Name: Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Impara a generare cellule T regolatorie antigene-specifiche da iPSC per immunoterapia contro l'artrite autoimmune. Questo metodo produce cellule uniformi per applicazioni cliniche.

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Questo progetto è stato finanziato, in parte, sotto sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01AI121180, R21AI109239 e K18CA151798), l&#39;American Diabetes Association (1-16-IBS-281), e il Dipartimento della Salute della Pennsylvania (tabacco Settlement Funds) a JS

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<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).</li>
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<li>Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3+and+Bcl-xL+cooperatively+promote+regulatory+T+cell+persistence+and+prevention+of+arthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development.</a> Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat Med. 16, 475-482 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, un passaggio fondamentale è la differenziazione in vitro di TCR / FOXP3 iPSCs gene-trasdotte. In vitro Notch induce lo sviluppo verso la linea cellulare T. Per differenziare iPSCs in CD4 + FoxP3 + Tregs, abbiamo utilizzato le cellule B OP9-DL1 / DL4 / Ia, altamente espressa molecole MHC II (IA b). La maggior parte dei iPSCs differenziano in cellule CD4 +. Tuttavia, dopo l&#39;espressione del TCR di superficie, molte cellule pr...

L'artrite autoimmune è una malattia sistemica caratterizzata da iperplasia del tessuto sinoviale e progressiva distruzione della cartilagine articolare, dell'osso e dei legamenti1. La generazione o la funzione difettosa delle Treg nell'artrite autoimmune contribuisce all'infiammazione cronica e al danno tissutale perché le Treg svolgono un ruolo cruciale nel prevenire lo sviluppo di cellule immunitarie auto-reattive. 
La manipolazione delle Treg è una strategia ideale per lo sviluppo di terapie per sopprimere l'infiammazione in modo Ag-dipendente. Per l'immunoterapia a base di Treg, la specificità delle Treg trasferite è importante per il trattamento dell'autoimmunità in corso2. Per esibire l'attività soppressiva, le Treg devono migrare ed essere trattenute nella regione colpita, il che può essere diretto dalla specificità del TCR per l'Ag in quella posizione3. Sebbene le Treg policlonali possano contenere una piccola popolazione contenente questa specificità Ag dai loro TCR, il numero di queste Treg Ag-specifiche è solitamente basso. Di conseguenza, le terapie cellulari che utilizzano Treg policlonali contro le malattie autoimmuni richiedono il trasferimento adottivo di un gran numero di Treg4,5. Poiché le cellule staminali pluripotenti (PSC) hanno la capacità di svilupparsi in qualsiasi tipo di cellula, le PSC-Treg Ag-specifiche possono rivelarsi buoni candidati per l'immunoterapia basata sulle Treg. Studi precedenti hanno dimostrato il successo dello sviluppo di cellule T derivate da PSC, tra cui le Treg6-8. 
Qui, descriviamo un protocollo per sviluppare iPSC-Treg specifici per l'Ag. Descriviamo inoltre una terapia cellulare dell'artrite autoimmune in un modello murino utilizzando tali Treg. Questo metodo si basa sulla modifica genetica di iPSC murine con TCR Ag-specifici e il fattore trascrizionale FoxP3. Le iPSC ingegnerizzate si differenziano quindi in Treg Ag-specifiche sulle cellule stromali OP9 che esprimono le molecole Notch ligando DL1, DL4 e MHC-II (I-Ab) in presenza di citochine mFlt3L e mIL-7. Queste iPSC-Treg Ag-specifiche possono produrre citochine soppressive, come TGF-β e IL-10, quando stimolate con l'Ag, e il trasferimento adottivo di tali Treg ha la capacità di sopprimere lo sviluppo di AIA in un modello murino. Il protocollo descritto può essere utilizzato per sviluppare Treg Ag-specifiche derivate da cellule staminali per potenziali interventi terapeutici.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6j topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-CD3 (2C11)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28 (37.51) anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (GK1.5) Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 ( 53&ndash; 6.7) anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD25 (3C7)</td><td>Biolegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR-&beta; (H57597) anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Scienza integrata</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampone di lisi</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Attenzione: Allergenico, Carcenogeno, Tossico</td></tr><tr><td>Tampone di permeabilizzazione</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ova-albumina</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner recur</td><td>Braintree scientific</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule t regolatorie contro autoimmunità

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Malattie autoimmuni insorgono a causa della perdita di immunologica auto-tolleranza. cellule T regolatorie (Tregs) sono importanti mediatori di immunologica auto-tolleranza. Tregs rappresentano circa il 5 - 10% del maturo sottopopolazione di cellule T CD4 + in topi e nell&#39;uomo, con circa 1 - 2% di tali Tregs circolanti nel sangue periferico. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) possono essere differenziati in Tregs funzionale, che hanno un potenziale da utilizzare per le terapie a base di cellule di malattie autoimmuni. Qui, vi presentiamo un metodo per sviluppare antigene (Ag) Treg specifico d&#39;da iPSCs (vale a dire, IPSC-Tregs). Il metodo si basa sulla incorpora il fattore di trascrizione FoxP3 e un recettore delle cellule T Ag-specifica (TCR) in iPSCs e differenziazione di cellule stromali OP9 esprimenti Notch ligandi delta-simili (DL) 1 e DL4. A seguito di differenziazione in vitro, l&#39;IPSC-Treg esprimono CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, e Ag-specifici TCR e sono in grado di rispondere alla stimolazione Ag.Questo metodo è stato applicato con successo a terapia cellulare di artrite autoimmune in un modello murino. trasferimento adottivo di questi Ag-specifici iPSC-Tregs in artrite Ag-indotta (AIA) topi -bearing ha la capacità di ridurre l&#39;infiammazione articolare e gonfiore e per prevenire la perdita ossea.

Come mostrato qui, il giorno 28, Ag-specifica Treg espresso sostanzialmente CD3 e Ag-specifica TCR, due marcatori di cellule T. La popolazione CD3 + TCRVβ5 + CD4 espresso. La maggior parte delle cellule CD3 + TCRVβ5 + CD4 + CD25 espresse anche, CD127, e CTLA-4, che sono tipicamente espressi a livelli elevati nel naturale REGS T (nTregs) e nelle cellule T che esprimono FoxP3 ectopica. Espressione FoxP3 nelle cellule iPSC-de...

Presentiamo qui un metodo per sviluppare cellule T regolatorie (Treg) specifiche per l'antigene funzionale (Ag) da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) per l'immunoterapia dell'artrite autoimmune in un modello murino.

Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è sviluppare un nuovo metodo per generare cellule T regolatorie derivate da cellule staminali associate all'articolazione infiammata, per l'immunoterapia contro l'artrite autoimmune. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'autoimmunità riguardo a potenziali immunoterapici per l'artrite autoimmune. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule T regolatorie derivate da cellule staminali sono fenotipizzate e di un singolo tipo.Iniziare diluendo le cellule feeder di interesse fino a una densità minima di 1 × 10⁴ cellule per centimetro quadrato in mezzo OP9, e seminando 1 × 10⁶ cellule feeder per piastra da 10 centimetri. Quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%, rimuovere il mezzo dalle colture e seminare da 0,5 a 1 × 10⁵ cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) transdotte con retrovirus in mezzo OP9 in ciascuna piastra. Cinque giorni dopo, aspirare il mezzo e lavare le cellule con 10 millilitri di PBS.Quindi, staccare le cellule con quattro millilitri di tripsina per piastra, a 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, arrestare le reazioni con otto millilitri di mezzo IPSC e raccogliere le cellule per la centrifugazione. Risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo IPSC fresco e ripiastrare le cellule su nuove piastre da 10 centimetri.Lasciare che le cellule feeder aderiscano alla piastra per 30 minuti nell'incubatrice per colture cellulari. Successivamente, raccogliere le IPSC in sospensione e filtrare le cellule transdotte attraverso un filtro da 70 micron per il conteggio. Seminare cinque volte 10 alla quinta IPSC su una piastra fresca di cellule feeder al 80-90% di confluenza in mezzo OP9 integrato con Murine-Flt3-Ligand e reinserire le colture nell'incubatrice.Dopo tre giorni, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per lavare la piastra con il mezzo di coltura. Quindi, aggiungere cinque millilitri di mezzo OP9 fresco alla piastra e lavare delicatamente le IPSC semiadherenti mediante pipettaggio accurato e deciso, senza disturbare lo strato di cellule feeder. Ripetere il lavaggio con 10 millilitri di PBS per raccogliere le ultime cellule semiadherenti, raccogliendo i lavaggi di ogni piastra in un singolo tubo conico per ogni coltura.Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere i pellet in 10 millilitri di mezzo OP9 integrato con Murine-Flt3-Ligand e IL-7 e filtrare le cellule attraverso un filtro da 70 micron. Seminare un cultivo di IPSC per pozzetto in una piastra da coltura a sei pozzetti contenente monocapotti di cellule feeder al 80-90% di confluenza e reinserire le colture in co-coltura nell'incubatore. Ogni due giorni, sostituire metà del mezzo con mezzo OP9 fresco integrato con Murine-Flt3-Ligand e IL-7 ed ogni quattro-sei giorni, riseminare le IPSC in differenziamento su nuove piastre con un nuovo strato di cellule feeder, se necessario.Iniziare staccando le colture cellulari di interesse con la tripsina e risospendendo ogni tipo cellulare in 10 millilitri di mezzo fresco. Piastrare ciascuna coltura cellulare in una nuova piastra da 10 centimetri e lasciare che le cellule feeder aderiscano nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 30 minuti, raccogliere le iPSC in sospensione e passare le colture attraverso filtri cellulari da 70 micron separati per rimuovere gli aggregati cellulari prima del conteggio.Risospendere ogni coltura a una concentrazione di 1,5 volte 10 alla settima cellule per millilitro in PBS freddo, filtrando nuovamente se necessario. Successivamente, posizionare topi femmine C57BL/6 di quattro-sei settimane di età, uno alla volta, in un contenitore per piccoli animali e trasferire in modo adottivo 200 microlitri di un tipo di cellula per topo nella vena della coda di ciascun animale. Utilizzare un calibro con quadrante per misurare il gonfiore di entrambe le ginocchia al fine di stabilire la misurazione di base.Dieci giorni dopo il trasferimento cellulare, utilizzare una siringa da un millilitro per iniettare nei topi 100 microgrammi di BSA metilata emulsionata in adiuvante di Freund completo alla base della coda di ciascun animale sperimentale. Diciassette giorni dopo il trasferimento cellulare, indurre l'artrite mediante iniezione intra-articolare di 20 microgrammi di BSA metilata in 10 microlitri di PBS nell'articolazione del ginocchio sinistro e di 20 microgrammi di BSA metilata e 100 microgrammi di ovoalbumina totale in 10 microlitri di PBS nell'articolazione del ginocchio destro di ciascun animale anestetizzato sottoposto a trasferimento adottivo. Sette giorni dopo l'induzione dell'artrite, misurare nuovamente i ginocchi per il calcolo della percentuale di aumento del diametro del ginocchio ed escindere chirurgicamente le rotule.Fissare le articolazioni in formalina. Successivamente, dopo la decalcificazione in EDTA, includere le ginocchia in paraffina ed ottenere sezioni di quattro micron per la colorazione istochimica e l'analisi. Al giorno 28, le cellule T regolatorie specifiche per l'antigene esprimono livelli significativi di CD3 e recettori specifici per cellule T diretti contro l'antigene.La maggior parte di queste cellule esprime anche CD25, CD127 e CTLA-4, molecole che sono tipicamente espresse a livelli elevati nelle cellule T regolatorie naturali. Effettivamente, FoxP3 persiste nelle cellule T regolatorie derivate da IPSC, anche dopo una stimolazione prolungata in vitro con il ligando Notch, come rilevato mediante colorazione intracellulare. Inoltre, queste cellule T regolatorie derivate da IPSC, specifiche per l'antigene, producono citochine soppressive quando stimolate con splenociti caricati con antigene in vitro, indicando un potenziale fenotipo soppressivo per queste cellule.Le cellule positive per FoxP3 sono osservate nei ginocchi trattati con OVA, mentre non si evidenziano cellule positive per FoxP3 nei ginocchi che ricevono IPSC trasdotti con vettore controllo. Inoltre, si osservano molte più cellule positive per CD4, positive per FoxP3 e positive per TCR3 Beta 5 nei ginocchi dei topi che ricevono IPSC trasdotti con il vettore TCR-FoxP3, rispetto a quelli trattati con il vettore FoxP3 da solo, suggerendo che le cellule IPSC-Treg specifiche per l'antigene migrano verso il ginocchio affetto da artrite indotta dall'antigene dopo il loro trasferimento adottivo negli animali riceventi. Il trasferimento adottivo di cellule derivate da IPSC determina anche una notevole riduzione del gonfiore infiammatorio del ginocchio in presenza di OVA, ma non ha alcun effetto sui ginocchi iniettati con BSA metilata di controllo.Gli effetti positivi della riduzione del gonfiore sono ulteriormente confermati da immagini Micro-CT ad alta risoluzione che mostrano una minore perdita ossea nei ginocchi trattati con trasferimento cellulare rispetto agli animali di controllo iniettati solo con MBSA. Una volta organizzata, questa procedura approfondita può essere completata in sei settimane se eseguita correttamente. Nel tentativo di applicare questa tecnica, è importante ricordare di indurre la differenziazione indotta dei iPSC transdotti per l'antigene TCR-FoxP3.Seguendo questa procedura, si possono prendere in considerazione diversi composti di citochine soppressive per rispondere ad ulteriori domande riguardo alla sopravvivenza e alla qualità delle cellule T reg IPSC specifiche per l'antigene. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia cellulare per esplorare il ruolo delle cellule T regolatorie specifiche per l'antigene nelle malattie autoimmuni. Non dimenticare che lavorare con fattori autocrini diretti può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come operare in un laboratorio a doppia sicurezza, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di una procedura.Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato per generare e testare cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano (CAR Tregs).

Generazione di cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano

Impara a generare cellule T regolatorie antigene-specifiche da iPSC per immunoterapia contro l'artrite autoimmune. Questo metodo produce cellule uniformi per applicazioni cliniche.

Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

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