Name: Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Impara a produrre e purificare la proteina MOG del topo per studiare l'encefalomielite autoimmune sperimentale. Questo metodo accessibile utilizza attrezzature standard di laboratorio per facilitare la ricerca sulla sclerosi multipla.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ ha ricevuto il premio per la borsa di studio di dottorato della Waugh Family MS Society of Canada.

<ol><li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Baxter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+application+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).</li>
<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T-cell+epitopes+of+MOG+reside+in+its+transmembrane+and+cytoplasmic+domains+in+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).</li>
<li>Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+recognition+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+autoantigen+depends+on+immunization+with+protein+rather+than+short+peptide%2C+while+B+cell+invasion+of+the+CNS+in+autoimmunity+does+not%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not.</a> J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).</li>
<li>Barun, B., Bar-Or, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+sclerosis+with+anti-CD20+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies.</a> Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).</li>
<li>Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+encephalitogenicity+of+recombinant+human+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).</li>
<li>Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+and+human+myelin+oligodendrocyte+glycoproteins+induce+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+different+mechanisms+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice.</a> J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+additives+on+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of additives on protein aggregation.</a> Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).</li>
<li>Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+Infiltration+of+the+Spinal+Cord+by+Non-Classically+Activated+B+Cells+is+Associated+with+Chronic+Disease+Course+in+a+Spontaneous+B+Cell-Dependent+Model+of+CNS+Autoimmune+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease.</a> Front Immunol. 6, 470(2015).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S.Tag+fusion+system+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The S.Tag fusion system for protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).</li>
<li>Amor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epitopes+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+for+the+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL+and+Biozzi+AB%2FH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice.</a> J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).</li>
<li>Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+profiling+of+tobacco+etch+virus+protease+using+a+novel+fluorescence-assisted+whole-cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay.</a> PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).</li>
<li>Litzenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+producing+demyelinating+autoantibodies%3A+development+and+function+in+gene-targeted+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice.</a> J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).</li>
<li>Zhang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+Escherichia+coli-expressed+human+thymosin-alpha1+using+affinity+chromatography+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography.</a> Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).</li>
<li>Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+protein+production+levels+in+Escherichia+coli+with+a+strong+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter.</a> FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).</li>
<li>Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+T+cells+exacerbates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+mouse%2C+but+not+rat%2C+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens.</a> J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li>
<li>Blommel, P. G., Fox, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+approach+to+improving+large-scale+production+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease.</a> Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui, abbiamo descritto un protocollo per la produzione di MOG etichetta proteica e come generare puro MOG 1-125 dalla proteina tag MOG. Questo protocollo si basa sia sulla base metodi di purificazione delle proteine standard di His-tag, così come un protocollo precedentemente descritto per la generazione di una proteina MOG-based anziani 15. Anche se non è qui descritta, l&#39;utilizzo primaria della proteina tag MOG è indurre EAE attraverso l&#39;immunizzazione con...

La sclerosi multipla è una malattia umana caratterizzata da infiammazione cronica e neurodegenerazione del sistema nervoso centrale che è pensato per essere guidato da una risposta autoimmune diretta verso la mielina. La perdita di mielina e gli assoni nel tempo comporta il graduale declino cognitivo e motorio funzione 1. &quot;Encefalomielite autoimmune sperimentale&quot; è un termine generico per i modelli animali di malattia autoimmune rivolta mielina del SNC. Come MS umani, EAE è tipicamente caratterizzato da infiltrazione di cellule immunitarie del sistema nervoso centrale e, in alcuni casi, demielinizzazione 2. Tuttavia, il grado in cui un dato modello di EAE assomiglia MS umana in parte dipende dalle specie o ceppo utilizzati e della complessità della risposta autoimmune anti-mielina sottostante. autoimmunità anti-mielina può essere indotta sperimentalmente in vari modi, ma il metodo più comune utilizzato oggi è quello di immunizzare i topi con una breve peptide di aminoacidi imitando il CD4 immunodominante <sup&gt; + T epitopo cellule di una proteina mielina. Questo rappresenta il requisito minimo per indurre una risposta patogena. Forse il più comune di questi è un peptide di 21 aminoacidi derivato da myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG 35-55), che viene utilizzato per indurre EAE in topi C57BL / 6 3. Tuttavia, per alcuni scopi sperimentali è desiderabile o addirittura necessario per immunizzare con antigeni proteici più grandi e in effetti ci sono molti vantaggi a questo oltre l&#39;immunizzazione con breve peptide. Innanzitutto, a causa della restrizione MHC, piccoli peptidi sono generalmente efficaci solo in una gamma molto limitata di ceppi, mentre antigeni proteici grandi corrispondenti sia l&#39;intera proteina o un dominio specifico possono essere elaborati normalmente per presentarli in diversi ceppi di topi inbred o anche in diverse specie 4. In secondo luogo, un antigene proteico più grande è in grado di indurre una risposta immunitaria più complesso incorporando più tipi di linfociti nel riconoscimento dell&#39;antigene, piuttosto che limiting riconoscimento dell&#39;antigene alle cellule T CD4 +. Ad esempio, le cellule B tramite il loro recettore delle cellule B (BCR) interagiscono direttamente con tutto piuttosto che elaborati proteine. Noi e altri hanno dimostrato che le cellule B attivate da MOG 35-55 immunizzazione non riconoscono la proteina MOG 5. Dato che le cellule B sono stati recentemente dimostrato di giocare un ruolo patogenetico nella SM umano 6, modelli EAE che incorporano le cellule B in patologia autoimmune sono sempre più importanti. Nonostante i vantaggi dell&#39;utilizzo di antigeni proteici grandi per indurre EAE, rimangono poche fonti disponibili in commercio per tali proteine. Infatti, mentre i peptidi corti come MOG 35-55 possono essere sintetizzati molto rapidamente e ad un costo relativamente basso, le opzioni commerciali per proteina MOG sono limitati e costo sostanzialmente più acquistare. Tuttavia, ci sono diversi vettori di espressione disponibili per i gruppi di ricerca per generare MOG dominio extracellulare (MOG) 1-125 stessi. However, tutti i sistemi di espressione che abbiamo identificato in letteratura sono basati su vecchie tecnologie che sono state sostituite con sistemi di espressione più efficienti 7. Inoltre, la maggior parte sono basati su ratto o umano MOG 8. Per alcune ricerche di autoimmunità in topi, un antigene basato sulla autoantigene del mouse MOG è preferibile. Infine, tutte le proteine MOG-based che abbiamo individuato, sia commerciale o come vettori di espressione, sono proteine di fusione contenenti amminoacidi supplementari alla base MOG 1-125. Questi includono un tag per la purificazione e di solito altre sequenze così, molte delle quali con una funzione siamo stati in grado di identificare. Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo generato una proteina di fusione romanzo basato sul mouse MOG dominio extracellulare fuso a un tag contenente tioredossina per combattere l&#39;insolubilità noto di MOG proteine 5. La sequenza di tag contiene anche una sequenza 6xHis di purificazione e di una proteasi TEV CLEsito Avage che permette la rimozione completa di tutte le sequenze di tag, se desiderato. Questo è l&#39;unico metodo che siamo consapevoli di generare puro proteina MOG 1-125. Per facilitare la produzione di grandi quantità di proteine, la sequenza MOG 1-125 era codone ottimizzato per l&#39;espressione batterica e la proteina di fusione tag MOG è stato inserito nel sistema di espressione pET-32. Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo per produrre e purificare MOG proteine tag, e puro MOG 1-125, utilizzando attrezzature non specializzati a disposizione maggior parte dei laboratori di immunologia.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot lab</td><td></td><td>Questi batteri sono necessari per produrre la proteina MOGtag. Le scorte di glicerolo di questi batteri sono disponibili su richiesta.</td></tr><tr><td>LB brodo mugnaio</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>bio basic</td><td>AB0028</td><td>Ricostituire la polvere in 50% etanolo/ 50% H2O a 100 mg/ml. Conservare a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>Ricostituire la polvere in H2O a 1M e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Lisozima uovo di gallina</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>Ricostituire in H2O a 50 mg/ml e conservare a -80 °C.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologie per la vita</td><td>salina tamponata con fosfato</td><td>20012-027</td><td>Non è richiesta soluzione salina tamponata con fosfato commerciale, è sufficiente qualsiasi soluzione salina tamponata con fosfato standard prodotta in laboratorio.</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidina-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>La qualità deve essere superiore al 98% di purezza.</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di nichel (II)</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>La sua resina legante</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>Conservare in etanolo al 20% 80% H2O a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Etanolo anidro</td><td>Alcoli commerciali</td><td>P016EAAN</td><td>Diluire con acqua secondo necessità.</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio triidrato</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina standard</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad test proteico reagente concentrato</td><td>bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico, sale disodico diidrato</td><td>Fisher scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW Tubo per dialisi in pelle di serpente</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>Questo reagente non deve essere maneggiato al di fuori di una cappa aspirante.</td></tr><tr><td>AcTEV protease</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>La produzione della propria proteasi TEV può essere realizzata utilizzando (https://www.addgene.org/8827/) e purificata come nel riferimento 17</td></tr><tr><td>Polietilenglicole 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp fondo piatto 96 pozzetti</td><td>piastra ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro per micropiastre Eon</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>Questa apparecchiatura utilizza il software di analisi dei dati Gen5.</td></tr><tr><td>Software di analisi dati Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodio dodecil solfato</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>blu bromofenolo</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione delle proteine</td><td>Termoscientifico</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>gel prefabbricato di poliacrilammide al 12%</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>Reagente colorante rapido</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>Gel dock EZ imager</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio per campioni a luce bianca</td><td>bio-rad</td><td>1708272&nbsp;</td><td>Utilizzato insieme all'imager EZ per gel dock per macchie blu coomassie</td></tr><tr><td>Scala portaproteine</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione semplici ed efficaci e purificazione di topo mielina oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale studi

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica del sistema nervoso centrale (SNC), che si pensa si verifichi a seguito di risposte autoimmuni che colpiscono la mielina. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è il modello animale più comune di malattia autoimmune del SNC ed è tipicamente indotta tramite immunizzazione con peptidi corti che rappresentano epitopi immunodominanti delle cellule T CD4+ delle proteine della mielina. Tuttavia, le cellule B riconoscono direttamente le proteine non trasformate e l'immunizzazione con peptide corto non attiva le cellule B che riconoscono la proteina nativa. Poiché recenti studi clinici sulle terapie che deplevano le cellule B nella SM hanno suggerito un ruolo delle cellule B nel guidare la malattia nell'uomo, c'è un urgente bisogno di modelli animali che incorporino il riconoscimento dell'autoantigene da parte delle cellule B. A tal fine, abbiamo generato una nuova proteina di fusione contenente il dominio extracellulare della versione murina della glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) e fusioni N-terminali di un His-tag per scopi di purificazione e la proteina tioredossina per migliorare la solubilità (MOG tag). È stato incorporato un sito di scissione della proteasi del virus dell'etch del tabacco (TEV) per consentire la rimozione di tutte le sequenze di tag, lasciando solo il dominio extracellulare MOG1-125 puro. Qui, descriviamo un semplice protocollo che utilizza solo apparecchiature di laboratorio standard per produrre grandi quantità ditag MOG puro o MOG1-125. Questo protocollo genera costantemente oltre 200 mg di proteinatag MOG. L'immunizzazione contag MOG o MOG1-125 genera una risposta autoimmune che include cellule B patogene che riconoscono il MOG nativo del topo.

Dopo la purificazione è completo, i campioni raccolti in passi 1.4, 2.1, 3.4, e il prodotto finale dal punto 6.4 devono essere eseguiti su un gel proteico (Figura 3A). Tag MOG deve prima apparire come un kDa banda 31.86 nel campione T O / N, ma non t 0, e dovrebbe essere l&#39;unica band nel prodotto puro finale. Per verificare se la proteina tag MOG ha correttamente piegato, la proteina tag MOG può essere usato per ...

Descriviamo un semplice protocollo che utilizza solo attrezzature di laboratorio di base per generare e purificare grandi quantità di una proteina di fusione che contiene glicoproteina oligodendrocitaria della mielina di topo. Questa proteina può essere utilizzata per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale guidata da cellule T e B.

Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è produrre una proteina basata sul dominio extracellulare della glicoproteina oligodendrocitaria della mielina o MOG, che può essere utilizzata per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale o EAE. Questo protocollo consente a qualsiasi laboratorio di produrre la proteina MOG da utilizzare come antigene per indurre l'EAE. Il principale vantaggio di questo protocollo è che non richiede attrezzature specializzate per la manipolazione delle proteine, ma può essere eseguito utilizzando attrezzature standard disponibili nella maggior parte dei laboratori di immunologia.Questo protocollo è stato ottimizzato per la proteina MOG con tag basata sulla versione murina e dovrebbe funzionare anche per altri sistemi di espressione della proteina MOG che incorporano un tag per la purificazione. Inoculare cinque millilitri di brodo sterilizzato con la glicerol stock di BL21 MOG tag e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto. Aggiungere 500 microlitri di ampicillina 100 milligrammi per millilitro a ciascuno di due becker da 500 millilitri contenenti 500 millilitri di LB sterile. Trasferire un millilitro della coltura notturna i

simple-efficient-production-purification-mouse-myelin-oligodendrocyte

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra un'efficiente tecnica di omogeneizzazione per generare un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in un modello murino. L'emulsione contiene un autoantigene - la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) - in fase acquosa, circondata da una fase oleosa continua comprendente un batterio patogeno inattivato. L'emulsione garantisce un rilascio prolungato di antigeni per una risposta immunitaria prolungata.

Preparazione di un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune

Il video dimostra l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino iniettando una combinazione di glicoproteine oligodendrocitarie mieliniche e Mycobacterium tuberculosis inattivato. Il modello consente ai ricercatori di studiare i meccanismi della malattia e testare gli interventi terapeutici.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

Questo video mostra il metodo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) iniettando peptidi derivati dalla mielina con un adiuvante per attivare le cellule T autoreattive, che migrano verso il cervello. La tossina della pertosse viene somministrata per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo a queste cellule T e ad altre cellule immunitarie di entrare nel cervello. Queste cellule immunitarie causano demielinizzazione, portando a una compromissione...

Generazione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

In questo video, un modello murino di sclerosi multipla viene stabilito utilizzando l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Al topo viene iniettata un'emulsione contenente un peptide neuronale e un adiuvante, innescando una risposta immunitaria che attiva le cellule T autoreattive. Questo è seguito da un'iniezione di tossina della pertosse (PTX) per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo alle cellule T autoreattive di infiltrarsi nel cervello. Questa...

Fonte: Jain, R. W., et al. Produzione e purificazione semplici ed efficienti della glicoproteina oligodendrocitaria della mielina di topo per studi sperimentali sull'encefalomielite autoimmune. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'isolamento e la purificazione di MOGtag, una glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) ricombinante utilizzata negli studi sperimentali sull'encefalomielite autoimmune (EAE). Il protocollo prevede la lisi batterica, la sonicazione, la centrifugazione e la...

Isolamento e purificazione di glicoproteine oligodendrocitarie mieliniche ricombinanti

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla. C57BL / 6 topi sono immunizzati con mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), con un conseguente paralisi flaccida ascendente causata da cellule immunitarie autoreattive nel sistema nervoso centrale. Saranno discussi protocolli per l'induzione della malattia e monitoraggio.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in C57BL / 6 Mice

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multipla, i topi vengono immunizzati con un'emulsione acqua-in-olio contenente un autoantigene e un adiuvante completo di Freund. Mentre esistono diversi protocolli per la preparazione di queste emulsioni, qui viene presentato un protocollo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per la preparazione dell'emulsione.

Un metodo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per preparare emulsioni antigene/adiuvanti per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Ad oggi, i protocolli per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale dallo stesso topo sono una richiesta insoddisfatta. Il protocollo mostra una procedura applicabile nei topi con encefalomielite autoimmune naïve e sperimentale per studiare reti cellulari complesse durante la neuroinfiammazione e contemporaneamente ridurre il numero di topi richiesti.

Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla (SM), che condivide con la malattia umana una robusta risposta autoimmune umorale. Qui, riportiamo un protocollo ELISA semplice e flessibile per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi immunizzati con EAE.

Quantificazione degli anticorpi autoreattivi nei topi dopo encefalomielite autoimmune sperimentale

Impara a produrre e purificare la proteina MOG del topo per studiare l'encefalomielite autoimmune sperimentale. Questo metodo accessibile utilizza attrezzature standard di laboratorio per facilitare la ricerca sulla sclerosi multipla.

Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi (Video) | JoVE Journal

Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

Esplora altri video