Name: Un semplice test di fluorescenza per la quantificazione del Canine neutrofili extracellulare Trappola di uscita (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Scopri un metodo di fluorescenza per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili canini. Questa tecnica consente lo screening rapido di agonisti e inibitori della formazione NET in medicina veterinaria.

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Gli autori ringraziano i dottori James Roth, William Nauseef e Kayoko Kimura e il signor Tom Skadow per l'assistenza nello sviluppo dei protocolli dei neutrofili canini. RDG è supportato da una Wellcome Trust Fellowship rif: WT093767MA.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con il permesso etico da parte del Comitato Istituzionale dell&#39;Università cura degli animali e Usa Iowa State. Raccolta 1. Sangue <ol><li> Disegnare 9 ml di sangue da una safena, la vena cefalica o giugulare direttamente in anticoagulante (ad esempio, l&#39;acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml di sangue) vacutainer, o in una siringa con il trasferimento immediato di provette di sangue EDTA contenenti. Delicatamente rotolare o invertire i tubi di sangue per assicurare un&#39;adeguata miscelazione del sangue e anticoagulante. </li></ol> 2. Isolamento dei neutrofili <ol><li> In una provetta conica da 50 ml, mescolare il sangue con un volume uguale di temperatura ambiente sterile 3% destrano-500 (preparati in soluzione fisiologica 0,9% sterile) delicatamente per inversione. Lasciare in piedi per 18-20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire lo strato superiore paglierino in una nuova provetta fino a che non può più essere raccolto senza contaminazione dallo strato inferiore rosso. Gli eritrociti in thtubo originale e può essere scartata. </li><li> Centrifugare il surnatante a 500 xg per 10 minuti a 4 ° C. Aspirare e scartare il surnatante. Manualmente risospendere il pellet cellulare in 10 ml di temperatura ambiente fosfato sterile salina tamponata (PBS). Si noti che vortex non deve essere utilizzato per ri-sospendere neutrofili in qualsiasi fase di questo protocollo. disegno manualmente fuori, invece di travaso surnatanti è consigliato anche in tutto il protocollo per massimizzare la resa delle cellule. </li><li> Aggiungere 10 ml di una soluzione di separazione delle cellule polysucrose temperatura ambiente e diatrizoato di sodio (ad esempio, Histopaque 1077) in una provetta conica da 50 ml. strato con attenzione la soluzione di cellule contenente sopra la soluzione di separazione delle cellule. Si noti che la soluzione separazione delle cellule usando che non ha riportati a temperatura ambiente può ridurre la resa delle cellule. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 30 min a temperatura ambiente con il freno. </li><li> Come neutrofili sono nello strato più basso del gradiente, erogare e scartare il uppeR 3 strati, composto da uno strato superiore di plasma e piastrine, una banda bianca stretta di cellule mononucleate e una chiara strato di mezzo gradiente di densità. </li><li> Per lisare ogni residuo eritrociti, risospendere il pellet neutrofili in 10 ml di acqua a temperatura ambiente. </li><li> Dopo 30 secondi, ripristinare tonicità con l&#39;aggiunta di 10 ml di temperatura ambiente sterile di sodio cloruro 1,8% e mescolare delicatamente per inversione. </li><li> Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e scartare. </li><li> Se il pellet è ancora rosso, ripetere il passaggio lisi. Se il pellet è bianco (o se lisi è già stata eseguita due volte), delicatamente risospendere le cellule in 10 ml di PBS sterile. </li><li> Contare le cellule utilizzando un contatore automatico o un emocitometro. Le rese sono almeno 10 6 cellule per ml di sangue. </li><li> Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e scartare. </li><li> Risospendere le cellule alla concentrazione desiderata in sterile temperatura ambiente PBS. for il saggio di rilascio del DNA descritta nella sezione 2, risospendere a 5 x 10 6 cellule per ml. </li><li> Se lo si desidera, trasferire un piccolo volume di cellule direttamente o tramite una citocentrifuga ad un vetrino. Consentono alle cellule a secco e macchia con una fissazione e colorazione kit rapida a seconda della fabbrica &#39;istruzioni. Se l&#39;isolamento dei neutrofili ha avuto successo, se esaminato al microscopio almeno il 95% delle cellule nucleate dovrebbe essere granulociti (neutrofili, basofili, eosinofili) con la contaminazione degli eritrociti minima. </li></ol> 3. DNA saggio di rilascio <ol><li> Impostare il test di rilascio del DNA immediatamente dopo l&#39;isolamento dei neutrofili. </li><li> Se aggregazione delle cellule è presente all&#39;esame della soluzione di riserva al microscopio ottico, passare la sospensione cellulare attraverso un filtro sterile 70 micron sterile immediatamente prima di impostare il dosaggio. </li><li> Per ogni pozzetto di test di una sterile, 96 pozzetti, aggiungere 5 x 10 4 cellule / pozzetto; agonisti e Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI) mezzo senza rosso e integrato con 0,5% di siero fetale di vitello inattivato al calore per un volume finale di 100-200 microlitri fenolo. Includere almeno due pozzetti bianchi per agonisti in cui la soluzione neutrofili stock è sostituito da un uguale volume di PBS. Si noti che la creazione di pozzetti del bianco per ogni agonista è importante escludere la contaminazione del DNA del agonisti o interferenza con l&#39;agonista con il test di fluorescenza. </li><li> Incubare a 39 ° C per 30 min in un incubatore anidride carbonica (4%). </li><li> Aggiungere agonisti a concentrazioni desiderati e un colorante cellulare impermeabile acidi nucleici. Si noti la concentrazione ottimale di colorante impermeabile cella varierà tra i diversi coloranti acidi nucleici. controlli non stimolati in cui agonisti sono sostituiti da un uguale volume di media dovrebbero essere inclusi in ogni esperimento. NOTA: E &#39;opportuno diluire agonisti dei volumi simili di terreno di coltura per mantenere condizioni coerenti tra pozzi. volumi e finale di 200 &amp;# 181; l sono stati utilizzati con successo e se questo viene alterato, ben volumi dovrebbe rimanere identica per tutte le condizioni. Forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) (concentrazione finale ≥0.1 uM) o fattore di attivazione piastrinica (PAF) (concentrazione finale ≥31 pM) possono essere utilizzati come controlli positivi. Agonisti devono essere misurati almeno in doppio. </li><li> Incubare a 39 ° C. Misurare la fluorescenza usando un lettore per micropiastre dopo 2 ore o ad intervalli desiderati. Si noti che intervalli ottimali variano con agonisti utilizzati. NOTA: Lunghezza d&#39;onda dipende colorante impiegato. </li><li> Sottrarre fluorescenza vuoto prima di calcolare la fluorescenza media. </li><li> Per consentire il confronto tra gli individui e tra le piastre, calcolare un cambiamento volte a fluorescenza dividendo la fluorescenza media dei pozzi stimolati dalla fluorescenza media dei pozzi non-stimolata. </li></ol>

<ol><li>Schiffman, J. D., Breen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+oncology%3A+what+dogs+and+other+species+can+teach+us+about+humans+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+Rl+Soc+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer.</a> Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673(2015).</li>
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<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).</li>
<li>Gray, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+conventional+protein+kinase+C+%28PKC%29+is+critical+in+the+generation+of+human+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inflamm+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps.</a> J Inflamm (Lond). 10 (1), 12(2013).</li>
<li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+cast+NETs+too%3A+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li>
<li>McCracken, J. M., Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neutrophil+apoptosis+and+lifespan+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease.</a> J Cell Death. 7, 15-23 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio di rilascio del DNA presentato è un test facilmente quantificabile per il DNA extracellulare. Il metodo è stato adattato da tecniche simili utilizzati per valutare la formazione di NET in altre specie, ma la velocità di centrifugazione, le concentrazioni di agonisti e tempi di incubazione sono state modificate per ottimizzare il metodo per l&#39;utilizzo con i neutrofili canini 8,17,18. regolazioni simili potrebbero essere fatte per adattare il metodo per le altre specie. Il test è semplice e poco c...

Ci sono oltre 70 milioni di cani negli Stati Uniti da solo 1. Come membri della famiglia stimati, questi animali spesso ricevono cure mediche taglio bordo. Altrettanto perché condividono il nostro ambiente, i cani possono fornire intuizioni nella patogenesi e nel trattamento delle malattie umane 1. Tuttavia, se traducendo scoperte in medicina umana in trattamenti veterinari o viceversa, è importante caratterizzare accuratamente variazioni specie anche in sistemi altamente conservati quali la risposta immunitaria innata. Esempi di differenze tra il cane e il sistema immunitario innato umano includono l&#39;alta espressione CD4 sui neutrofili cane 2; l&#39;assenza di un omologo funzionale del sensore flagellin citoplasmatica IPAF nei cani 3 e l&#39;espressione di un ibrido caspasi 1/4 carnivori 4. Trappole extracellulari dei neutrofili (reti) sono una componente relativamente recente scoperta di immunità innata 5. Le reti sono di retes del DNA, proteine nucleari e granulari rilasciati in risposta ad una vasta gamma di stimoli infiammatori o infettive 6. Strutture a rete sono state dimostrate in molte specie tra cui polli 7, pesce, molluschi 8 9 e acoelomates 10, ma ci sono variazioni di specie. Ad esempio, i neutrofili murini rispondono più lentamente agli stimoli NETosis di neutrofili umani, e formano NET meno diffuse 11. Vi è un grande corpo di evidenze provenienti da più specie che NET intrappolano i microbi, e più controverso può essere direttamente coinvolti nell&#39;uccisione di agenti patogeni 12,13. Tuttavia, i componenti NET anche migliorare danni ai tessuti, favoriscono la trombosi e di agire come autoantigeni 14,15. L&#39;equilibrio tra i benefici effetti deleteri e di reti può variare tra diverse malattie e specie diverse, suggerendo è importante indagare NET sia nelle specie e condizioni di interesse. Qui noidescrivere un semplice protocollo per indurre e misurando il rilascio di NET da parte dei neutrofili canina. Questo metodo è simile a quelli usati per isolare neutrofili 16 ed indurre NETosis in altre specie, ma le condizioni quali la concentrazione agonista e tempo di incubazione sono state ottimizzate per i neutrofili canino. Un saggio di rilascio quantificazione del DNA NET simile è stata descritta anche in altre specie, ma il metodo presentato qui è anche ottimizzato per i cani 8,17,18.

<table><tbody><tr><td>Provetta di sangue intero in plastica con rivestimento a spruzzo K2EDTA</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-500</td><td>Accurato corp.</td><td></td><td></td>AN228410</tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>20012043</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello bovino, inattivato al calore</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10100139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media 1640, senza rosso fenolo o L-glutammina</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>32404-014</td><td>Deve essere privo di rosso fenolo</td></tr><tr><td>96 piastra in polistirene sterile a fondo piatto</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di attivazione piastrinica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4904</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Macchia di acido nucleico verde</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 Lettore multimodale</td><td>BioTek</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

un semplice test di fluorescenza per la quantificazione del canine neutrofili extracellulare trappola di uscita

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Le trappole extracellulari dei neutrofili sono reti di DNA, istoni e proteine neutrofile rilasciate in risposta a stimoli infettivi e infiammatori. Sebbene siano un componente della risposta immunitaria innata, i NET sono implicati in una serie di processi patologici, tra cui l'autoimmunità e la trombosi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'isolamento dei neutrofili canini e la quantificazione dei NET utilizzando un saggio di fluorescenza su micropiastra. Il sangue viene raccolto utilizzando tecniche convenzionali di venipuntura. I neutrofili vengono isolati utilizzando la sedimentazione del destrano e un gradiente di densità utilizzando condizioni ottimizzate per il sangue del cane. Dopo aver lasciato il tempo per l'attaccamento ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, i neutrofili vengono trattati con agonisti che inducono NET come il forbolo-12-miristato-13-acetato o il fattore di attivazione piastrinica. Il rilascio di DNA viene misurato dalla fluorescenza di un colorante di acido nucleico impermeabile alle cellule. Questo test è un metodo semplice ed economico per quantificare il rilascio di NET, ma la formazione di NET piuttosto che altre cause di morte cellulare deve essere confermata con metodi alternativi.

Usando questo protocollo, dovrebbe esserci una forte variazione piega in fluorescenza dopo stimolazione neutrofili con i controlli positivi, PMA e PAF. Come illustrato nella Figura 1B, la stimolazione dei neutrofili canino con 31 pM PAF per 1 hr, comportano un aumento medio di 4,0 volte della fluorescenza rispetto alle cellule non stimolate (range 2,0-5,8, n = 5 cani) 18. PMA a 0,1 micron (Figura 1A) è un agonista più lento che non si traduca ...

trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono reti di DNA, istoni e proteine ​​neutrofili. Sebbene un componente della risposta immunitaria innata, NET sono implicati in autoimmunità e trombosi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per l&#39;isolamento dei neutrofili canina e la quantificazione di NET utilizzando un saggio micropiastra fluorescenza.

Un semplice test di fluorescenza per la quantificazione del Canine neutrofili extracellulare Trappola di uscita

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è isolare neutrofili quiescenti e misurare il rilascio del loro DNA in risposta ad agonisti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'ambito dell'immunologia e della medicina veterinaria, ad esempio: qual è la risposta dei neutrofili a diversi agonisti dell'induzione di trappole extracellulari neutrofiliche o della morte cellulare? Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo screening rapido di vari agonisti e inibitori della formazione di trappole extracellulari neutrofiliche.Iniziare inserendo un ago a farfalla da 21 gauge nella vena cefalica di un donatore canino sano, quindi attaccare una siringa da tre millilitri ed eseguire tre prelievi di sangue da tre millilitri, trasferendo immediatamente i campioni in provette per sangue contenenti EDTA senza tappo. Prestare attenzione affinché la puntura venosa sia atraumatica e il flusso ematico sia adeguato, poiché un prelievo scadente comporterà una resa scarsa di neutrofili. Dopo aver riempito ogni provetta, capovolgerla per assicurare un miscelamento adeguato tra sangue e anticoagulante.Raccogliere il sangue in un tubo conico da 50 millilitri. M

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Questo video dimostra l'induzione e la visualizzazione di trappole extracellulari neutrofile o NET in neutrofili pre-marcati utilizzando siero paziente contenente anticorpi citoplasmatici anti-neutrofili. Inoltre, l'utilizzo di un colorante di DNA impermeabile e della microscopia a fluorescenza consente la visualizzazione dei NET.

Induzione e visualizzazione di trappole extracellulari di neutrofili in neutrofili pre-marcati

Descriviamo i metodi per isolare canini neutrofili dal sangue intero e visualizzare formazione netta nei neutrofili dal vivo utilizzando la microscopia a fluorescenza. Sono anche descritti protocolli per quantificare la formazione netta e citrullinato istone H3 (citH3) espressione usando la microscopia di immunofluorescenza.

In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di trappole extracellulari neutrode (NETT) e il funzionamento di NETQUANT, un'opzione software completamente automatica per la quantificazione dei NET nelle immagini di immunofluorescenza.

Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT

Questo protocollo descrive un'analisi di trappola extracellulari del neutrofilo (NET) altamente sensibile e ad alto rendimento per la quantificazione semiautomatizzata di ex vivo NET formazione mediante microscopia confocale tridimensionale di immunofluorescenza. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare la formazione netta e degrado dopo stimoli diversi e può essere utilizzato per lo studio di potenziali terapie mirate al NET.

Un'analisi di High-throughput per valutare e quantificare la trappola extracellulari del neutrofilo formazione

Presentiamo un protocollo per una tecnica di saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificata per misurare quantitativamente due componenti dei residui di trappole extracellulari dei neutrofili, i complessi di DNA coniugato a DNA coniugato con mieloperossidasi e DNA coniugato con elastasi neutrofila, derivati da neutrofili attivati.

Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato

Questo protocollo presenta una serie di saggi funzionali dei neutrofili da utilizzare come metodo di screening per coprire le funzioni di diverse vie di segnalazione. Il protocollo include una valutazione iniziale e semplice della vitalità cellulare, della purezza, della produzione di specie reattive dell'ossigeno, della migrazione in tempo reale, della fagocitosi e di un suggerimento preliminare di trappole extracellulari per neutrofili.

Una serie di tecniche di screening per una rapida panoramica della funzione dei neutrofili

Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.

Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani

Questo protocollo definito descrive un approccio di microscopia ad alto rendimento in tempo reale per visualizzare e quantificare il rilascio di trappole extracellulari (NET) di neutrofili umani in vitro. Il metodo riproducibile consente di studiare le caratteristiche e la cinetica del rilascio di NET dopo stimolazione con induttori distinti di NETosi e consente di valutare la farmacologia degli antagonisti di NETosi.

Quantificazione microscopica in tempo reale e ad alto rendimento del rilascio di trappole extracellulari di neutrofili umani e valutazione della farmacologia degli antagonisti

Neutrofili Trappole extracellulare (NET) sono un importante meccanismo immunitario innato per combattere i batteri patogeni, funghi e parassiti. Qui si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano e di attivare per formare NET. Vi presentiamo le tecniche di preparazione di visualizzare reti in microscopia ottica ed elettronica.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

Viene presentato un protocollo per la quantificazione e il confronto simultaneo di tre componenti cellulari ed extracellulari all'interno di biofilm. La metodologia prevede l'uso della microscopia a scansione laser confocale, del software di analisi e visualizzazione strutturale del biofilm e del software di analisi statistica.

Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

Scopri un metodo di fluorescenza per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili canini. Questa tecnica consente lo screening rapido di agonisti e inibitori della formazione NET in medicina veterinaria.

Un semplice test di fluorescenza per la quantificazione del Canine neutrofili extracellulare Trappola di uscita

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