Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di sviluppare un nuovo metodo per la generazione di cellule T regolatorie associate alle articolazioni infiammate derivate da cellule staminali per l'immunoterapia contro l'artrite autoimmune. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'autoimmunità sui potenziali immunoterapici per l'artrite autoimmune. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule T regolatorie derivate da cellule staminali sono nypedi e di un unico tipo.

Iniziare diluendo le celle di alimentazione di interesse a una densità minima di una volta per 10 le quarte celle per centimetro quadrato in OP9 e placcando una volta 10 per le sesta celle di alimentazione per piatto da 10 centimetri. Quando le cellule diventano confluenti all'80-90%, rimuovere il terreno dalle colture e seminare da 0,5 a una volta da 10 al quinto, cellule staminali pluripotenti inducibili trasdotte retroviralmente o IPSC in terreno OP9 in ogni piatto. Cinque giorni dopo, aspirare il terreno e lavare le cellule con 10 millilitri di PBS.

Quindi, staccare le cellule con quattro millilitri di tripsina per piatto, a 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, interrompere le reazioni con otto millilitri di terreno IPSC ed estrarre le celle per la centrifugazione. Risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno IPSC fresco e riplaccare le celle su nuove piastre da 10 centimetri.

Lasciare che le cellule di alimentazione aderiscano alla piastra per 30 minuti nell'incubatore per colture cellulari. Quindi, raccogliere le IPSC galleggianti e filtrare le cellule trasdotte attraverso un colino da 70 micron per il conteggio. Seminare cinque volte da 10 a 5 IPSC su una piastra fresca confluente all'80-90% di cellule feeder in terreno OP9 integrato con ligando murino-Flt3 e riportare le colture all'incubatore.

Dopo tre giorni, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per lavare il piatto con il terreno di coltura. Quindi, aggiungere cinque millilitri di terreno OP9 fresco alla piastra e lavare delicatamente le IPSC semiaderenti con un pipettaggio attento e vigoroso che non interrompa lo strato di cellule di alimentazione. Ripetere il lavaggio con 10 millilitri di PBS per raccogliere l'ultima delle cellule semiaderenti, tirando i lavaggi da ogni piatto in una provetta conica per coltura.

Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere i pellet in 10 millilitri di terreno OP9 integrato con ligando murino-Flt3 e IL-7 e filtrare le cellule attraverso un colino da 70 micron. Seminare una coltura IPSC per pozzetto in una piastra di coltura a sei pozzetti contenente dall'80 al 90% di monostrati di cellule feeder confluenti e rimettere le co-colture nell'incubatore. Ogni due giorni, sostituire metà del terreno con un terreno OP9 fresco integrato con ligando murino-Flt3 e IL-7 e, ogni quattro-sei giorni, riseminare le IPSC differenzianti su nuove piastre con un nuovo strato di cellule di alimentazione, se necessario.

Inizia staccando le colture cellulari di interesse con la tripsina e risospendendo ogni tipo di cellula in 10 millilitri di terreno fresco. Placcare ogni coltura cellulare in un nuovo piatto da 10 centimetri e lasciare che le cellule di alimentazione aderiscano nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 30 minuti, raccogliere le IPSC galleggianti e passare le colture attraverso singoli filtri cellulari da 70 micron per rimuovere i cluster cellulari per il conteggio.

Risospendere ciascuna coltura a una concentrazione di 1,5 volte 10-7 cellule per millilitro in PBS freddo, filtrando nuovamente se necessario. Quindi, posizionare le femmine di topi C57BL/6 di età compresa tra quattro e sei settimane, una alla volta, in un piccolo sistema di contenzione per animali e trasferire adottivamente 200 microlitri di un tipo di cellula per topo nella vena caudale di ciascun animale. Utilizzare un calibro a quadrante per misurare il gonfiore di entrambe le ginocchia per stabilire la misurazione di base.

10 giorni dopo il trasferimento cellulare, utilizzare una siringa da un millilitro per iniettare nei topi 100 microgrammi di BSA metilato emulsionato in adiuvante completo di Freund alla base della coda di ciascun animale da esperimento. 17 giorni dopo il trasferimento cellulare, indurre l'artrite mediante iniezione intra-articolare di 20 microgrammi di BSA metilato in 10 microlitri di PBS nell'articolazione del ginocchio sinistro e 20 microgrammi di BSA metilato e 100 microgrammi di Ovalbumina intera in 10 microlitri di PBS nell'articolazione del ginocchio destro di ogni animale anestetizzato trasferito in modo adottivo. Sette giorni dopo aver indotto l'artrite, misurare nuovamente le ginocchia per calcolare l'aumento percentuale del diametro del ginocchio e asportare chirurgicamente le rotule.

Fissare le articolazioni in formalina. Quindi, dopo la decalcificazione in EDTA, incorporare le ginocchia nella paraffina e ottenere sezioni di quattro micron per la colorazione e l'analisi istochimica. Il giorno 28, le cellule T regolatorie antigene-specifiche esprimono livelli sostanziali di recettori delle cellule T CD3 e antigene-specifici.

La maggior parte di queste cellule esprime anche CD25, CD127 e CTLA-4, che sono tipicamente espressi a livelli elevati nelle cellule T regolatorie presenti in natura. Infatti, FoxP3 persiste nelle cellule regolatorie T derivate da IPSC, anche dopo una stimolazione in vitro a lungo termine con il ligando di Notch, come rilevato dalla colorazione intracellulare. Inoltre, queste cellule regolatorie IPSC T antigene-specifiche producono citochine soppressive quando stimolate con splenociti pulsati con antigene in vitro, indicando un potenziale fenotipo soppressivo per queste cellule.

cellule FoxP3 positive sono state osservate nelle ginocchia trattate con OVA, senza cellule FoxP3 positive evidenti nelle ginocchia che ricevono IPSC trasdotte con vettore di controllo. Inoltre, molte più cellule CD4 positive, FoxP3 positive, TCR3 Beta 5 positive sono visualizzate nelle ginocchia dei topi che ricevono IPSC trasdotte con il vettore TCR-FoxP3, rispetto al solo vettore FoxP3, suggerendo che le cellule IPSC-Treg antigene-specifiche migrano verso il ginocchio da artrite indotta dall'antigene dopo il loro trasferimento adottivo negli animali riceventi. Il trasferimento adottivo di cellule derivate da IPSC influisce anche su una sostanziale diminuzione del gonfiore infiammatorio del ginocchio quando è presente OVA, ma non ha alcun effetto sul controllo delle ginocchia iniettate con BSA metilato.

Gli effetti positivi della riduzione del gonfiore sono ulteriormente confermati dall'imaging Micro-CT ad alta risoluzione della ridotta perdita ossea osservata nelle ginocchia trattate con trasferimento cellulare rispetto agli animali di controllo iniettati solo con MBSA. Una volta arruolate, queste procedure approfondite possono essere completate in sei settimane se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa tecnica, è importante ricordare di indurre la differenziazione imbevuta delle IPSC trasdotte dall'antigene TCR-FoxP3.

Seguendo questa procedura, diversi composti di citochine soppressive possono anche essere deliberati per rispondere a ulteriori domande sulla sopravvivenza e la qualità delle cellule T reg delle IPSC antigene-specifiche. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia cellulare per esplorare il ruolo delle cellule T regolatorie antigene-specifiche nelle malattie autoimmuni. Non dimenticare che lavorare con i bactor diretti della carrozzeria può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come lavorare in una struttura di base a due, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di una procedura.

Grazie per l'attenzione e buona fortuna con il tuo esperimento.