Un approccio Facile ed efficiente per la produzione di micelle reversibile Disulfide Croce-linked
23 dicembre 2016
Per somministrare farmaci antitumorali ai siti tumorali con elevata specificità ed effetti collaterali ridotti, sono necessari nuovi metodi basati su nanoparticelle. Qui, descriviamo micelle reticolate disolfuro che possono essere facilmente preparate mediante ossidazione mediata da perossido di idrogeno e sono in grado di dissociarsi in modo efficiente in un ambiente tumorale riducente per rilasciare carichi utili.
L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un protocollo semplice ed efficace per la sintesi di micelle reticolate con disolfuro caricato con farmaci per la somministrazione mirata di farmaci. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo della nanomedicina. Ad esempio, come produrre efficacemente nano-formulazioni stabili.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci consente di sintetizzare facilmente micelle reticolate con disolfuro su larga scala, il che è estremamente desiderabile per gli studi clinici sui pazienti. Per iniziare questa procedura, aggiungere due grammi di monoammina di polietilenglicole con terminazione monometilica in un pallone a fondo rotondo. Aggiungere dieci millilitri di DMF anidro per scioglierlo.
Rilassati sul ghiaccio. Aggiungere tre equivalenti di idrossibenzotriazolo, tre equivalenti di CIC e tre equivalenti di lisina protetta da di-eth-moc a un pallone a fondo tondo. Quindi, aggiungi dieci millilitri di DMF anidro.
Mescolare il composto per 20 minuti su una piastra di cottura magnetica. Quindi aggiungere la miscela al pallone a fondo tondo contenente glicole polietilenico con terminazione monometilica. Togliere il pallone a fondo tondo dal bagno di ghiaccio, quindi mescolare per una notte a temperatura ambiente.
Una volta completata l'agitazione, confermare il completamento della reazione come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 200 millilitri di etere ghiacciato al pallone di reazione. Centrifugare a 6.000 x g per sei minuti a quattro gradi Celsius Per separare il polimero precipitato.
Ripetere il processo di precipitazione e centrifugazione due volte, sciogliendo il prodotto in 10 millilitri di DMF ogni volta prima della precipitazione. Quindi lavare il polimero tre volte con etere ghiacciato. Collegare il tubo a una fonte di alto vuoto per rimuovere l'etere residuo.
Successivamente, aggiungere al polimero 20 millilitri di 20%4-metilpiperidina in DMF. Mescolare fino a completa dissoluzione. Lascia che la reazione sia divertente per tre ore.
Dopo aver confermato il completamento della reazione, asciugare il prodotto polimerico. Ora il polimero intermedio numero due sotto vuoto, quindi eseguire ulteriori passaggi di sintesi del polimero come descritto nel protocollo di testo. Una volta prodotto il polimero intermedio numero 10, trasferirlo in un pallone di reazione.
Aggiungere 30 millilitri di DMF anidro. In un nuovo pallone sciogliere 24 equivalenti di acido colico attivato in 20 millilitri di DMF. Quindi aggiungere 48 equivalenti di N, N-diisopropiletilamina.
Mescolate per 10 minuti. Al termine dell'agitazione, trasferire la miscela nel pallone di reazione contenente il polimero numero intermedio 10. Lasciare che la reazione si svolga durante la notte.
Il giorno successivo confermare il completamento della reazione e precipitare il polimero intermedio numero 11, come indicato nel protocollo di testo. Quindi dializzare l'intermedio polimerico in acqua deionizzata. Liofilizzare il campione ottenendo una polvere bianca.
Dopo aver preparato le micelle, sciogliere 20 milligrammi di telodendrimero e cinque milligrammi di PTX in un millilitro di cloroformio. Rimuovere il solvente utilizzando un evaporatore rotante per ottenere un film polimerico secco omogeneo. Ricostituire il film con un millilitro di PBS mediante vortex.
Quindi sonicare per 30 minuti a 40 kilohertz. Aggiungere il 3% di perossido di idrogeno per ossidare i gruppi tiolici sul telodendrimmer. Eseguire ulteriori passaggi di preparazione e verifica come descritto nel protocollo di testo.
Al termine della preparazione delle micelle, misurare le dimensioni e la distribuzione dimensionale delle micelle con uno strumento di diffusione dinamica della luce. Eseguire le misurazioni a temperatura ambiente e mantenere la concentrazione di micelle a un milligrammo per millilitro. Quindi preparare una soluzione madre da 7,5 milligrammi per millilitro di sodio dodecil solfato in PBS.
Quindi preparare una soluzione madre da 1,5 milligrammi per millilitro di micellule reticolate di disolfuro in PBS. Utilizzando queste soluzioni madre si crea una miscela in cui la concentrazione finale di SDS è di 2,5 milligrammi per millilitro. E la concentrazione di micelle è di 1,0 milligrammi per millilitro.
Caricare il campione e misurare le dimensioni e la distribuzione dimensionale della soluzione micellare a intervalli di due minuti. Dopo aver raccolto sangue citrato fresco da topi nudi, centrifugare un campione di sangue da un millilitro a 1.000 x g per 10 minuti per raccogliere i globuli rossi. Lavarli tre volte con PBS, quindi risospendere il pellet cellulare con PBS a una concentrazione finale del 2%Mescolare 200 microlitri di sospensione eritrocitaria con una soluzione di 1,0 milligrammi per millilitro di PTX NCM.
Quindi mescolare 200 microlitri di sospensione eritrocitaria con una soluzione di 1,0 milligrammi per millilitro di PTX DCM. Incubare queste miscele in un agitatore incubatore per quattro ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, centrifugare le miscele a 3.000 x g per cinque minuti.
Trasferire 100 microlitri di surnatante di ciascun campione in una piastra a 96 pozzetti. Successivamente, utilizzare un micro lettore di piastre per misurare l'assorbanza dell'emoglobina libera a 540 nanometri. Come misurato dal test di Ellman, il tasso di conversione dai gruppi tiolici liberi ai legami disolfuro ha raggiunto l'85% dopo 48 ore di ossidazione mediata dall'ossigeno.
In questo caso, viene utilizzato un metodo di ossidazione mediata da perossido di idrogeno come metodo alternativo. Il tasso di conversione raggiunge l'88% in 30 minuti. Che è 96 volte più veloce dell'approccio mediato dall'ossigeno.
Utilizzando questo approccio più efficiente, sono stati prodotti oltre 50 grammi di nanoparticelle con una dimensione delle particelle misurata di 27 nanometri con una distribuzione dimensionale ristretta. La stabilità delle micelle reticolate disufide caricate con PTX è studiata anche in condizioni di grave disgregazione delle micelle. La dimensione delle particelle delle micelle è rimasta costante nel tempo, indicando che sono rimaste intatte.
Dopo l'introduzione del GSH a una concentrazione intracellulare, le micelle reticolate con disolfuro caricate con il farmaco rimangono intatte per 30 minuti, quindi diminuiscono bruscamente a un nanometro. Ciò significa la riduzione di un numero critico di legami disolfuro, un prerequisito per la rapida dissociazione delle micelle. I risultati rappresentativi dell'attività emolitica delle micelle caricate con PTX sono mostrati qui.
Gli NCM PTX hanno una conta della lisi dei globuli rossi dose-dipendente. Tuttavia, i DCM PTX che hanno la reticolazione del disolfuro non mostrano attività emolitiche osservabili. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un altro se viene eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di aggiungere una quantità uguale di perossido di idrogeno al 3% per la formazione di disolfuro. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire il test di emolisi per valutare la compatibilità ematica delle micelle reticolate con disolfuro. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare efficacemente micelle reticolate con disolfuro caricato con farmaci.
Non dimenticare che alcune di queste sostanze chimiche possono essere estremamente pericolose e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la sintesi di micelle caricate con farmaco e reticolate mediante legami disolfuro, progettate per il rilascio mirato di farmaci nella terapia del cancro. Il metodo utilizza l'ossidazione mediata da perossido di idrogeno per la preparazione delle micelle, che possono dissociarsi in ambienti tumorali riducenti per rilasciare il carico terapeutico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Nanomedicina
- Terapia del cancro
- Sistemi di somministrazione dei farmaci
Sfondo
- La somministrazione mirata di farmaci è fondamentale per ridurre al minimo gli effetti collaterali nel trattamento del cancro.
- Le nanoparticelle offrono un approccio promettente per consegnare i farmaci in modo specifico ai siti tumorali.
- I micelle reticolati con legami disolfuro possono essere sintetizzati per migliorare la stabilità e il rilascio del farmaco.
- L'ossidazione mediata dal perossido di idrogeno rappresenta una fase chiave nel processo di sintesi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo semplice ed efficace per la sintesi di micelle caricate con farmaco.
- Affrontare le sfide legate alla produzione di nanoformulazioni stabili per applicazioni cliniche.
- Facilitare la sintesi su larga scala di micelle per potenziali studi sui pazienti.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di polietilenglicole monoammina terminale monometilico in DMF anidro.
- Ossidazione mediata da perossido di idrogeno per la formazione di micelle.
- Caratterizzazione delle micelle per stabilità e proprietà di rilascio del farmaco.
- Valutazione delle prestazioni delle micelle in un ambiente riducente.
Risultati principali
- Sintesi riuscita di micelle reticolate con legami disolfuro.
- Le micelle hanno dimostrato un'efficace dissociazione in ambienti riducenti.
- Potenziale per il rilascio mirato di farmaci antitumorali.
- Metodo di produzione scalabile adatto per studi clinici.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato fornisce un metodo praticabile per la creazione di micelle cariche di farmaco.
- Le micelle possono aumentare la specificità del rilascio del farmaco ai tumori.
- Questo approccio potrebbe ridurre gli effetti collaterali associati alle terapie convenzionali contro il cancro.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la produzione scalabile di micelle reticolate mediante legami disolfuro per il rilascio mirato di farmaci antitumorali, affrontando un collo di bottiglia fondamentale nella traduzione della nanomedicina. Sfruttando l'ossidazione mediata da H₂O₂, il metodo raggiunge un reticolaggio 96 volte più rapido rispetto agli approcci precedenti, favorendo la producibilità su scala per studi preclinici e clinici. Le nanoparticelle risultanti dimostrano stabilità in circolo e rilascio attivato in microambienti tumorali riducenti, migliorando l'indice terapeutico e riducendo la tossicità fuori bersaglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la formulazione di farmaci citotossici come il paclitaxel in nanocarrier stabili per studi meccanicistici sul rilascio mirato ai tumori.
- Valore operativo: Permette la rapida generazione di varianti formulative per valutare le relazioni struttura-attività nella cinetica di rilascio del farmaco.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce una piattaforma riproducibile di nanoparticelle per lo screening dei profili di rilascio del farmaco in condizioni riduttive simulate del tumore.
- Valore operativo: Produce una distribuzione dimensionale ristretta (27 nm), fondamentale per prestazioni costanti nei saggi e confrontabilità regolatoria.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra un'attività emolitica ridotta rispetto alle micelle non reticolate, migliorando il profilo di sicurezza della compatibilità con il sangue.
- Valore operativo: Consente la produzione di lotti superiori a 50 g, supportando studi tossicologici e farmacocinetici finalizzati alla richiesta di autorizzazione all'immissione in commercio (IND).
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta della nanomedicina, dalla valutazione iniziale delle formulazioni fino alla validazione preclinica, consentendo una progettazione iterativa di sistemi di somministrazione sensibili al redox.
- Biologia della scoperta: Permette la verifica di ipotesi riguardo al miglioramento dell'accumulo tumorale di farmaci mediante legame disolfuro rispetto al farmaco libero.
- Screening: Fornisce micelle standardizzate con elevata efficienza di caricamento del farmaco, per una valutazione affidabile dei composti in saggi di citotossicità.
- Analisi: Produce dati quantitativi sulla dimensione e stabilità tramite saggi di diffusione dinamica della luce (DLS) e emolisi, al fine di confrontare le prestazioni delle formulazioni.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità dalla fase di scoperta a quella preclinica, confermando il rilascio attivato in ambienti intracellulari riducenti (riduzione della dimensione indotta da GSH fino a 1 nm).
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma modulare basata su telodendrimeri, adattabile a diversi carichi e ligandi di targeting.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nel rilascio del farmaco selettivo per i tumori grazie alla disassemblaggio validato in risposta allo stato redox.
- Valore operativo: Sintesi standardizzata e scalabile con controllo robusto della dimensione delle particelle e alto carico di farmaco.
- Valore strategico: Riduce il rischio di fallimento nelle fasi avanzate migliorando l'indice terapeutico mediante riduzione dell'emolisi e potenziamento del targeting tumorale.
- Impatto sul portafoglio: Consente l'avanzamento dei candidati in nanomedicina con gestione del rischio grazie a una produzione scalabile e compatibile con le buone pratiche di produzione (GMP).
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in chimica dei peptidi, nanoprecipitazione e manipolazione di polimeri sensibili al redox.
- Necessita di DMF anidro, perossido di idrogeno, dialisi e infrastrutture per la liofilizzazione per la sintesi del polimero.
- Richiede una standardizzazione intersettoriale della preparazione dei micelle e dei controlli di qualità (DLS, saggio emolitico) per ottenere lotti riproducibili.
- L'adattamento a carichi utili alternativi potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei parametri di evaporazione del solvente e di caricamento del farmaco.
- Limitazione pratica: il perossido residuo deve essere rimosso dopo l'ossidazione per prevenire la degradazione del carico utile o effetti tossici.
