Un semplice test di fluorescenza per la quantificazione del Canine neutrofili extracellulare Trappola di uscita
21 novembre 2016
trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono reti di DNA, istoni e proteine neutrofili. Sebbene un componente della risposta immunitaria innata, NET sono implicati in autoimmunità e trombosi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'isolamento dei neutrofili canina e la quantificazione di NET utilizzando un saggio micropiastra fluorescenza.
L'obiettivo generale di questo esperimento è isolare i neutrofili quiescenti e misurare il loro rilascio di DNA in risposta agli agonisti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in immunologia e medicina veterinaria, come ad esempio: qual è la risposta dei neutrofili a vari agonisti dell'induzione della trappola extracellulare dei neutrofili o della morte cellulare? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo screening rapido di vari agonisti e inibitori della formazione di trappole extracellulari di neutrofili.
Inizia inserendo un ago a farfalla calibro 21 nella vena cefalica di un donatore canino sano, quindi collega una siringa da tre millilitri e ottieni tre campioni di sangue da tre millilitri, trasferendo immediatamente i campioni in provette di sangue contenenti EDTA senza tappo. Fare attenzione che la venipuntura sia atraumatica e che il flusso sanguigno sia buono, poiché un cattivo prelievo di sangue si tradurrà in una scarsa resa di neutrofili. Dopo aver riempito ogni provetta, capovolgere le provette per garantire un'adeguata miscelazione del sangue e dell'anticoagulante.
Raccogli il sangue in una provetta conica da 50 millilitri. Miscelare i campioni con un volume uguale di destrano 500 sterile a temperatura ambiente mediante inversione delicata e lasciare la provetta in posizione verticale per 18-20 minuti a temperatura ambiente. Quindi trasferire lo strato superiore color paglia in un tubo fresco fino a quando non può più essere raccolto senza contaminazione da parte dello strato rosso inferiore.
Centrifugare lo strato superiore. Scartare il surnatante, rispendendo manualmente il pellet in 10 millilitri di PBS sterile a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 10 millilitri di un polisaccarosio a temperatura ambiente in una soluzione di separazione cellulare di diatrizoato di sodio in una provetta conica da 50 millilitri.
Sovrapporre accuratamente le cellule sulla soluzione di separazione. Separare le celle mediante centrifugazione. Scartare i tre strati superiori di plasma e piastrine mononucleati e gradiente di densità.
Lisi gli eritrociti rimanenti con 10 millilitri di acqua a temperatura ambiente. Dopo 30 secondi, aggiungere 10 millilitri di cloruro di sodio sterile a temperatura ambiente all'1,8% per ripristinare la tonicità. Mescolare le cellule mediante una leggera inversione.
Ora raccogli le cellule per centrifugazione. Risospendere delicatamente il pellet bianco in 10 millilitri di PBS sterile. Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet a una concentrazione di cinque volte 10-60 cellule per millilitro in PBS sterile a temperatura ambiente.
A seconda dei casi, asciugare all'aria un piccolo volume di cellule su un vetrino, quindi colorare con un kit di fissazione rapida e colorare secondo le istruzioni del produttore. Se l'isolamento dei neutrofili ha avuto successo, almeno il 95% delle cellule nucleate dovrebbe essere costituito da granulociti con una minima contaminazione eritrocitaria, come osservato al microscopio ottico. Immediatamente dopo l'isolamento dei neutrofili, far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro sterile sterile da 70 micron e aggiungere cinque volte 10 alle quarte cellule nei pozzetti di prova di una piastra da 96 pozzetti contenente terreni di coltura per un'incubazione di 30 minuti a 39 gradi Celsius e 4% di anidride carbonica.
Quando le cellule si sono attaccate, aggiungere fino a un volume finale di 100-200 microlitri dell'agonista di interesse in RPMI senza rosso fenolo e integrato con FCS inattivato a caldo ai pozzetti del test, nonché a due pozzetti bianchi contenenti solo PBS. Quindi aggiungere un colorante di acido nucleico impermeabile alle cellule e rimettere la piastra nell'incubatore. Dopo il periodo di incubazione appropriato, misurare la fluorescenza su un lettore di micropiastre.
Una stimolazione di un'ora dei neutrofili canini con il fattore di attivazione piastrinica determina un aumento medio di quattro volte della fluorescenza rispetto alle cellule di controllo non stimolate. La PMA, tuttavia, è un agonista più lento che non dimostra un aumento della fluorescenza dei neutrofili prima di due ore dall'attivazione, ma che alla fine produce un aumento simile delle pieghe nel tempo. La fluorescenza del colorante dell'acido nucleico non è specifica per la formazione di trappole extracellulari di neutrofili, poiché si verifica anche in caso di morte cellulare dovuta ad altri meccanismi o se i reagenti sono contaminati dal DNA.
Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, un preparato commerciale di LPS ha prodotto una fluorescenza molto elevata in assenza di neutrofili, presumibilmente a causa della contaminazione con DNA batterico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare i neutrofili con delicatezza.
Non agitare le cellule e pipettare piuttosto che versare i surnatanti. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la microscopia a immunofluorescenza, per confermare che il DNA rilasciato è correlato alla NETosi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ematologia per esplorare l'interazione del DNA rilasciato durante la coagulazione e l'effetto di nuovi agonisti del NET tra cui il plasma dei pazienti.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i neutrofili canini e misurare la loro risposta agli agonisti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per isolare neutrofili quiescenti dal sangue canino e quantificare la formazione di trappole extracellulari. Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) svolgono un ruolo significativo nella risposta immunitaria innata e sono associate a diverse patologie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Medicina Veterinaria
Sfondo
- I neutrofili sono protagonisti chiave nella risposta immunitaria.
- Le NET sono costituite da DNA, istoni e proteine rilasciate dai neutrofili.
- Le NET sono coinvolte nelle malattie autoimmuni e nella trombosi.
- Comprendere la formazione delle NET può fornire informazioni sulla risposta immunitaria.
Scopo dello studio
- Isolare i neutrofili e misurare il rilascio del loro DNA in risposta a vari agonisti.
- Studiare la risposta dei neutrofili ad agenti induttori di trappole neutrofiliche (NET).
- Facilitare lo screening rapido di agonisti e inibitori che influenzano la formazione di NET.
Metodi Utilizzati
- I campioni di sangue vengono prelevati da un donatore canino sano utilizzando un ago farfalla da 21 gauge.
- I campioni vengono trasferiti in provette contenenti EDTA per l'isolamento dei neutrofili.
- Si presta attenzione a garantire una venipuntura atraumatica per ottenere un rendimento ottimale di neutrofili.
- La capoversione delle provette assicura un'adeguata miscelazione tra sangue e anticoagulante.
Risultati principali
- Il metodo consente un'efficace isolazione dei neutrofili.
- La quantificazione delle NET può essere ottenuta mediante un saggio fluorimetrico in micropiastre.
- Il protocollo permette lo studio delle risposte dei neutrofili a diversi stimoli.
- È possibile effettuare un'analisi rapida della formazione delle NET in risposta a diversi agonisti.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per lo studio del comportamento dei neutrofili.
- Le informazioni ottenute possono contribuire alla comprensione delle risposte immunitarie in condizioni fisiologiche e patologiche.
- La tecnica è vantaggiosa sia per applicazioni di ricerca che cliniche in medicina veterinaria.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Questo saggio di quantificazione dei NET basato sulla fluorescenza consente uno screening rapido di agonisti e inibitori che influenzano la formazione di trappole extracellulari neutrofile in modelli canini. Il metodo supporta la validazione degli bersagli nella ricerca immunologica e sulle malattie infiammatorie fornendo letture quantitative e riproducibili del rilascio di DNA. Facilita l'analisi meccanicistica e la riduzione dei rischi nei programmi preclinici che indagano su vie mediate dai NET nei modelli di autoimmunità, trombosi e malattie infettive.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della risposta dei neutrofili ad agonisti come PMA e PAF per chiarire il percorso bersaglio.
- Valore operativo: Permette lo screening rapido di librerie di composti per identificare modulatori della NETosi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Utilizza un colorante per acidi nucleici impermeabile alle cellule per quantificare il rilascio di DNA extracellulare come indicatore della formazione di NET.
- Valore operativo: Compatibile con lettori per micropiastre a 96 pozzetti per analisi ad alto rendimento di agonisti/inibitori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce un sistema rilevante per lo studio del coinvolgimento dei NET nella trombosi e nell'autoimmunità.
- Valore operativo: Permette l'analisi di risposta in funzione della dose e nel tempo, supportando la fiducia predittiva nell'ottimizzazione del composto leader.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione della proteina bersaglio all'identificazione del composto attivo, supportando la riduzione dei rischi associati alla proteina immunologica prima dell'investimento preclinico.
- Biologia della scoperta: Misura la cinetica del rilascio del DNA per chiarire le vie di attivazione dei neutrofili e la specificità degli agonisti.
- Screening: Fornisce output quantitativi di fluorescenza che consentono il confronto tra potenza degli agonisti ed efficacia degli inibitori.
- Analisi: Genera dati in termini di variazione di fold (ad esempio, un aumento di 4-fold con PAF) per classificare l'attività dei composti e valutare la rilevanza biologica.
- Ricerca traslazionale: Collega la quantificazione delle NET ai processi fisiopatologici come la coagulazione e l'infiammazione quando abbinata a una validazione ortogonale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e riutilizzabile per la validazione di bersagli in immunologia e nelle malattie infiammatorie in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica isolando i segnali specifici dei NET dalla citotossicità generale, quando confermato mediante microscopia.
- Valore operativo: Utilizza reagenti economici e facilmente accessibili e attrezzature di laboratorio standard per un'implementazione scalabile.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione sperimentale consentendo una valutazione precoce degli effetti del composto sulla patologia mediata dai NET.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei bersagli adeguata al rischio nelle aree delle malattie infiammatorie e autoimmuni.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di cellule primarie e nelle tecniche di coltura tissutale sterili.
- Dipende dall'accesso a lettori di micropiastre dotati di capacità di rilevamento della fluorescenza.
- Necessita della standardizzazione della densità di semina cellulare e delle condizioni di incubazione tra diversi esperimenti.
- Deve essere abbinato a metodi ortogonali (ad esempio, immunofluorescenza) per distinguere la NETosi da altri meccanismi di morte cellulare.
- Limitato dalla specificità del colorante, poiché la fluorescenza può verificarsi a causa di DNA extracellulare derivante da necrosi o da contaminazione del reagente.
