Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi
27 ottobre 2016
Descriviamo un semplice protocollo che utilizza solo attrezzature di laboratorio di base per generare e purificare grandi quantità di una proteina di fusione che contiene glicoproteina oligodendrocitaria della mielina di topo. Questa proteina può essere utilizzata per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale guidata da cellule T e B.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di generare proteine basate sul dominio extracellulare della glicoproteina degli oligodendrociti della mielina o MOG, che può essere utilizzata per indurre encefalomielite autoimmune sperimentale o EAE. Questo protocollo consente a qualsiasi laboratorio di produrre la proteina MOG per utilizzarla come antigene per indurre l'EAE. Il vantaggio principale di questo protocollo è che non si basa su apparecchiature specializzate per la manipolazione delle proteine, ma che consente di utilizzare apparecchiature standard presenti in quasi tutti i laboratori di immunologia.
Bene, questo protocollo è stato ottimizzato per la proteina tag MOG basata sulla versione del topo, dovrebbe funzionare per altri sistemi di espressione della proteina MOG che incorporano un estato per la purificazione. Inoculare cinque millilitri di brodo sterilizzato con il brodo di glicerolo BL 21 MOG tag e incubarlo per una notte a 37 gradi Celsius e 200 giri/min. Aggiungere 500 microlitri di ampicillina da 100 milligrammi per millilitro a ciascuno dei fiaschi da 500 millilitri contenenti 500 millilitri di libbra sterile. Trasferire un millilitro di coltura notturna in ciascuno dei due fiaschi di brodo LB.
Incubare a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per cinque ore o fino a una densità ottica di 0,6. Una volta raggiunta la densità cellulare desiderata, aggiungere 0,5 millilitri di IPTG molare a ciascun pallone di coltura. Incubare il pallone, impostare 37 gradi Celsius e 200 giri/min per quattro ore e poi a temperatura ambiente e 75 giri/min per una notte.
Distribuire le colture in modo uniforme su bottiglie da 250 millilitri compatibili con la centrifugazione ad alta velocità e mantenere le bottiglie in ghiaccio da questo punto in poi. Pellettare le cellule batteriche a 22.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere e combinare tutti i pellet batterici in un totale di 30 millilitri di tampone lisato.
Trasferire questo volume in un tubo da 50 millilitri in grado di centrarsi ad alta velocità. Metti questo tubo in un bagnomaria a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Durante il tempo di incubazione, agitare la provetta due volte per risospendere le cellule.
Dopo l'incubazione, trasportare il tubo sul ghiaccio e sonicare la soluzione a 20 kilohertz e ampiezza del 70% pulsando per tre secondi e spegnendo per tre secondi per cinque impulsi, sonicare la soluzione per sei cicli totali di cinque impulsi, permettendo alla soluzione di raffreddarsi nel ghiaccio tra un ciclo e l'altro. Quindi, centrifugare la soluzione a 24.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi risospendere il pellet in 30 millilitri di tampone A e incubare la soluzione a quattro gradi Celsius per tre ore. Dopo l'incubazione, sonicare la soluzione con ghiaccio come prima, quindi aggiungere 17,2 grammi di guanidina HCl alla soluzione.
Incubare il campione su ghiaccio per un'ora per solubilizzare la proteina tag MOG. Per caricare ed equilibrare la resina di nichel, lavare prima la resina aggiungendo 40 millilitri di acqua a ciascun tubo contenente resina. Appoggiare i tubi orizzontalmente su un bilanciere e lasciarli agitare per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Una volta terminato, centrifugare le provette a 4500 volte g per otto minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante pipettandolo per evitare di disturbare il pellet. Quindi aggiungere 40 millilitri di tampone di carica a ciascun tubo.
Trasferire i tubi su un bilanciere e lasciarli agitare per 15 minuti a quattro gradi Celsius prima di centrarli, rifacendoli come prima. Eliminare il surnatante e aggiungere 40 millilitri di tampone B alle provette. Trasferire i tubi su un bilanciere e lasciarli agitare per cinque minuti a quattro gradi Celsius prima di centrare nuovamente i tubi con la resina.
Per purificare la proteina tag MOG, trasferire l'intero volume di proteina solubilizzata nella prima provetta contenente resina di nichel. Dopo la miscelazione, posizionare il tubo orizzontalmente su un bilanciere a quattro gradi Celsius per un'ora. Dopo aver centralizzato la provetta a 4500 volte g per otto minuti a quattro gradi Celsius, trasferire questo surnatante nella seconda provetta di resina di nichel e incubare come prima.
Nel frattempo, risospendere la resina di nichel nel primo tubo in tampone di evoluzione da 40 millilitri e posizionare il tubo orizzontalmente su un bilanciere a quattro gradi Celsius per cinque minuti prima di centrare come prima. Trasferire il surnatante contenente la proteina tag MOG allusa in un flacone da 250 millilitri etichettato con proteina marcata MOG purificata. Mantieni questa bottiglia a quattro gradi Celsius.
Ad ogni fase di eluizione, raccogliere il surnatante risultante in questo flacone. Aggiungere 40 millilitri di strip buffer al nichel presente nel primo tubo e posizionare orizzontalmente su un bilanciere per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Centrifugare la provetta, scartare il surnatante e ricaricare il nichel lievitato come prima.
Una volta terminato, andare avanti con il secondo tubo come è stato fatto per il primo tubo. Un totale di quattro cicli di assorbimento della proteina solubilizzata sulla resina di nichel caricata e l'eluizione recupereranno la maggior parte della proteina. Tagliare circa 30 centimetri di tubo per dialisi in pelle di serpente.
Fissare un'estremità con un emostatico di bloccaggio piegando l'estremità della pelle di serpente tre volte e bloccando l'estremità piegata con l'emostato. Riempi la pelle del serpente con la proteina tag MOG diluita. Quindi rimuovere eventuali bolle d'aria dalla pelle di serpente forzandole fuori dall'estremità aperta.
Infine, sigillare l'altra estremità del tubo utilizzando un secondo emostatico di bloccaggio. Quindi, riempi un grande secchio con un litro di un tampone di acetato con quattro molari di guanidina. Inserire nel secchio fino a due sezioni di tubo per dialisi contenente la proteina tag MOG.
Usando del nastro adesivo, fissare gli emostatici al lato del secchio per lasciare spazio a un'ancoretta magnetica per girare senza ostacoli sul fondo. Metti il secchio in una stanza a quattro gradi Celsius su una piastra magnetica e accendilo a una velocità di rotazione lenta. La dialisi dura un minimo di tre giorni per ridurre gradualmente la quantità di guanidina nel tampone.
Controllare regolarmente che il tubo inizi intatto e che le estremità siano ben chiuse. Dopo quattro o cinque ore, aggiungere un litro di un tampone acetato al secchio per dialisi. Ripeti questo processo ogni quattro o cinque ore per un totale di tre volte per ottenere un totale di quattro litri nel secchio.
Dopo aver scartato metà del tampone nel secchio, riempire nuovamente con un litro di un tampone in acetato e impostare il tubo e la barra di agitazione. Infine, sostituisci l'intero volume di quattro litri nel secchio con quattro litri di tampone di acetato fresco e lascia mescolare per quattro o cinque ore. Per ottenere i migliori risultati, eseguire questo passaggio il giorno della concentrazione proteica.
Per concentrare la proteina del tag MOG, foderare una penna con un foglio di alluminio e coprire il foglio di alluminio con PEG 3350 e PEG 1000 in un rapporto di uno a uno. Il PEG 3350 può aiutare a prevenire l'aggregazione proteica durante la concentrazione ed è un efficace crioconservante. Metti la proteina dell'etichetta MOG contenente il tubo di pelle di serpente sopra il foglio di alluminio e copri con PEG 8000.
Lasciare riposare a temperatura ambiente e controllare regolarmente il volume fino a quando il volume non è uguale o inferiore al volume finale stimato. Se la penna diventa troppo satura d'acqua durante il processo di concentrazione, prepara una padella fresca con un foglio di alluminio e PEG. Campioni di proteine prelevati durante il protocollo di purificazione o eseguiti su un gel SDS per confermarne la purezza.
Viene visualizzato un gel rappresentativo che mostra l'etichetta MOG altamente purificata a 31,86 kilodalton. Per verificare che la proteina tag MOG si sia ripiegata correttamente, è stato valutato mediante citometria a flusso il legame della proteina tag MOG a nove cellule B CD19 positive, CD4 negative, da linfonodi di sei topi neri C57 wild type o topi IgH MOG che esprimono una catena pesante di immunoglobuline specifica per la proteina MOG. Questo protocollo richiede un minimo di 10 giorni dall'inizio alla fine.
Durante tutta la procedura di isolamento è importante tenere traccia della proteina e ricordare cosa deve essere conservato e cosa deve essere scartato. Non dimenticare che quando si utilizza il solfato di nichel esaidrato, utilizzato per caricare la resina di nichel, è estremamente pericoloso e devono essere prese precauzioni per evitare l'inalazione o il contatto con la pelle o gli occhi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre e purificare la tua proteina tag MOG.
Una volta purificata, la proteina tag MOG può essere emulsionata in un adiuvante completo di Freund e utilizzata come immunizzazione per indurre EAE. L'EAE indotto dal tag MOG può essere utilizzato per studiare il coinvolgimento di più tipi di cellule come le cellule CD4 o CDAT o le cellule B nell'autoimmunità del sistema nervoso centrale. A differenza del peptide corto, che è limitato all'MHC, l'antigene proteico può essere utilizzato in qualsiasi ceppo di topi.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo semplice per produrre e purificare una proteina di fusione contenente la glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) del topo. La proteina ottenuta può essere utilizzata per indurre encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) mediata da cellule T e B.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Purificazione delle proteine
Sfondo
- La glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) è fondamentale per lo studio delle malattie autoimmuni.
- L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello per la sclerosi multipla.
- È possibile utilizzare attrezzature di laboratorio standard per la produzione di proteine, rendendo il metodo accessibile.
- Il protocollo è ottimizzato per la MOG murina, ma può essere adattato ad altri sistemi.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per la produzione della proteina MOG.
- Facilitare la ricerca sull'EAE e sulle condizioni autoimmuni correlate.
- Permettere ai laboratori privi di attrezzature specializzate di condurre questa ricerca.
Metodi Utilizzati
- Innoculazione di brodo sterilizzato con stock glicerolato BL 21 MOG tag.
- Incubazione a 37 gradi Celsius con agitazione.
- Preparazione di brodo LB con ampicillina per la selezione.
- Trasferimento della coltura notturna in brodo LB per l'espressione della proteina.
Risultati principali
- Generazione con successo della proteina MOG mediante tecniche di laboratorio standard.
- La proteina può essere utilizzata come antigene per indurre EAE.
- Il protocollo consente la produzione su larga scala della proteina di fusione.
- Metodo accessibile per vari laboratori di ricerca.
Conclusioni
- Il protocollo semplifica la produzione della proteina MOG.
- Supporta la ricerca sulle malattie autoimmuni come la sclerosi multipla.
- È possibile utilizzare apparecchiature standard, aumentando l'accessibilità per i ricercatori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente ai team di ricerca e sviluppo biotecnologico di produrre la glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) nativa per modelli preclinici che coinvolgono sia le vie delle cellule T che delle cellule B nell'encefalomielite autoimmune. Generando una proteina MOG extracellulare completa mediante l'uso di attrezzature di laboratorio standard, il metodo supporta l'analisi meccanicistica e la riduzione del rischio associato a ipotesi terapeutiche mirate alle cellule B nella ricerca sulla sclerosi multipla. La progettazione scalabile e con tag scindibile facilita la produzione riproducibile di antigene per un'induzione costante del modello di malattia in flussi di lavoro di scoperta e traduzione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche che coinvolgono il riconoscimento nativo della MOG da parte di linfociti B patogeni nei modelli di malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Fornisce una fonte standardizzata di antigene per la validazione della MOG come bersaglio nell'infiammazione neurologica mediata da linfociti B, senza richiedere infrastrutture specializzate per la purificazione proteica.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce MOGtag o MOG1-125 purificata, adatta per essere utilizzata in saggi immunoistochimici per rilevare risposte anticorpali anti-MOG in campioni preclinici.
- Valore operativo: Fornisce rese costanti (>200 mg per ciclo) di proteina compatibile con endotossine, consentendo lo sviluppo scalabile di saggi e la qualificazione dei reagenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie inducendo l'EAE con MOG nativo, catturando così meccanismi patogenetici dipendenti dalle cellule B rilevanti per la patologia della sclerosi multipla umana.
- Valore operativo: Garantisce una continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica attraverso un processo produttivo riproducibile, indipendente dall'attrezzatura e adattabile a diversi ceppi di topi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel continuum tra la fase di scoperta precoce e quella preclinica fornendo una fonte affidabile di antigene per la generazione di modelli basati su ipotesi, la standardizzazione delle letture dei saggi e decisioni di avanzamento corrette in base al rischio nei programmi per le malattie autoimmuni.
- Biologia della scoperta: Supporta la validazione del target permettendo la valutazione funzionale delle risposte delle cellule B e T specifiche per MOG in vivo.
- Screening: Genera lotti standardizzati di antigene per lo screening riproducibile di composti immunomodulanti in modelli di EAE.
- Analisi: Produce una proteina pura e quantificabile, adatta per test immunologici come ELISA, citometria a flusso e altre metodiche analitiche per misurare le risposte immunitarie specifiche per l'antigene.
- Ricerca traslazionale: Si allinea alla continuità preclinica producendo un antigene che rispecchia il target nativo riconosciuto nelle terapie cliniche basate sull'eliminazione delle cellule B per la sclerosi multipla.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la produzione dell'antigene MOG, condivisibile tra gruppi di immunologia e neuroscienze senza dipendenza da strutture specializzate.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva consentendo lo studio dei meccanismi autoimmuni che coinvolgono il riconoscimento dell'antigene nativo, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità attraverso un flusso di lavoro di purificazione ben definito e scalabile, che utilizza reagenti ed attrezzature facilmente accessibili.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione dello sviluppo, riducendo i rischi associati ai meccanismi di coinvolgimento delle cellule B nelle fasi iniziali del percorso, potenzialmente riducendo l'abbandono in fasi avanzate dei programmi di neuroimmunologia.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio di terapie dirette contro MOG, basata su modelli che riflettono la presentazione dell'antigene e il coinvolgimento delle cellule B rilevanti per l'uomo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biologia molecolare, espressione proteica batterica e cromatografia di affinità al nichel.
- Si basa su attrezzature di laboratorio standard, tra cui incubatrici, centrifughe, sonicatori e sistema per la dialisi; non sono necessari sistemi specializzati per la purificazione delle proteine.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la quantificazione delle proteine, il test degli endotossini e le condizioni di conservazione, al fine di garantire la riproducibilità tra diversi siti.
- Comporta la manipolazione di cloridrato di guanidina e solfato di nichel esaidrato, richiedendo adeguate procedure di sicurezza chimica e smaltimento dei rifiuti.
- L'adattamento a sistemi di espressione alternativi potrebbe richiedere l'ottimizzazione delle condizioni di induzione e della compatibilità dei tamponi, mantenendo invariata la progettazione del marcatore scindibile tramite TEV.
