Generazione rapida ed efficace delle ricombinante cellule staminali umane pluripotenti da ricombinasi mediata scambio Cassette in AAVS1 Locus

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire un editing genomico mirato rapido ed efficiente nell'AAVS1 di cellule staminali pluripotenti umane, o PSC umane, utilizzando una flippasi, un approccio di scambio di cassette mediato dalla ricombinasi o RMCE. La RMCE migliora l'inserimento del bersaglio di una sequenza nel locus AAVS1, che è di grande importanza per la biologia delle cellule staminali in quanto consente test rapidi sulla funzione di una molecola per sovraespressione o knockdown. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le linee PSC umane prive di eventi di integrazione casuali, sono ancora pluripotenti e quando i cariotipi normali possono essere creati in soli 15 giorni.

Questo metodo fornisce uno strumento utile per la transgenesi, nel locus AAVS1 ma può essere applicato anche ad altri loci permissivi umani. Per iniziare, coltivare linee cellulari master di PSC umana secondo procedure standard su o fuori fibroblasti embrionali di topo inattivati o iMEF, in piastre a sei pozzetti. Quando le cellule raggiungono il 60%-70% di iMEF resistenti ai farmaci su piastra di confluenza, utilizzando prima una soluzione di gelatina allo 0,1% per rivestire i pozzetti necessari di una piastra a 12 pozzetti e incubare la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti.

Quindi, piastrate 125.000 iDR4 per pozzetto e incubate le colture per una notte con il terreno iMEF. Il giorno seguente, preincubare le colture di PSC umana con terreno fresco che include 10 inibitori micromolari di ROCK a 37 gradi Celsius per un'ora. Nel frattempo, portare la soluzione di trasfezione ESC umana e l'agente di dissociazione cellulare a temperatura ambiente.

Preparare un millilitro di terreno di placcatura per nucleofecazione per condizione di nucleofezione. Quindi, rimuovere il terreno iDR4 dai pozzetti, utilizzare un millilitro di PBS a temperatura ambiente per lavare le cellule e aggiungere il terreno di placcatura per nucleofemazione. Trasferire 500 microlitri per campione di terreno di placcatura in provette sterili da 1,5 millilitri e conservare a 37 gradi Celsius fino alla placcatura.

Per staccare le PSC umane in una singola sospensione cellulare, rimuovere il terreno, utilizzare PBS a temperatura ambiente per lavare le cellule e aggiungere un millilitro di tripsina allo 0,05% o accutasi su colture di hPSC feeder o feeder-free, rispettivamente. Incubare le colture a 37 gradi Celsius. Quindi, rimuovere con cautela la piastra dall'incubatrice e senza lasciare che le cellule si stacchino, aspirare l'agente di dissociazione e aggiungere 1 millilitro di terreno PSC umano.

Dissociare le cellule sciolte lavando delicatamente il fluido sulla superficie della piastra evitando la formazione di schiuma. Raccogliere le cellule in una sospensione a cellula singola in una provetta pulita e sterile da 15 o 50 millilitri. Quindi utilizzare 1 millilitro di terreno hESC per lavare le cellule e raccoglierle nella stessa provetta.

Prelevare un'aliquota di 50 microlitri di sospensione cellulare per il conteggio e centrifugare le cellule rimanenti a 300 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Contare le cellule con un dispositivo di conteggio delle cellule mentre la sospensione è in fase di centrifugazione. Rimuovere il surnatante e utilizzare il PBS a temperatura ambiente per risospendere delicatamente il colore della cella a 10-6 per millilitro.

Quindi trasferire due millilitri per condizione sperimentale per pulire provette sterili da 15 millilitri e ripetere la centrifugazione. Mentre i campioni stanno centrifugando, preparare miscele di plasmidi in tre provette pulite da 1,5 millilitri con rapporti molecolari 0:1, 2:1 e 2:0 della flippasi del donatore utilizzando 2,5 microgrammi di plasmide flippasi. Per procedere con la nucleofezione, rimuovere dall'incubatrice la piastra iDR4 e la provetta da 1,5 millilitri con mezzo di placcatura.

Una provetta alla volta, senza disturbare il pellet, pipettare con cura il PBS, rimuovendo la maggior parte possibile del tampone. Utilizzare 100 microlitri di soluzione di trasfezione per risospendere il pellet mediante pipettaggio delicato. Quindi, trasferire la sospensione cellulare nella provetta da 1,5 millilitri contenente le miscele plasmidiche e mescolare delicatamente.

Trasferire la miscela di DNA cellulare nella cuvetta del tranfettore, facendo attenzione a non introdurre bolle. Inserire la cuvetta nel dispositivo nucleofettore ed eseguire il programma A13 per le cellule coltivate su alimentatori o F16 per la trasfezione senza alimentatore. Rimuovere la cuvetta e utilizzare le pipette di trasferimento monouso nel kit per aggiungere 0,5 millilitri di terreno di placcatura nella cuvetta delicatamente, ma rapidamente e con un solo movimento.

Quindi, recuperare il volume allo stesso modo e piastrarlo goccia a goccia nella piastra a 12 pozzetti contenente l'iDR4 e il mezzo di placcatura. Posizionare la piastra di coltura su un ripiano dell'incubatore e muoverla lentamente avanti e indietro e da un lato all'altro per distribuire uniformemente la sospensione cellulare. Incubare il piatto per 24 ore prima di cambiare il terreno.

Due o tre giorni dopo la trasfezione, iniziare la selezione. Aspirare il terreno, utilizzare 1 millilitro di PBS per lavare le cellule, quindi aggiungere il terreno ESC umano con 100 nanogrammi per millilitro di puromicina. Osservare la crescita cellulare e aumentare di conseguenza la concentrazione di puromicina fino a un massimo di 250 nanogrammi per millilitro, continuando la selezione della puromicina per sette giorni.

Dopo tre o quattro giorni di selezione della puromicina, iniziare la selezione con fialuridina 0,5 micromolare o FIAU. Cambiare il mezzo ogni giorno e mantenere la FIAU per non più di sette giorni consecutivi. Dopo il completamento della selezione, intorno ai giorni 14-15, saranno presenti colonie RMCE resistenti che costituiranno la nuova linea RMCE.

Dividi le celle con un rapporto 1:2 seguendo le procedure standard. Quando i pozzetti della Chiave 1 sono pronti per la divisione, dissociare il pozzetto per la caratterizzazione in una sospensione a singola cellula come descritto in precedenza nel video e raccogliere le cellule in una provetta da 15 millilitri. Far girare le celle a 300 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti.

Quindi, utilizzare un millilitro di PBS per risospendere le cellule e dividere il campione in due. Uno filtrato utilizzando un filtro cellulare per eseguire la citometria a flusso e l'altro per l'analisi del DNA secondo il protocollo di testo. Dopo la trasfezione con la flippasi ricombinasi e il donatore RMCE tdT, le hPSC hanno formato piccoli gruppi di cellule distribuite uniformemente sullo strato di iDR4 MEF ed hanno espresso GFP costitutiva e tdT transitoria.

La selezione positiva con la puromicina favorisce l'inserimento del donatore RMCE, quindi la selezione negativa con FIAU seleziona solo per gli eventi di ricombinazione mediati da FRT privi di TK. Intorno al sesto giorno dopo la trasfezione, possono essere identificati piccoli cluster di cellule RMCE GFP-negative e tdT-positive. Come dimostrato qui, le colonie RMCE GFP-negative e tdT-positive sono presenti solo quando vengono utilizzati sia il donatore RMCE che la flippasi, mentre la RMCE non si verifica in assenza di flippasi. La caratterizzazione con citometria a flusso delle linee RMCE appena generate, che sono le colonie RMCE resistenti alla puromicina e alla FIAU, combinate in una popolazione cellulare non clonale conferma che il 100% delle cellule rappresenta il fenotipo RMCE GFP-negativo, tdT-positivo.

Quando si utilizzano donatori RMCE senza attività di registratore in hPSC, il 100% delle cellule è GFP-negativo. La caratterizzazione PCR mostrata qui della linea RMCE non clonale, dimostra lo scambio completo di cassette e che il programma di selezione utilizzato genera linee casuali prive di integrazione, sia del donatore RMCE che del vettore che esprime la flippasi. In sintesi, questo metodo RMCE semplifica significativamente l'editing genico nelle hPSC per un locus definito rispetto alle nucleasi mirate.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 15 giorni. Pertanto, RMCE è uno strumento di editing genetico molto veloce che consentirà studi comparativi in un contesto isogenico. Quando si utilizza questa procedura, è importante avere efficienze di trasfezione superiori al 30% e preformare un agente di selezione dello storage del nucleo appropriato.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire RMCE nel locus AAVS1 delle PSC umane e come caratterizzare la linea ricombinata.