai prodotti di traduzione troncati o proteolyzed perché la loro intensità non è cambiata nel corso tempo (*). (B) Per confrontare i tassi di importazione in cloroplasti da piante WT e SP1 cresciuti in condizioni di stress, l&#39;intensità di ogni banda corrispondente alla proteina matura importati in A è stato quantificato. Tutti i dati sono espressi come percentuale della quantità di proteine importati nei cloroplasti da piante WT dopo 12 min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Qui si descrive un nuovo metodo per studiare importazione delle proteine ​​in cloroplasti isolati sotto stress. Il metodo è rapido e semplice, e può essere applicata per studiare le conseguenze delle diverse condizioni di stress per l&#39;importazione proteine ​​cloroplasto, ei corrispondenti meccanismi regolatori.

Analisi delle proteine ​​importazione in cloroplasti isolati da piante stressate

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è studiare l'importazione di proteine codificate nel nucleo all'interno dei cloroplasti, con particolare attenzione agli effetti dello stress. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei cloroplasti, ad esempio in che modo viene regolata l'importazione delle proteine nei cloroplasti. Un vantaggio specifico di questa tecnica è che consente di valutare gli effetti dello stress sull'importazione delle proteine nei cloroplasti.Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per essere utilizzato con la pianta modello Arabidopsis thaliana, potrebbe essere modificato e adattato per l'uso con altri sistemi, come le piante coltivabili. A illustrare la procedura sarà Qihua Ling, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Per iniziare, coltivare innanzitutto le piante di Arabidopsis come descritto nel protocollo testuale allegato.Successivamente, quando le piante hanno otto giorni, effettuare un trattamento di stress. Rimuovere delicatamente le piante dalla piastra in agar a mano e posizionarle in un matraccio sterilizzato contenente mezzo liquido MS con l'agente di stress. Potrebbe essere necessario posizionare piante aggiuntive in un matraccio simile senza agente di stress come controllo, a seconda della natura dell'esperimento.Coprire l'imboccatura dei flaconi con stagnola sterilizzata e lasciare crescere le piante per altri due giorni su un agitatore orbitale con agitazione delicata. Preparare un gradiente di densità continuo mescolando prima 13 millilitri di Percoll, 13 millilitri di buffer di isolamento dei cloroplasti 2x e cinque milligrammi di glutathione in un tubo da centrifuga da 50 millilitri. Quindi centrifugare la miscela.Dopo la centrifugazione, maneggiare il tubo con attenzione per evitare di disturbare il gradiente e mantenerlo sul ghiaccio per un uso successivo. Successivamente, trasferire 100 millilitri di buffer per l'isolamento dei cloroplasti per ogni condizione in un becher da un litro. Rimuovere le piantine dal mezzo liquido versandole in un setaccio.Quindi trasferirli nel becher contenente il tampone di isolamento dei cloroplasti. Sciacquare il tessuto con il tampone per rimuovere qualsiasi mezzo residuo, quindi sostituire il tampone con 100 millilitri di tampone di isolamento fresco. Per il primo ciclo di omogeneizzazione, trasferire il tessuto vegetale a mano in un becher da 50 millilitri, permettendo al tampone precedente di defluire attraverso le dita.Quindi inserire la sonda dell'omogenizzatore tissutale nel tessuto ed eseguire due impulsi di uno o due secondi ciascuno. Filtrare l'omogenato attraverso due strati di stoffa filtrante in un tubo da centrifuga da 250 millilitri. Completare l'operazione comprimendo delicatamente la stoffa.Conservare il filtrato e trasferire il tessuto vegetale nuovamente nel becher da 50 millilitri. Quindi aggiungere un secondo volume di 20 millilitri di tampone per l'isolamento dei cloroplasti nel becher da 50 millilitri e aggiungere qualsiasi tessuto rimanente non utilizzato nel primo ciclo di omogeneizzazione. Ripetere i passaggi di omogeneizzazione e filtrazione altre quattro volte.Centrifugare l'omogenato raccolto a 1.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Versare immediatamente il soprannatante dopo la centrifugazione, avendo cura di non disturbare il pellet. Porre il tubo sul ghiaccio e risospendere il pellet nel soprannatante residuo agitando delicatamente il tubo.Successivamente, utilizzare una pipetta di Pasteur per trasferire delicatamente l'omogenato sulla sommità del gradiente di densità continuo preformato, lungo la parete del tubo ricevente. Quindi centrifugare il campione e il gradiente in un rotore a cestello oscillante a 7.800 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius con il freno disattivato. Al termine, osservare le due bande verdi visibili nel gradiente.Scartare la banda superiore, che contiene cloroplasti rotti, e utilizzare una pipetta di Pasteur per trasferire la banda inferiore contenente cloroplasti integri in un nuovo tubo da centrifuga da 50 millilitri. Successivamente, aggiungere 25 millilitri di buffer HMS nel tubo e capovolgere il tubo due volte per lavare il Percoll dai cloroplasti. Quindi riposizionare il tubo nel rotore a cestello oscillante e riguadagnare il pellet dei cloroplasti.Versare il sovranatante e risospendere il pellet nel tampone residuo agitando delicatamente il tubo sul ghiaccio. Aggiungere un volume aggiuntivo di 100 a 300 microlitri del tampone HMS se necessario, ma cercare di non diluire troppo il campione. Conservare i cloroplasti risospesi sul ghiaccio.Iniziare aggiungendo cinque microlitri di cloroplasti isolati a 495 microlitri di tampone HMS in un tubo da 1,5 millilitri. Ribaltare il tubo per mescolare delicatamente la soluzione. Quindi posizionare un vetrino coprioggetto sulla camera di conteggio di un emocitometro.Pipettare lentamente da 40 a 60 microlitri della sospensione di cloroplasti diluita nello spazio tra il vetrino coprioggetto e la camera di conteggio. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase, acquisire immagini dei cloroplasti con un obiettivo 20x. I cloroplasti integri appaiono rotondi e luminosi e sono circondati da un alone di luce.Quindi utilizzare l'obiettivo 10x per contare il numero di cloroplasti in 10 quadrati grandi. Il numero di cloroplasti per quadrato grande dovrebbe essere compreso tra 10 e 30. Se sono presenti troppo pochi o troppi cloroplasti, regolare il fattore di diluizione e ripetere la procedura.Una volta raggiunta la gamma appropriata, calcolare il numero di cloroplasti per millilitro come descritto nel protocollo testuale allegato. Per eseguire un corso temporale con tre punti temporali, preparare tre provette, ciascuna contenente un'aliquote da 130 microlitri di tampone di arresto dell'importazione, e lasciarle sul ghiaccio. In una provetta da due millilitri, preparare la reazione di importazione contenente il tampone di reazione e la proteina precursore radioetichettata.Si noti che deve essere prevista una reazione per ciascuna condizione da testare. Utilizzare circa 10 milioni di cloroplasti per ogni punto temporale. Incubare il tubo della reazione a 25 gradi Celsius in un bagno termico sotto una quantità limitata di luce.Battere leggermente i tubi di tanto in tanto per risospendere i cloroplasti. Per eseguire un corso temporale, prelevare aliquote di 130 millilitri dalla reazione nei punti temporali richiesti all'interno del range lineare dell'importazione. Immediatamente dopo il prelievo, trasferire ciascuna aliquota di 130 microlitri in un tubo contenente tampone di arresto dell'importazione freddo di ghiaccio, mescolando con un leggero colpetto sul tubo, e porre i tubi sul ghiaccio fino al completamento del corso temporale.Dopo aver rimosso l'ultimo campione, centrifugare tutti i campioni per 30 secondi a 12.000 × g in un microcentrifugo. Successivamente, eliminare i soprannatanti e risospendere i pellet in 15 microlitri di buffer di caricamento proteico 2×. Quindi, mescolare i campioni mediante vortex.Infine, analizzare tutti i campioni, insieme a un controllo di input del precursore, utilizzando elettroforesi SDS-PAGE standard e autoradiografia, fluorografia o fosforimaging. PsaD è un componente del fotosistema I di 18 chilodalton, sintetizzato come un precursore più grande di 23 chilodalton. L'elaborazione alla forma matura di 18 chilodalton indica che l'importazione nei cloroplasti è avvenuta.Il mutante sp1 di Arabidopsis studiato in questo caso presenta un difetto in un importante regolatore del sistema di importazione proteica nei cloroplasti, la proteina sp1. In condizioni di stress, la quantità di importazione della proteina PsaD nei cloroplasti del mutante sp1 aumenta rispetto al tipo selvatico, ma non nelle normali condizioni non stressanti. Mentre la forma matura della proteina PsaD si accumulava in modo dipendente dal tempo nei cloroplasti di entrambi i genotipi vegetali, la velocità di importazione risultava significativamente maggiore nei cloroplasti del mutante sp1 rispetto a quelli del tipo selvatico.Questi risultati indicano un ruolo importante della proteina sp1 nella regolazione dell'importazione di proteine nei cloroplasti in condizioni di stress. Una volta appadronita, questa metodica, dall'isolamento dei cloroplasti fino al completamento del saggio di importazione, può essere portata a termine in cinque o sei ore se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare di effettuare tutti i passaggi di isolamento dei cloroplasti a quattro gradi Celsius per garantire che i cloroplasti mantengano la massima attività.Dopo il suo sviluppo iniziale avvenuto diversi decenni fa, il saggio di importazione proteica in vitro nei cloroplasti ha aperto la strada ai ricercatori del settore per esplorare molti aspetti diversi del meccanismo di importazione proteica nei cloroplasti. L'approccio affinato qui presentato permette di indagare gli effetti di condizioni di stress sull'importazione proteica. Non dimenticare che il lavoro con materiali radioattivi richiede particolari precauzioni.Precauzioni come indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

analysis-protein-import-into-chloroplasts-isolated-from-stressed

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Il confronto, approccio di proteomica quantitativa descritta mira ad ottenere intuizioni nella composizione dei complessi multiproteici in condizioni diverse ed è dimostrato dal confronto ceppi geneticamente diversi. Per l'analisi quantitativa volumi uguali di frazioni diverse da un gradiente di densità di saccarosio sono mescolati e analizzati mediante spettrometria di massa.

Un nuovo approccio per l&#39;analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolica Etichettatura e quantitativa Spettrometria di Massa

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Vi presentiamo protocolli qui per isolamento ad alto rendimento di tilacoidi fisiologicamente attivo e analisi di trasporto di proteina per la traslocazione di cloroplasto doppia arginina (cpTat), secretiva (cpSec1) e vie di segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP).

Isolamento dei tilacoidi fisiologicamente attivo e il loro uso nelle analisi di trasporto energia-dipendente della proteina

Qui descriviamo un protocollo per esprimere proteine in protoplasti utilizzando il metodo di trasformazione PEG-mediata. Il metodo fornisce facile espressione di proteine di interesse e di indagine efficiente di localizzazione della proteina e il processo di importazione per varie condizioni sperimentali in vivo.

Lo studio di proteine importazione in cloroplasti utilizzando protoplasti

Qui presentiamo un protocollo collaudato e testato per la purificazione del cloroplasto complessi di importazione della proteina (complesso di TOC-TIC) utilizzando il rubinetto-tag. Il protocollo di affinità-isolamento di uno stadio potenzialmente può essere applicato a qualsiasi proteina ed essere utilizzato per identificare nuovi partners di interazione mediante spettrometria di massa.

Purificazione di affinità del cloroplasto Translocon proteina complessi usando il Tag di rubinetto

Qui, descriviamo un metodo per purificare i cloroplasti intatti da foglie di Arabidopsis e loro tre sub-scomparti principali (busta, lo stroma e tilacoidi), utilizzando una combinazione di centrifugazione differenziale, gradienti di Percoll continui, e pendenze del saccarosio discontinuo. Il metodo è utile per subplastidial e localizzazione subcellulare delle proteine mediante immunoblotting e proteomica.

Preparazione del cloroplasto Sub-compartimenti da Arabidopsis per l'analisi di localizzazione della proteina di Immunoblotting o proteomica

Il protocollo qui presentato prevede la profilazione polisomiale per isolare il translatoma, gli mRNA associati ai ribosomi, in RNA non polisomiali e polisomiali da Arabidopsis attraverso la centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio. Questo metodo dimostra l'efficienza di traslazione di Arabidopsis stressato dal calore.

Test di efficienza traslazionale utilizzando profili polisomici sotto stress termico

Un protocollo corto per la colorazione delle proteine ​​con Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in gel di poliacrilammide è descritto senza l'utilizzo di solventi organici o acido acetico come nelle procedure di colorazione classica con CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

Il video che accompagna descrive l'uso del Sistema di 8100 Frazionamento GELFREE, che partizioni campioni di proteine ​​complesse, sulla base del peso molecolare e recupera le frazioni in fase liquida. Il video descrive come funziona la tecnologia, come vengono utilizzati, e fornisce dati che ne risulta, con l'analisi di elettroforesi su gel di poliacrilamide frazionato omogenato di fegato bovino.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

Un approccio semplificato per lo screening per l'espressione di proteine ​​di membrana ricombinanti in Escherichia coli basato sulla fusione di proteina fluorescente verde è presentato.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

Scopri l'importazione di proteine nei cloroplasti isolati da piante stressate di Arabidopsis thaliana. Questo metodo rapido permette di studiare i meccanismi di regolazione sotto stress ambientale.

Analisi delle proteine ​​importazione in cloroplasti isolati da piante stressate

Esplora altri video

Analisi delle proteine importazione in cloroplasti isolati da piante stressate