Name: Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Impara a produrre e purificare la proteina MOG del topo per studiare l'encefalomielite autoimmune sperimentale. Questo metodo accessibile utilizza attrezzature standard di laboratorio per facilitare la ricerca sulla sclerosi multipla.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ ha ricevuto il premio per la borsa di studio di dottorato della Waugh Family MS Society of Canada.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui, abbiamo descritto un protocollo per la produzione di MOG etichetta proteica e come generare puro MOG 1-125 dalla proteina tag MOG. Questo protocollo si basa sia sulla base metodi di purificazione delle proteine standard di His-tag, così come un protocollo precedentemente descritto per la generazione di una proteina MOG-based anziani 15. Anche se non è qui descritta, l&#39;utilizzo primaria della proteina tag MOG è indurre EAE attraverso l&#39;immunizzazione con...

La sclerosi multipla è una malattia umana caratterizzata da infiammazione cronica e neurodegenerazione del sistema nervoso centrale che è pensato per essere guidato da una risposta autoimmune diretta verso la mielina. La perdita di mielina e gli assoni nel tempo comporta il graduale declino cognitivo e motorio funzione 1. &quot;Encefalomielite autoimmune sperimentale&quot; è un termine generico per i modelli animali di malattia autoimmune rivolta mielina del SNC. Come MS umani, EAE è tipicamente caratterizzato da infiltrazione di cellule immunitarie del sistema nervoso centrale e, in alcuni casi, demielinizzazione 2. Tuttavia, il grado in cui un dato modello di EAE assomiglia MS umana in parte dipende dalle specie o ceppo utilizzati e della complessità della risposta autoimmune anti-mielina sottostante. autoimmunità anti-mielina può essere indotta sperimentalmente in vari modi, ma il metodo più comune utilizzato oggi è quello di immunizzare i topi con una breve peptide di aminoacidi imitando il CD4 immunodominante <sup&gt; + T epitopo cellule di una proteina mielina. Questo rappresenta il requisito minimo per indurre una risposta patogena. Forse il più comune di questi è un peptide di 21 aminoacidi derivato da myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG 35-55), che viene utilizzato per indurre EAE in topi C57BL / 6 3. Tuttavia, per alcuni scopi sperimentali è desiderabile o addirittura necessario per immunizzare con antigeni proteici più grandi e in effetti ci sono molti vantaggi a questo oltre l&#39;immunizzazione con breve peptide. Innanzitutto, a causa della restrizione MHC, piccoli peptidi sono generalmente efficaci solo in una gamma molto limitata di ceppi, mentre antigeni proteici grandi corrispondenti sia l&#39;intera proteina o un dominio specifico possono essere elaborati normalmente per presentarli in diversi ceppi di topi inbred o anche in diverse specie 4. In secondo luogo, un antigene proteico più grande è in grado di indurre una risposta immunitaria più complesso incorporando più tipi di linfociti nel riconoscimento dell&#39;antigene, piuttosto che limiting riconoscimento dell&#39;antigene alle cellule T CD4 +. Ad esempio, le cellule B tramite il loro recettore delle cellule B (BCR) interagiscono direttamente con tutto piuttosto che elaborati proteine. Noi e altri hanno dimostrato che le cellule B attivate da MOG 35-55 immunizzazione non riconoscono la proteina MOG 5. Dato che le cellule B sono stati recentemente dimostrato di giocare un ruolo patogenetico nella SM umano 6, modelli EAE che incorporano le cellule B in patologia autoimmune sono sempre più importanti. Nonostante i vantaggi dell&#39;utilizzo di antigeni proteici grandi per indurre EAE, rimangono poche fonti disponibili in commercio per tali proteine. Infatti, mentre i peptidi corti come MOG 35-55 possono essere sintetizzati molto rapidamente e ad un costo relativamente basso, le opzioni commerciali per proteina MOG sono limitati e costo sostanzialmente più acquistare. Tuttavia, ci sono diversi vettori di espressione disponibili per i gruppi di ricerca per generare MOG dominio extracellulare (MOG) 1-125 stessi. However, tutti i sistemi di espressione che abbiamo identificato in letteratura sono basati su vecchie tecnologie che sono state sostituite con sistemi di espressione più efficienti 7. Inoltre, la maggior parte sono basati su ratto o umano MOG 8. Per alcune ricerche di autoimmunità in topi, un antigene basato sulla autoantigene del mouse MOG è preferibile. Infine, tutte le proteine MOG-based che abbiamo individuato, sia commerciale o come vettori di espressione, sono proteine di fusione contenenti amminoacidi supplementari alla base MOG 1-125. Questi includono un tag per la purificazione e di solito altre sequenze così, molte delle quali con una funzione siamo stati in grado di identificare. Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo generato una proteina di fusione romanzo basato sul mouse MOG dominio extracellulare fuso a un tag contenente tioredossina per combattere l&#39;insolubilità noto di MOG proteine 5. La sequenza di tag contiene anche una sequenza 6xHis di purificazione e di una proteasi TEV CLEsito Avage che permette la rimozione completa di tutte le sequenze di tag, se desiderato. Questo è l&#39;unico metodo che siamo consapevoli di generare puro proteina MOG 1-125. Per facilitare la produzione di grandi quantità di proteine, la sequenza MOG 1-125 era codone ottimizzato per l&#39;espressione batterica e la proteina di fusione tag MOG è stato inserito nel sistema di espressione pET-32. Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo per produrre e purificare MOG proteine tag, e puro MOG 1-125, utilizzando attrezzature non specializzati a disposizione maggior parte dei laboratori di immunologia.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot lab</td><td></td><td>Questi batteri sono necessari per produrre la proteina MOGtag. Le scorte di glicerolo di questi batteri sono disponibili su richiesta.</td></tr><tr><td>LB brodo mugnaio</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>bio basic</td><td>AB0028</td><td>Ricostituire la polvere in 50% etanolo/ 50% H2O a 100 mg/ml. Conservare a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>Ricostituire la polvere in H2O a 1M e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Lisozima uovo di gallina</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>Ricostituire in H2O a 50 mg/ml e conservare a -80 °C.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologie per la vita</td><td>salina tamponata con fosfato</td><td>20012-027</td><td>Non è richiesta soluzione salina tamponata con fosfato commerciale, è sufficiente qualsiasi soluzione salina tamponata con fosfato standard prodotta in laboratorio.</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidina-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>La qualità deve essere superiore al 98% di purezza.</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di nichel (II)</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>La sua resina legante</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>Conservare in etanolo al 20% 80% H2O a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Etanolo anidro</td><td>Alcoli commerciali</td><td>P016EAAN</td><td>Diluire con acqua secondo necessità.</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio triidrato</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina standard</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad test proteico reagente concentrato</td><td>bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico, sale disodico diidrato</td><td>Fisher scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW Tubo per dialisi in pelle di serpente</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>Questo reagente non deve essere maneggiato al di fuori di una cappa aspirante.</td></tr><tr><td>AcTEV protease</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>La produzione della propria proteasi TEV può essere realizzata utilizzando (https://www.addgene.org/8827/) e purificata come nel riferimento 17</td></tr><tr><td>Polietilenglicole 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp fondo piatto 96 pozzetti</td><td>piastra ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro per micropiastre Eon</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>Questa apparecchiatura utilizza il software di analisi dei dati Gen5.</td></tr><tr><td>Software di analisi dati Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodio dodecil solfato</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>blu bromofenolo</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione delle proteine</td><td>Termoscientifico</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>gel prefabbricato di poliacrilammide al 12%</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>Reagente colorante rapido</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>Gel dock EZ imager</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio per campioni a luce bianca</td><td>bio-rad</td><td>1708272&nbsp;</td><td>Utilizzato insieme all'imager EZ per gel dock per macchie blu coomassie</td></tr><tr><td>Scala portaproteine</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione semplici ed efficaci e purificazione di topo mielina oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale studi

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica del sistema nervoso centrale (SNC), che si pensa si verifichi a seguito di risposte autoimmuni che colpiscono la mielina. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è il modello animale più comune di malattia autoimmune del SNC ed è tipicamente indotta tramite immunizzazione con peptidi corti che rappresentano epitopi immunodominanti delle cellule T CD4+ delle proteine della mielina. Tuttavia, le cellule B riconoscono direttamente le proteine non trasformate e l'immunizzazione con peptide corto non attiva le cellule B che riconoscono la proteina nativa. Poiché recenti studi clinici sulle terapie che deplevano le cellule B nella SM hanno suggerito un ruolo delle cellule B nel guidare la malattia nell'uomo, c'è un urgente bisogno di modelli animali che incorporino il riconoscimento dell'autoantigene da parte delle cellule B. A tal fine, abbiamo generato una nuova proteina di fusione contenente il dominio extracellulare della versione murina della glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) e fusioni N-terminali di un His-tag per scopi di purificazione e la proteina tioredossina per migliorare la solubilità (MOG tag). È stato incorporato un sito di scissione della proteasi del virus dell'etch del tabacco (TEV) per consentire la rimozione di tutte le sequenze di tag, lasciando solo il dominio extracellulare MOG1-125 puro. Qui, descriviamo un semplice protocollo che utilizza solo apparecchiature di laboratorio standard per produrre grandi quantità ditag MOG puro o MOG1-125. Questo protocollo genera costantemente oltre 200 mg di proteinatag MOG. L'immunizzazione contag MOG o MOG1-125 genera una risposta autoimmune che include cellule B patogene che riconoscono il MOG nativo del topo.

Dopo la purificazione è completo, i campioni raccolti in passi 1.4, 2.1, 3.4, e il prodotto finale dal punto 6.4 devono essere eseguiti su un gel proteico (Figura 3A). Tag MOG deve prima apparire come un kDa banda 31.86 nel campione T O / N, ma non t 0, e dovrebbe essere l&#39;unica band nel prodotto puro finale. Per verificare se la proteina tag MOG ha correttamente piegato, la proteina tag MOG può essere usato per ...

Descriviamo un semplice protocollo che utilizza solo attrezzature di laboratorio di base per generare e purificare grandi quantità di una proteina di fusione che contiene glicoproteina oligodendrocitaria della mielina di topo. Questa proteina può essere utilizzata per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale guidata da cellule T e B.

Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è produrre una proteina basata sul dominio extracellulare della glicoproteina oligodendrocitaria della mielina o MOG, che può essere utilizzata per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale o EAE. Questo protocollo consente a qualsiasi laboratorio di produrre la proteina MOG da utilizzare come antigene per indurre l'EAE. Il principale vantaggio di questo protocollo è che non richiede attrezzature specializzate per la manipolazione delle proteine, ma può essere eseguito utilizzando attrezzature standard disponibili nella maggior parte dei laboratori di immunologia.Questo protocollo è stato ottimizzato per la proteina MOG con tag basata sulla versione murina e dovrebbe funzionare anche per altri sistemi di espressione della proteina MOG che incorporano un tag per la purificazione. Inoculare cinque millilitri di brodo sterilizzato con la glicerol stock di BL21 MOG tag e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto. Aggiungere 500 microlitri di ampicillina 100 milligrammi per millilitro a ciascuno di due becker da 500 millilitri contenenti 500 millilitri di LB sterile. Trasferire un millilitro della coltura notturna in ciascuno dei due becker contenenti brodo LB.Incubare a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto per cinque ore o fino a un'assorbanza ottica di 0,6. Una volta raggiunta la densità cellulare desiderata, aggiungere 0,5 millilitri di IPTG uno molare a ciascun flacone di coltura. Incubare il flacone a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto per quattro ore, quindi a temperatura ambiente e 75 giri al minuto per tutta la notte.Distribuire uniformemente le colture in bottiglie da 250 millilitri compatibili con la centrifugazione ad alta velocità e mantenere le bottiglie sul ghiaccio a partire da questo momento. Pellettare le cellule batteriche a 22.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere e combinare tutti i pellet batterici in un volume totale di 30 millilitri di buffer per lisati.Trasferire questo volume in un tubo da 50 millilitri con fondo rotondo, idoneo alla centrifugazione ad alta velocità. Posizionare il tubo in un bagno termico a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Durante il periodo di incubazione, agitare il tubo due volte per risospendere le cellule.Dopo l'incubazione, trasferire il tubo sul ghiaccio e sottoporre la soluzione a sonificazione a 20 kilohertz e ampiezza del 70%, con impulsi di tre secondi accesi e tre secondi spenti per cinque impulsi, ripetendo la sonificazione per un totale di sei cicli di cinque impulsi, facendo raffreddare la soluzione sul ghiaccio tra un ciclo e l'altro. Successivamente, centrifugare la soluzione a 24.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi risospendere il pellet in 30 millilitri di tampone A e incubare la soluzione a quattro gradi Celsius per tre ore. Dopo l'incubazione, sottoporre nuovamente la soluzione a sonificazione sul ghiaccio come in precedenza, quindi aggiungere 17,2 grammi di cloridrato di guanidina alla soluzione.Incubare il campione sul ghiaccio per un'ora per solubilizzare la proteina con tag MOG. Per caricare ed equilibrare la resina al nichel, lavare prima la resina aggiungendo 40 millilitri di acqua in ciascun tubo contenente la resina. Posizionare i tubi orizzontalmente su un agitatore e lasciarli agitare per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Al termine, centrifugare i tubi a 4500 ×g per otto minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante mediante pipettaggio per evitare di disturbare il pellet. Quindi aggiungere 40 millilitri di tampone di carica a ciascun tubo.Trasferire le provette su un agitatore e lasciarle agitare per 15 minuti a quattro gradi Celsius prima della centrifugazione, eseguita nuovamente come in precedenza. Eliminare il soprannatante e aggiungere 40 millilitri di tampone B alle provette. Trasferire le provette su un agitatore e lasciarle agitare per cinque minuti a quattro gradi Celsius prima di centrifugare nuovamente le provette con la resina.Per purificare la proteina con tag MOG, trasferire l'intero volume di proteina solubilizzata nel primo tubo contenente la resina al nichel. Dopo aver mescolato, posizionare il tubo orizzontalmente su un agitatore a quattro gradi Celsius per un'ora. Dopo aver centrifugato il tubo a 4500 ×g per otto minuti a quattro gradi Celsius, trasferire questo sopranatante nel secondo tubo di resina al nichel e incubare come in precedenza.Nel frattempo, risospendere la resina al nichel nel primo tubo in 40 millilitri di tampone di eluizione e posizionare il tubo orizzontalmente su un agitatore a quattro gradi Celsius per cinque minuti prima di centrifugare come in precedenza. Trasferire il surnatante contenente la proteina MOG con il tag in un flacone da 250 millilitri etichettato come proteina MOG purificata con tag. Mantenere questo flacone a quattro gradi Celsius.Ad ogni passaggio di eluizione, raccogliere il surnatante risultante in questa bottiglia. Aggiungere 40 millilitri di buffer di stripping al nickel presente nel primo tubo e posizionare orizzontalmente su un agitatore per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Centrifugare il tubo, scartare il surnatante e ricaricare il nickel come in precedenza.Una volta terminato, procedere con il secondo tubo come fatto per il primo tubo. Un totale di quattro cicli di assorbimento della proteina solubilizzata sulla resina di nichel carica e di eluizione recupererà la maggior parte della proteina. Tagliare circa 30 centimetri di tubo dialitico in pelle di serpente.Fissare un'estremità con una pinza emostatica a bloccaggio piegando l'estremità della pelle di serpente su se stessa tre volte e serrando l'estremità piegata con l'emostatico. Riempire la pelle di serpente con la proteina MOG tag diluita. Successivamente, rimuovere eventuali bolle d'aria dalla pelle di serpente spingendole fuori dall'estremità aperta.Infine, sigillare l'altra estremità del tubo utilizzando un secondo morsetto emostatico a chiusura. Successivamente, riempire un secchio grande con un litro di buffer acetato 1x contenente guanidina 4 M. Collocare nel secchio fino a due sezioni di tubo da dialisi contenenti la proteina MOG taggata.Utilizzando del nastro adesivo, fissare le pinze emostatiche al lato del contenitore in modo da lasciare spazio perché una bacchetta magnetica possa ruotare liberamente sul fondo. Posizionare il contenitore in una stanza a quattro gradi Celsius su una piastra magnetica e accenderla impostandola su una velocità di rotazione lenta. La dialisi richiede almeno tre giorni per ridurre gradualmente la quantità di guanidina nel tampone.Verificare regolarmente che il tubo sia intatto e che le estremità siano saldamente chiuse. Dopo quattro o cinque ore, aggiungere un litro di tampone acetato 1x al secchio della dialisi. Ripetere questa procedura ogni quattro o cinque ore per un totale di tre volte, ottenendo così un volume complessivo di quattro litri nel secchio.Dopo aver scartato metà del tampone nel contenitore, ricaricare con un litro di tampone acetato 1x e predisporre il tubo e il bacchetta magnetica. Infine, sostituire l'intero volume di quattro litri nel contenitore con quattro litri di tampone acetato 1x fresco e lasciare in agitazione per quattro-cinque ore. Per ottenere i migliori risultati, eseguire questo passaggio nel giorno della concentrazione della proteina.Per concentrare la proteina con tag MOG, foderare una piastra con carta d'alluminio e coprire la carta d'alluminio con PEG 3350 e PEG 1000 in rapporto uno a uno. Il PEG 3350 può aiutare a prevenire l'aggregazione proteica durante la concentrazione ed è un efficace crioprotettore. Posizionare il tubo in membrana di snakeskin contenente la proteina con tag MOG sulla carta d'alluminio e coprire con PEG 8000.Lasciare a temperatura ambiente e controllare regolarmente il volume fino a quando non risulti uguale o inferiore al volume finale stimato. Se durante il processo di concentrazione la penna si satura eccessivamente di acqua, preparare un nuovo contenitore con carta d'alluminio e PEG. Campioni della proteina prelevati in diverse fasi del protocollo di purificazione possono essere analizzati su un gel SDS-PAGE per confermare la purezza.Viene mostrato un gel rappresentativo che evidenzia il tag MOG altamente purificato a 31,86 kilodalton. Per verificare che la proteina del tag MOG si sia ripiegata correttamente, è stata valutata mediante citometria a flusso la capacità di legame della proteina del tag MOG con cellule B CD19 positive, CD4 negative, appartenenti ai linfonodi di topi C57 neri selvatici oppure di topi IgH MOG che esprimono una catena pesante di immunoglobulina specifica per la proteina MOG. Questo protocollo richiede un tempo minimo di 10 giorni dall'inizio alla fine.Durante l'intera procedura di isolamento, è importante tenere traccia della proteina e ricordare cosa deve essere conservato e cosa deve essere scartato. Non dimenticare che, quando si utilizza il solfato di nichel esaidrato impiegato per caricare la resina al nichel, si tratta di una sostanza estremamente pericolosa e si devono adottare precauzioni per evitare l'inalazione o il contatto con la pelle o gli occhi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre e purificare la propria proteina con tag MOG.Dopo la purificazione, la proteina con tag MOG può essere emulsionata in adiuvante di Freund completo e utilizzata come immunogeno per indurre l'EAE. L'EAE indotto dal tag MOG può essere impiegato per studiare il coinvolgimento di diversi tipi cellulari, come cellule CD4 o CDAT o cellule B, nell'autoimmunità del sistema nervoso centrale. A differenza dei peptidi brevi, che sono vincolati al complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), l'antigene proteico può essere utilizzato in qualsiasi ceppo di topi.

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Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra un'efficiente tecnica di omogeneizzazione per generare un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in un modello murino. L'emulsione contiene un autoantigene - la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) - in fase acquosa, circondata da una fase oleosa continua comprendente un batterio patogeno inattivato. L'emulsione garantisce un rilascio prolungato di antigeni per una risposta immunitaria prolungata.

Preparazione di un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune

Il video dimostra l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino iniettando una combinazione di glicoproteine oligodendrocitarie mieliniche e Mycobacterium tuberculosis inattivato. Il modello consente ai ricercatori di studiare i meccanismi della malattia e testare gli interventi terapeutici.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

Questo video mostra il metodo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) iniettando peptidi derivati dalla mielina con un adiuvante per attivare le cellule T autoreattive, che migrano verso il cervello. La tossina della pertosse viene somministrata per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo a queste cellule T e ad altre cellule immunitarie di entrare nel cervello. Queste cellule immunitarie causano demielinizzazione, portando a una compromissione...

Generazione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

In questo video, un modello murino di sclerosi multipla viene stabilito utilizzando l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Al topo viene iniettata un'emulsione contenente un peptide neuronale e un adiuvante, innescando una risposta immunitaria che attiva le cellule T autoreattive. Questo è seguito da un'iniezione di tossina della pertosse (PTX) per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo alle cellule T autoreattive di infiltrarsi nel cervello. Questa...

Fonte: Jain, R. W., et al. Produzione e purificazione semplici ed efficienti della glicoproteina oligodendrocitaria della mielina di topo per studi sperimentali sull'encefalomielite autoimmune. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'isolamento e la purificazione di MOGtag, una glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) ricombinante utilizzata negli studi sperimentali sull'encefalomielite autoimmune (EAE). Il protocollo prevede la lisi batterica, la sonicazione, la centrifugazione e la...

Isolamento e purificazione di glicoproteine oligodendrocitarie mieliniche ricombinanti

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla. C57BL / 6 topi sono immunizzati con mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), con un conseguente paralisi flaccida ascendente causata da cellule immunitarie autoreattive nel sistema nervoso centrale. Saranno discussi protocolli per l'induzione della malattia e monitoraggio.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in C57BL / 6 Mice

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multipla, i topi vengono immunizzati con un'emulsione acqua-in-olio contenente un autoantigene e un adiuvante completo di Freund. Mentre esistono diversi protocolli per la preparazione di queste emulsioni, qui viene presentato un protocollo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per la preparazione dell'emulsione.

Un metodo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per preparare emulsioni antigene/adiuvanti per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Ad oggi, i protocolli per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale dallo stesso topo sono una richiesta insoddisfatta. Il protocollo mostra una procedura applicabile nei topi con encefalomielite autoimmune naïve e sperimentale per studiare reti cellulari complesse durante la neuroinfiammazione e contemporaneamente ridurre il numero di topi richiesti.

Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla (SM), che condivide con la malattia umana una robusta risposta autoimmune umorale. Qui, riportiamo un protocollo ELISA semplice e flessibile per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi immunizzati con EAE.

Quantificazione degli anticorpi autoreattivi nei topi dopo encefalomielite autoimmune sperimentale

Impara a produrre e purificare la proteina MOG del topo per studiare l'encefalomielite autoimmune sperimentale. Questo metodo accessibile utilizza attrezzature standard di laboratorio per facilitare la ricerca sulla sclerosi multipla.

Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi (Video) | JoVE Journal

Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

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