Name: Un approccio Facile ed efficiente per la produzione di micelle reversibile Disulfide Croce-linked (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Scopri la sintesi di micelle reticolate con disolfuro caricate con farmaci per il rilascio mirato in terapia oncologica. Questo metodo efficiente utilizza l'ossidazione mediata da perossido di idrogeno per produrre nanoformulazioni stabili su larga scala.

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Gli autori ringraziano la signora Alisha Knudson per l'aiuto editoriale. Desiderano inoltre riconoscere il sostegno finanziario del NIH/NCI (3R01CA115483, a K.S.L.), del DoD PRMRP Award (W81XWH-13-1-0490, a K.S.L.), del NIH/NCI (1R01CA199668, a Y.L.) e del NIH/NICHD (1R01HD086195, a Y.L.).

Etica dichiarazione: Female atimici topi nudi (ceppo Nu / Nu), 6-8 settimane di vita, sono stati acquistati e poi mantenuto in condizioni esenti da organismi patogeni secondo le linee guida AAALAC e sono stati autorizzati a acclimatarsi per almeno 4 giorni prima di qualsiasi esperimenti. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali e secondo il protocollo n 07-13.119 e n 09-15.584, approvato dal Uso e cura degli animali comitato consultivo amministrativo presso l&#39;Università della California, Davis. 1. Sintesi di TD PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 <ol><li> In un pallone a fondo tondo, sciogliere MeO-PEG 5K -NH 2 (2 g, 0,4 mmol) in 10-20 ml di dimetilformammide anidra (DMF) e raffreddare su ghiaccio. </li><li> In un bicchiere di vetro, sciogliere 3 equiv. di 1-idrossi-6-cloro-benzotriazolo (HOBt), 3 equiv. di N, N &#39;-diisopropylcarbodiimide (DIC), e 3 equiv. di (Fmoc) 2 Lys-OH in anidra DMF (10-15 ml). Mescolare per 15-20 minuti su una piastra di agitazione magnetica. </li><li> Aggiungere la miscela al pallone di reazione contenente il MeO-PEG 5K -NH 2. Rimuovere il bagno di ghiaccio e mescolare la miscela di reazione per una notte a temperatura ambiente. </li><li> Conferma il completamento della reazione con cromatografia su strato sottile (TLC) 16 e il test Kaiser 17 (un colore giallo indica l&#39;assenza di connessione NH 2). Precipitare il prodotto polimerico 1 (MeO-PEG 5K -Lys (NH-Fmoc) 2) aggiungendo circa 200 ml di etere ghiacciata al pallone di reazione. Separare il polimero precipitato mediante centrifugazione (6 min a 6000 xg e 4 ° C). <ol><li> Per eseguire TLC, individuare i campioni su piastre TLC di gel di silice rivestite. Utilizzare diclorometano / metanolo (9: 1) come fase mobile. Osservare i punti sotto una lampada UV dopo aver sviluppato le piastre TLC. Si può anche utilizzare ninidrina reagente colorazione di visualizzare i punti di ammine su un piatto caldo. </li><li> per KaiIl test di ser, mettere un po &#39;del campione in tubo di vetro contenente il reagente del Kaiser. Riscaldare a 100 ° C per 5 min e cercare il cambiamento di colore (se il colore della soluzione rimane giallo, poi la reazione è completa). </li></ol></li><li> Re-sciogliere il prodotto in DMF anidra (10-20 ml) e ripetere la precipitazione e centrifugazione (vedi punto 1.4). </li><li> Ripetere il passaggio 1.5, e poi lavare il precipitato polimero tre volte con etere ghiacciata. </li><li> Trasferire il precipitato polimero 1 ad un pallone di reazione pulito e collegare il pallone ad una sorgente alto vuoto per rimuovere l&#39;etere residuo. </li><li> Preparare e aggiungere circa 20-30 ml di 20% (v / v) 4-metilpiperidina in DMF al polimero intermedio 1. Mescolare fino a completa dissoluzione. Eseguire la reazione per 3 ore. </li><li> Eseguire TLC 16 e il test di Kaiser (un colore blu conferma la presenza del libero NH 2) 17 (vedi punto 1.4) per confermare la completion della reazione. Se la reazione è completa, procedere alla precipitazione etere, come detto per 1 prodotti (passaggi 1.4-1.6). </li><li> Asciugare il prodotto polimerico 2 (MEO-PEG 5K -Lys (NH 2) 2) sotto vuoto. </li><li> Effettuare un altro round di (Fmoc) 2 Lys-OH-innesto sulla intermedio 2 (passi 1,1-1,7) per generare prodotto 3 (MEO-PEG 5K -Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). De-protegge (passaggi 1,8-1,10) i gruppi Fmoc (4, MEO-PEG 5K -Lys (Lys (NH 2) 2) 2) e di coppia (passaggi 1,1-1,7) il (Fmoc) Lys (Boc) -OH a generare una terza generazione polilisina dendritiche (5, MeO-PEG 5k -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) terminato con quattro gruppi Boc e Fmoc su una estremità della catena PEG. </li><li> Trasferire il polimero risultante intermedio 5 ad un pallone di reazione. in quantopallone di reazione eparate, preparare 1: 1 (v / v) di acido trifluoroacetico (TFA) in diclorometano (DCM). Aggiungere 15-20 ml di una miscela 1: 1 TFA / DCM (v / v) al polimero intermedia 5. Mescolare la miscela fino il polimero è completamente sciolto. Mescolare per un supplemento di 3 ore. </li><li> Eseguire TLC 16 e il test di Kaiser (un colore blu conferma la presenza di libera NH 2) 17 (vedere la fase 1.4) per confermare il completamento della reazione. Se la reazione è completa, evapora la miscela di polimero in TFA / DCM aria fino ad ottenere una soluzione viscosa. Procedere alla precipitazione dell&#39;etere, come detto per il prodotto 1 (passaggi 1.4-1.6). Asciugare il prodotto polimerico 6 (MEO-PEG 5k -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (NH 2)), 4) sotto vuoto. </li><li> Polimero di trasferimento intermedio 6 in un pallone di reazione. Utilizzare circa 40 ml di DMF anidra contenente 8 equiv. di N, N -diisopropylethylamiNE (DIEA) per sciogliere il polimero intermedio 6. In un bicchiere di vetro, sciogliere 12 equiv. di HOBt, 12 equiv. di DIC, e 12 equiv. di (Fmoc) Cys (Trt) -OH in 20-25 ml di DMF anidra. Agitare per 10-15 min, e quindi aggiungere la miscela di reazione al pallone di reazione contenente 6. Eseguire la reazione durante la notte. </li><li> Confermare il completamento della reazione con TLC 16 e il test di Kaiser (vedi punto 1.4; un colore giallo indica l&#39;assenza del libero NH 2) 17. Se la reazione è completa, procedere alla precipitazione etere, come detto per il prodotto 1 (step 1.4-1.6), per isolare prodotto 7 (MEO-PEG 5K -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4. </li><li> Eseguire Fmoc de-protezione sulla 7, come descritto nel passaggio 1.8, per ottenere prodotti 8 (PEG 5K -Lys-Lys 2 - (Lys (NH 2) - (Cys (NH 2) (Trt))) 4). Coppia (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH (linker &quot;Ebes&quot;, 24 equiv.) Su un giunto di polimero intermedio utilizzando la procedura descritta sopra per HOBt / DIC-mediata per ottenere intermedio 9 (MEO-PEG 5K -Lys-Lys 2 -Lys 4 - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8). </li><li> Eseguire un altro round di Fmoc de-protezione (passi 1,6-1,8) per ottenere intermedio 10 (MEO-PEG 5K -Lys-Lys 2 -Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH 2)), 8). </li><li> Trasferire il polimero intermedio 10 in un pallone di reazione e aggiungere DMF anidra (circa 30-40 ml) per dissolverlo. In un altro pallone di reazione, sciogliere 24 equiv. di CAOSu (preparato secondo la procedura precedentemente pubblicata) in DMF anidra (20-30 ml) 18. Aggiungere 48 equiv. di N, N -diisopropylethylamine e lasciate mescolare per 10-15 minuti. Trasferire il contenuto nel pallone di reazione contenente 10 e consentire l&#39;esecuzione di reazione overnight. </li><li> Confermare il completamento della reazione con TLC 16 e il test di Kaiser (vedi punto 1.4; un colore giallo indica l&#39;assenza del libero NH 2) 17. Se la reazione è completa, procedere alla precipitazione etere, come detto per il prodotto 1 (passi 1,4-1,6) per isolare prodotti 11 (MEO-PEG 5K -Lys-Lys 2 -Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dializzare in acqua deionizzata e liofilizzare il campione fino ad ottenere una polvere bianca. </li><li> Posizionare il polimero intermedio 11 in un pallone di reazione. Preparare e aggiungere 20 ml di TFA / 1,2-etanditiolo (EDT) / trietilsilano (TIS) / H 2 O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, v / v) composto nella soluzione polimerica. Mescolare la miscela fino a completa dissoluzione. Eseguire la reazione per 4 ore. Conferma il completamento della reazione mediante TLC 16. </li><li> Sotto la cappa, soffiare aria nel polimero-TFA / EDT / TIS / H 2O miscela fino a quando la soluzione diventa viscosa. Procedere alla precipitazione etere, come detto per il prodotto 1 (passi 1,4-1,6), per isolare il prodotto finale, 12 (PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8). Sciogliere in acetonitrile e liofilizzare per produrre una polvere bianca. </li></ol> 2. Preparazione delle micelle PTX-caricati <ol><li> Preparare un PTX-caricato PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 micelle utilizzando il metodo di evaporazione standard. <ol><li> Sciogliere 20 mg di TD con una diversa quantità di PTX (1-9 mg) in 1 ml di cloroformio (CHCl 3). Rimuovere il solvente usando un evaporatore rotante per ottenere una omogenea, film di polimero secco. Ricostituire il film con 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) di vortice, seguita da sonicazione per 30 min a 40 kHz, se necessario, per consentire la formazione di micelle droga-caricato. </li><li> Aggiungere 6 ml di 3% (w / w) H 2 O 2 (1 equiv. Di free i gruppi tiolici) per ossidare i gruppi tiolici sul TD. Utilizzare la soluzione micellare per un&#39;ulteriore caratterizzazione volta che il livello di gruppi tiolici liberi rimane a bassi valori costanti, come indicato dal test di Ellman 19. </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 micron per sterilizzare il campione. Analizzare la quantità di farmaco caricata in micelle in un sistema HPLC 20 dopo aver rilasciato i farmaci dalle micelle aggiungendo 9 volte acetonitrile ed eseguendo 10 min di sonicazione. Utilizzare una colonna C18 per HPLC con acetonitrile / acqua come fase mobile. </li><li> Calcolare il caricamento del farmaco secondo la curva di calibrazione tra i valori di area HPLC e le concentrazioni del farmaco standard 11. NOTA: L&#39;efficienza di carico è definito come il rapporto tra medicinale caricati nelle micelle per il contenuto iniziale di droga. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazioni di micelle <ol><li> Misurare le dimensioni e le dimensioni distribuzione del micelles con uno strumento 29 dispersione della luce dinamica (DLS). Eseguire le misurazioni a temperatura ambiente e mantenere la concentrazione micellare a 1 mg / ml. NOTA: Per eseguire analisi granulometrica, usare PBS come vuoto, e quindi registrare la dimensione delle particelle per campioni reali. Prendere le letture in triplice copia per i campioni, e quindi la media delle letture. </li><li> Utilizzare spettri di fluorescenza per misurare la concentrazione micellare critica (CMC) di PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 prima e dopo reticolazione con pirene come una sonda fluorescente idrofoba, come descritto in precedenza 13,21. NOTA: Tipicamente, la concentrazione micellare varia da 5 × 10 -7 a 5 × 10 -4 M. </li></ol> 4. La stabilità di micelle in SDS, con o senza agenti riducenti <ol><li> Preparare soluzioni di dodecil solfato di sodio soluzione (SDS) (7,5 mg / ml) e disolfuro micelle cross-linked (1,5 mg / ml) in PBS. Avanti, ucantare soluzioni madre, fare una miscela soluzione in cui la concentrazione finale SDS è a 2,5 mg / ml e la concentrazione micellare è a 1,0 mg / ml. </li><li> Misurare la distribuzione delle dimensioni e la dimensione (di cui al punto 3.1) delle soluzioni micellari a intervalli di tempo prefissati, con o senza la presenza di 10 mM glutatione (GSH). </li></ol> 5. emolisi Assay <ol><li> Valutare il potenziale emolitica di micelle PTX-caricato, non reticolato (PTX-MNC) preparato secondo la procedura precedentemente pubblicato 11 e micelle reticolate PTX-caricati (PTX-DCMS) utilizzando sangue fresco citratato da topi nudi raccolti dalla coda velo. <ol><li> Raccogliere globuli rossi per centrifugazione del campione di sangue (1,0 ml) a 1000 xg per 10 min, lavarli tre volte con PBS, e quindi risospendere il pellet di cellule con PBS ad una concentrazione finale del 2%. </li></ol></li><li> Miscelare 200 ml di sospensione di eritrociti con differenti concentrazioni (0,2 e 1,0mg / ml) di PTX-MNC e PTX-DCMs, rispettivamente, e incubare per 4 ore a 37 ° C in un agitatore incubatore. </li><li> Centrifugare le miscele micelle-eritrociti a 3.000 g per 5 min. Trasferire 100 pl del supernatante di tutti i campioni ad una piastra a 96 pozzetti. Misurare l&#39;assorbanza di emoglobina libera nel surnatante a 540 nm utilizzando un lettore di micro-plate. NOTA: globuli rossi incubati con Triton-100 (2%) e PBS devono essere utilizzati come controlli positivi e negativi rispettivamente. L&#39;emolisi dei globuli rossi per cento è calcolato con la seguente formula: RBC emolisi = (OD campione - OD controllo negativo) / (controllo OD positivo - OD controllo negativo) × 100%. </li></ol>

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<li>Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf">http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf</a> (2006).</li>
</ol>

Y. Li e K.S.L. sono gli inventori di un brevetto in attesa di brevetto sui sistemi micellari reversibili reversibili (domanda di brevetto USA 61/485,774). K.S.L. è lo scienziato fondatore di LamnoTherapeutics Inc., che prevede di sviluppare i nanoterapeutici descritti nel manoscritto. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Diverse le nanoparticelle sono stati studiati per il loro uso potenziale nella somministrazione di farmaci. doxorubicina liposomiale e paclitaxel (PTX) MOLLA umani di albumina sierica nano-aggregati sono tra le nanotherapeutics approvati dalla FDA per il trattamento del cancro. Tuttavia, anche se clinicamente efficace, entrambi questi nanotherapeutics sono relativamente &quot;grandi&quot; dimensioni, e tendono ad accumularsi nel fegato e polmoni. micelle polimeriche con dimensioni delle particelle relativamente più picc...

La nanotecnologia è un campo in rapida emergente che ha beneficiato di un certo numero di settori biomedici 1. Nanoparticelle forniscono opportunità per la progettazione e la sintonizzazione proprietà che non sono realizzabili con altri tipi di terapie convenzionali. Nano-vettori migliorano la stabilità di farmaci contro la biodegradazione, prolungare il tempo di circolazione di droga, a superare i problemi di solubilità di droga, e può essere messa a punto per la somministrazione di farmaci mirati e per gli agenti di imaging co-fornitura di 1,2. sistemi di consegna di nanoparticelle a base di promettenti nella diagnostica per immagini del cancro e nel trattamento. Vasculatures tumorali sono che perde di macromolecole e possono portare ad accumulo preferenziale di nanoparticelle che circola in siti tumorali attraverso la permeabilità migliorata ed effetto 3 ritenzione (EPR). Tra i vari nano-vettori (per esempio, liposomi, idrogel, e micelle polimeriche) che sono attivamente perseguiti come vettori di farmaci anti-cancro, micelle polimeriche hanno guadagnato vasta popolarità nel corso esimoe nell&#39;ultimo decennio 4,5. micelle polimeriche sono un sistema termodinamico che, su somministrazione endovenosa, possono potenzialmente essere diluito al di sotto della concentrazione micellare critica (CMC), che porta alla loro dissociazione in unimers. strategie di reticolazione sono stati impiegati per minimizzare la dissociazione micellare in unimers. Tuttavia, micelle eccessivamente stabilizzati possono impedire il farmaco da rilasciare ai siti bersaglio, riducendo così l&#39;efficacia terapeutica complessiva. Diversi approcci chimici sono stati esplorati per rendere la reticolazione degradabili in risposta redox o agli stimoli esterni, quali ponti disolfuro riducibili 6,7 e pH-cleavable 8 o estere idrolizzabile legami 9,10. Abbiamo già riferito la progettazione e la sintesi di nanoparticelle micellari costituiti da acido colico dendritiche (CA) blocchi e glicole polietilene lineare (PEG) copolimeri, denominato telodendrimers (TD) 11-15 </sup&gt;. Questi TDs sono rappresentati come PEG nK -CAy (dove n = peso molecolare in kilodaltons (K), y = numero di acido colico (CA) unità). Essi sono caratterizzati dalla loro piccole dimensioni, shelf lunga durata ed alta efficienza in farmaci incapsulamento come paclitaxel (PTX) e doxorubicina (DOX) nel core idrofobico. I blocchi di TD, come PEG, lisina, e CA, sono biocompatibili, e la presenza di una corona PEG possono conferire un carattere &quot;stealth&quot; nanoparticelle, impedendo l&#39;assorbimento non specifico di nanoparticelle micellari dai sistemi reticoloendoteliale. polimeri lineari-dendritica tiolati possono essere facilmente generati introducendo cisteine ​​nella dendritiche dorsale oligo-lisina del nostro TD standard. Questo articolo presenta un protocollo facile per la produzione di un sistema di rilascio di farmaci micellare reversibilmente reticolato introducendo disolfuro legami incrociati nel core idrofobico di TD (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>MeO-PEG5K-NH2</td><td>Rapp Polimero</td><td>125000-2</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Fmoc)-OH</td><td>Aaptec</td><td>AFK107</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Anaspec</td><td>AS-20132</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Aapptec</td><td>AAC105</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformammide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>Etere etilico</td><td>Fisher Scientific</td><td>E134-20</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropiletilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>Corrosivo, maneggiare con cura</td></tr><tr><td>4-metil piperidina</td><td>Alfa-Aesar</td><td>L-02709</td><td></td></tr><tr><td>Ebes linker</td><td>Anaspec</td><td>AS-61924</td><td></td></tr><tr><td>Acido colico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1129</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02390</td><td>Maniglia all'interno della cappa aspirante. Candeggiare i guanti dopo l'uso.</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio (anidro)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno 30%</td><td>Aaron Industries</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HoBt-Cl</td><td>Aaptec</td><td>CXZ096</td><td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125407</td><td></td></tr><tr><td>Topi nudi amimici femmina (ceppo Nu/Nu), 6&ndash; 8 settimane di età</td><td>Harlan (Livermore, CA)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un approccio facile ed efficiente per la produzione di micelle reversibile disulfide croce-linked

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

La nanomedicina è una forma emergente di terapia che sfrutta le proprietà uniche di particelle che sono nanometri di scala per applicazioni biomediche. Migliorare la somministrazione di farmaci per massimizzare i risultati terapeutici e per ridurre gli effetti collaterali farmaco-associati sono alcuni dei capisaldi della odierna nanomedicina. Nanoparticelle, in particolare, hanno trovato una vasta applicazione nel trattamento del cancro. Le nanoparticelle che offrono un elevato grado di flessibilità nella progettazione, applicazione e produzione basata sul microambiente tumorale sono progettati per essere più efficace con rapida traduzione in pratica clinica. Il polimerico micellare nano-vettore è una scelta popolare per le applicazioni di consegna della droga. In questo articolo, si descrive un protocollo semplice ed efficace per sintetizzare, micelle reticolati disolfuro droga caricata sulla base del auto-assemblaggio di un copolimero ben definito amphiphilic lineare dendritiche (telodendrimer, TD). TD è composto da polietilene glycol (PEG) come il segmento idrofilo e un gruppo di acido colico tiolati come idrofobico frazione stepwise divisoria formazione nucleo a un PEG ammina-terminato con la soluzione basata chimica dei peptidi. I farmaci chemioterapici, quali paclitaxel (PTX), possono essere caricati utilizzando un metodo di evaporazione del solvente standard. L&#39;ossidazione mediata O 2 è stato precedentemente utilizzato per formare intra-micellari disolfuro cross-link da gruppi tiolo liberi sul TD. Tuttavia, la reazione è lenta e non fattibile per produzione su larga scala. Recentemente, un metodo di ossidazione H 2 O 2 mediata è stata esplorata come un approccio più fattibile ed efficiente, ed era 96 volte più veloce rispetto al metodo precedentemente riportato. Usando questo approccio, 50 g di PTX-caricati, disolfuro nanoparticelle reticolati sono stati prodotti con successo con ristretta distribuzione granulometrica ed efficienza elevato carico di droga. La stabilità della soluzione micellare risultante viene analizzato usando condizioni di interferenza come co-incubazione with un dodecil solfato di detersivo, di sodio, con o senza un agente riducente. Le micelle, disolfuro reticolati droga-caricato dimostrato attività meno emolitica rispetto alle loro controparti non-cross-linked.

Preparazione e caratterizzazione di micelle, Disulfide Cross-legati Drug-caricato Anfifilici polimeri PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 è un polimero dendritico in grado di formare un sistema micellare disolfuro reticolato per la consegna farmaco antitumorale. Strutturalmente, è definito come un oligomero dendritica di acido colico (dominio idrofobico) collegati ad una estremità della molecola lineare PEG...

Per somministrare farmaci antitumorali ai siti tumorali con elevata specificità ed effetti collaterali ridotti, sono necessari nuovi metodi basati su nanoparticelle. Qui, descriviamo micelle reticolate disolfuro che possono essere facilmente preparate mediante ossidazione mediata da perossido di idrogeno e sono in grado di dissociarsi in modo efficiente in un ambiente tumorale riducente per rilasciare carichi utili.

Un approccio Facile ed efficiente per la produzione di micelle reversibile Disulfide Croce-linked

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un protocollo semplice ed efficace per la sintesi di micelle reticolate con disolfuro caricato con farmaci per la somministrazione mirata di farmaci. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo della nanomedicina. Ad esempio, come produrre efficacemente nano-formulazioni stabili.Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci consente di sintetizzare facilmente micelle reticolate con disolfuro su larga scala, il che è estremamente desiderabile per gli studi clinici sui pazienti. Per iniziare questa procedura, aggiungere due grammi di monoammina di polietilenglicole con terminazione monometilica in un pallone a fondo rotondo. Aggiungere dieci millilitri di DMF anidro per scioglierlo.Rilassati sul ghiaccio. Aggiungere tre equivalenti di idrossibenzotriazolo, tre equivalenti di CIC e tre equivalenti di lisina protetta da di-eth-moc a un pallone a fondo tondo. Quindi, aggiungi dieci millilitri di DMF anidro.Mescolare il composto per 20 minuti su una piastra di cottura magnetica. Quindi aggiungere la miscela al pallone a fondo tondo contenente glicole polietilenico con terminazione monometilica. Togliere il pallone a fondo tondo dal bagno di ghiaccio, quindi mescolare per una notte a temperatura ambiente.Una volta completata l'agitazione, confermare il completamento della reazione come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 200 millilitri di etere ghiacciato al pallone di reazione. Centrifugare a 6.000 x g per sei minuti a quattro gradi Celsius Per separare il polimero precipitato.Ripetere il processo di precipitazione e centrifugazione due volte, sciogliendo il prodotto in 10 millilitri di DMF ogni volta prima della precipitazione. Quindi lavare il polimero tre volte con etere ghiacciato. Collegare il tubo a una fonte di alto vuoto per rimuovere l'etere residuo.Successivamente, aggiungere al polimero 20 millilitri di 20%4-metilpiperidina in DMF. Mescolare fino a completa dissoluzione. Lascia che la reazione sia divertente per tre ore.Dopo aver confermato il completamento della reazione, asciugare il prodotto polimerico. Ora il polimero intermedio numero due sotto vuoto, quindi eseguire ulteriori passaggi di sintesi del polimero come descritto nel protocollo di testo. Una volta prodotto il polimero intermedio numero 10, trasferirlo in un pallone di reazione.Aggiungere 30 millilitri di DMF anidro. In un nuovo pallone sciogliere 24 equivalenti di acido colico attivato in 20 millilitri di DMF. Quindi aggiungere 48 equivalenti di N, N-diisopropiletilamina.Mescolate per 10 minuti. Al termine dell'agitazione, trasferire la miscela nel pallone di reazione contenente il polimero numero intermedio 10. Lasciare che la reazione si svolga durante la notte.Il giorno successivo confermare il completamento della reazione e precipitare il polimero intermedio numero 11, come indicato nel protocollo di testo. Quindi dializzare l'intermedio polimerico in acqua deionizzata. Liofilizzare il campione ottenendo una polvere bianca.Dopo aver preparato le micelle, sciogliere 20 milligrammi di telodendrimero e cinque milligrammi di PTX in un millilitro di cloroformio. Rimuovere il solvente utilizzando un evaporatore rotante per ottenere un film polimerico secco omogeneo. Ricostituire il film con un millilitro di PBS mediante vortex.Quindi sonicare per 30 minuti a 40 kilohertz. Aggiungere il 3% di perossido di idrogeno per ossidare i gruppi tiolici sul telodendrimmer. Eseguire ulteriori passaggi di preparazione e verifica come descritto nel protocollo di testo.Al termine della preparazione delle micelle, misurare le dimensioni e la distribuzione dimensionale delle micelle con uno strumento di diffusione dinamica della luce. Eseguire le misurazioni a temperatura ambiente e mantenere la concentrazione di micelle a un milligrammo per millilitro. Quindi preparare una soluzione madre da 7,5 milligrammi per millilitro di sodio dodecil solfato in PBS.Quindi preparare una soluzione madre da 1,5 milligrammi per millilitro di micellule reticolate di disolfuro in PBS. Utilizzando queste soluzioni madre si crea una miscela in cui la concentrazione finale di SDS è di 2,5 milligrammi per millilitro. E la concentrazione di micelle è di 1,0 milligrammi per millilitro.Caricare il campione e misurare le dimensioni e la distribuzione dimensionale della soluzione micellare a intervalli di due minuti. Dopo aver raccolto sangue citrato fresco da topi nudi, centrifugare un campione di sangue da un millilitro a 1.000 x g per 10 minuti per raccogliere i globuli rossi. Lavarli tre volte con PBS, quindi risospendere il pellet cellulare con PBS a una concentrazione finale del 2%Mescolare 200 microlitri di sospensione eritrocitaria con una soluzione di 1,0 milligrammi per millilitro di PTX NCM.Quindi mescolare 200 microlitri di sospensione eritrocitaria con una soluzione di 1,0 milligrammi per millilitro di PTX DCM. Incubare queste miscele in un agitatore incubatore per quattro ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, centrifugare le miscele a 3.000 x g per cinque minuti.Trasferire 100 microlitri di surnatante di ciascun campione in una piastra a 96 pozzetti. Successivamente, utilizzare un micro lettore di piastre per misurare l'assorbanza dell'emoglobina libera a 540 nanometri. Come misurato dal test di Ellman, il tasso di conversione dai gruppi tiolici liberi ai legami disolfuro ha raggiunto l'85% dopo 48 ore di ossidazione mediata dall'ossigeno.In questo caso, viene utilizzato un metodo di ossidazione mediata da perossido di idrogeno come metodo alternativo. Il tasso di conversione raggiunge l'88% in 30 minuti. Che è 96 volte più veloce dell'approccio mediato dall'ossigeno.Utilizzando questo approccio più efficiente, sono stati prodotti oltre 50 grammi di nanoparticelle con una dimensione delle particelle misurata di 27 nanometri con una distribuzione dimensionale ristretta. La stabilità delle micelle reticolate disufide caricate con PTX è studiata anche in condizioni di grave disgregazione delle micelle. La dimensione delle particelle delle micelle è rimasta costante nel tempo, indicando che sono rimaste intatte.Dopo l'introduzione del GSH a una concentrazione intracellulare, le micelle reticolate con disolfuro caricate con il farmaco rimangono intatte per 30 minuti, quindi diminuiscono bruscamente a un nanometro. Ciò significa la riduzione di un numero critico di legami disolfuro, un prerequisito per la rapida dissociazione delle micelle. I risultati rappresentativi dell'attività emolitica delle micelle caricate con PTX sono mostrati qui.Gli NCM PTX hanno una conta della lisi dei globuli rossi dose-dipendente. Tuttavia, i DCM PTX che hanno la reticolazione del disolfuro non mostrano attività emolitiche osservabili. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un altro se viene eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di aggiungere una quantità uguale di perossido di idrogeno al 3% per la formazione di disolfuro. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire il test di emolisi per valutare la compatibilità ematica delle micelle reticolate con disolfuro. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare efficacemente micelle reticolate con disolfuro caricato con farmaci.Non dimenticare che alcune di queste sostanze chimiche possono essere estremamente pericolose e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale.

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