Lo screening per Endocrine attività in acqua mediante disponibili in commercio In Vitro Transattivazione Bioassays

L'obiettivo generale di questa procedura standardizzata è quello di esaminare i campioni d'acqua per le sostanze chimiche attive sul sistema endocrino, utilizzando saggi cellulari basati su recettori disponibili in commercio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del monitoraggio della qualità dell'acqua, ad esempio: le sostanze chimiche attive sul sistema endocrino sono effettivamente presenti nel campione? Il vantaggio principale di questa tecnica è che può analizzare un gruppo di composti attivi endocrini molto più velocemente rispetto agli attuali metodi chimici.

Questa tecnica può aiutare a diagnosticare i problemi di qualità dell'acqua che derivano dalla presenza di sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino. Questo metodo fornisce informazioni sui contaminanti nell'acqua, ma può essere applicato anche ad altre matrici ambientali, come sedimenti e tessuti. In generale, le persone che non conoscono questa tecnica possono avere difficoltà, perché richiede un'elevata precisione quando si utilizzano le tecniche di pipettaggio.

Per iniziare questa procedura, preparare il campione d'acqua in soluzioni stock di terreno specifico per il saggio e sostanza chimica di riferimento, come descritto nel protocollo di testo. Conservare il terreno specifico del test a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Quindi, aggiungere 15 microlitri della sostanza chimica di riferimento appropriata a 285 microlitri di terreno di prova in una provetta sterile.

Miscelare il campione pipettandolo su e giù. Quindi, aggiungere 200 microlitri di DMSO al 5% nel terreno di analisi a otto provette aggiuntive. Trasferire un'aliquota da 100 microlitri dalla provetta uno alla provetta due, per iniziare una serie di diluizioni in tre direzioni.

Miscelare accuratamente il campione diluito nella provetta due con una pipetta. Quindi, trasferire un'aliquota da 100 microlitri dal tubo due al tubo tre. Continuare questo processo per ogni tubo.

Quindi, preparare un campione di controllo del solvente mescolando 10 microlitri di DMSO in 190 microlitri di terreno di prova. Quindi, raccogli ed etichetta quattro nuovi tubi. Aggiungere 95 microlitri di terreno di coltura alla prima provetta.

Quindi, aggiungere cinque microlitri di estratto d'acqua e mescolare accuratamente. Aggiungere 50 microlitri di DMSO al 5% nel terreno di analisi alle altre tre provette. Quindi, eseguire una doppia diluizione trasferendo 50 microlitri di soluzione da un tubo all'altro.

Inizia estraendo dal congelatore criogenico una fiala di cellule arrestate dalla divisione ER o GR. Scongelare rapidamente le cellule mettendo la fiala in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, agitando delicatamente per due minuti. Quindi, decontaminare la fiala con etanolo al 70%.

Collocarlo in una cabina di sicurezza biologica di classe due. Aprire la fiala utilizzando tecniche asettiche e trasferire le cellule in 10 millilitri di terreno di analisi. Centrifugare a 200 volte g per cinque minuti.

Al termine della centrifugazione, utilizzare una pipetta di vetro sterile per aspirare il surnatante. Quindi, risospendere il pellet cellulare in sei millilitri di terreno di analisi. Mescolare cinque microlitri di sospensione cellulare con cinque microlitri di soluzione colorante vitale.

Quindi, aggiungere un'aliquota in una camera di conteggio. Conta il numero di cellule vive utilizzando un microscopio ottico o un contatore automatico di cellule. Quindi, stimare la densità delle cellule vive nella sospensione cellulare.

Diluire se necessario, per ottenere una densità finale di 550.000 cellule vive per millilitro di terreno di analisi. Iniziate creando un layout di piastra che includa una curva di calibrazione specifica per il saggio a nove punti, campioni QA/QC e diluizioni multiple per ogni estratto d'acqua. Aggiungere 90 microlitri di terreno di coltura ai pozzetti di controllo liberi da cellule replicate.

Versare la sospensione cellulare in un serbatoio di pipettaggio sterile. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 90 microlitri di sospensione cellulare agli altri pozzetti. Aggiungere 10 microlitri dei campioni diluiti negli appositi pozzetti.

Coprite il piatto con un coperchio. Quindi, posizionare la piastra in un incubatore al 5% di C02 a 37 gradi Celsius per 16 ore. Una volta completata l'incubazione, lasciare che la piastra si equilibri a temperatura ambiente.

Quindi i passaggi successivi dovrebbero essere condotti in assenza di luce diretta. Preparare una soluzione di carico six x secondo le istruzioni del produttore. Quindi, aggiungere 20 microlitri della soluzione di carico a ciascun pozzetto.

Aggiungere 10 microlitri di reagente per la vitalità cellulare a ciascun pozzetto, per valutare la citotossicità dell'estratto acquoso diluito. Sigillare la piastra con pellicola adesiva in alluminio. Quindi, incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per due ore.

Una volta completata l'incubazione, aggiungere la piastra al lettore di micropiastre con capacità di lettura dal basso. Misura la fluorescenza e analizza i dati come descritto nel protocollo di testo. In questo studio, sono stati analizzati quattro campioni compositi 24 ore su 24 di acque reflue urbane trattate, sei campioni prelevati di acqua superficiale da sistemi di acqua dolce nel sud della California e un campo bianco costituito da acqua ultra pura.

L'attività dell'ER è stata rilevata in sette dei 10 campioni d'acqua rappresentativi, mentre l'attività della GR è stata rilevata in quattro. Le linee guida sulle prestazioni QA/QC per i saggi del recettore degli estrogeni e dei recettori dei glucocorticoidi possono essere visualizzate qui. I risultati dello studio per la citotossicità e la precisione del campione sono rientrati nei criteri di accettazione, convalidando le misurazioni del campione d'acqua.

Le concentrazioni equivalenti di biodosaggio più elevate sono state riscontrate negli effluenti secondari, mentre l'attività GR dell'effluente terziario è risultata inferiore al limite di rilevabilità del biodosaggio. Allo stesso modo, la maggior parte dei campioni di acque superficiali non ha mostrato attività GR al di sopra del limite di rilevamento e ha avuto livelli molto più bassi di attività ER rispetto agli effluenti secondari. La maggior parte dei campioni di effluenti degli impianti di trattamento delle acque reflue ha mostrato una risposta alla dose superiore al limite di rilevabilità sia per i biosaggi ER che per quelli GR.

I risultati rappresentativi del rapporto medio di fluorescenza blu/verde di questi campioni, confrontato con il fattore di arricchimento relativo, possono essere visti qui. Questa tecnica può essere eseguita in 24 ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo, è importante seguire tutte le linee guida QA/QC.

Questa tecnica ha spianato la strada ai manager per esplorare approcci alternativi per il monitoraggio delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino nell'acqua. Non dimenticare che lavorare con l'azide di sodio può essere pericoloso. Dovrebbero essere prese precauzioni, come lavorare in una cappa aspirante correttamente funzionante.