Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di D. discoideum Uso Cellulare Imaging a temperatura controllata
2 dicembre 2016
L'ameba sociale Dictyostelium discoideum è stata recentemente istituita come sistema per studiare il misfolding e la proteostasi delle proteine. Qui, descriviamo una nuova metodologia basata sull'imaging per studiare l'aggregazione proteica indotta dalla temperatura e la risposta allo stress cellulare in D. discoideum.
L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging è osservare le perturbazioni cellulari indotte dallo stress termico nelle cellule di Dictyostelium discoideum. Questo metodo può aiutare a comprendere i meccanismi di risposta allo stress termico e il controllo della qualità delle proteine nell'ameba Dictyostelium discoideum. Il vantaggio principale di questa tecnica è il controllo stretto e preciso della temperatura applicata all'imaging del file delle cellule.
Per iniziare la procedura, preparare le cellule di Dictyostelium come descritto nel protocollo di testo. Il giorno prima dell'imaging, dividere le cellule in un mezzo a bassa fluorescenza a 10.000 cellule per millilitro. Prima dell'imaging, raccogliere le cellule dalla piastra di tessuto in LFM, quindi trasferire un numero adeguato di cellule in piastre con fondo di vetro.
Lasciare riposare le cellule per 20 minuti, quindi sostituire con cura il terreno utilizzato con un terreno fresco, per rimuovere le cellule non stabilizzate. Le celle dell'immagine in condizioni non sollecitate a 23 gradi Celsius, acquisiscono un minimo di sei campi visivi. Acquisisci Z-stack di un massimo di sette micrometri in incrementi da uno a 0,25 micrometri per catturare l'intero volume della cella.
Quindi acquisire un'immagine di riferimento in campo chiaro per valutare il numero totale di cellule. Quindi, regolare la temperatura della camera di raffreddamento a 30 gradi Celsius. Dopo che l'indicatore della temperatura ha raggiunto il valore desiderato, rimettere a fuoco manualmente nel canale del campo chiaro.
Controllare tutti i FOV registrati prima di iniziare il time-lapse, quindi avviare un time-lapse per quattro ore di stress termico con un intervallo di tempo da cinque a 10 minuti tra i punti temporali. Verificare che la messa a fuoco sia corretta durante l'acquisizione dei primi due punti temporali. Al termine dello stress termico, ridurre la temperatura a 23 gradi Celsius.
Attendere che il display della temperatura si regoli e rimettere a fuoco manualmente. Quindi registra filmati time-lapse nella fase di recupero per otto-10 ore a intervalli di tempo da 10 a 20 minuti. Verificare che la messa a fuoco sia corretta durante l'acquisizione del primo punto temporale.
Inizia aprendo il pacchetto di elaborazione delle immagini dotato del plug-in Cell Counter. Caricare la pila di immagini in campo chiaro facendo clic su File, quindi su Apri. Quindi, apri il plug-in Cell Counter, carica la pila di immagini facendo clic su Inizializza.
Scegliere il tipo di contatori facendo clic sulla casella appropriata. Successivamente, conta il numero totale di celle, salva i marcatori facendo clic su Salva marcatori. Una volta salvati i marcatori, caricare la proiezione massima dell'hyperstack di immagini a fluorescenza.
Apri il plug-in Cell Counter e carica i marcatori facendo clic su Carica marcatori. Quindi, scegli il tipo di marcatore per i focolai citosolici e conta le cellule. I marcatori esistenti possono essere utilizzati come guida per la posizione delle singole celle.
Recupera il numero di conteggi per fetta facendo clic su Risultati, quindi salva i conteggi altrove per ulteriori calcoli. In questo studio, la distribuzione della proteina Q103 della poliglutammina marcata con GFP è stata osservata nelle cellule di Dictyostelium. In condizioni di crescita normali, Q103-GFP è distribuito diffusamente nel citoplasma.
Durante lo stress termico, il marcatore Q103-GFP si fonde per punteggiare le strutture. Dopo il rilascio dello stress e la crescita in condizioni di crescita normali, queste strutture si dissolvono. La ridistribuzione di Q103-GFP e la formazione di focolai citosolici indotti da stress termico sono quantificate mediante analisi di immagine.
I risultati rappresentativi della risposta allo stress termico possono essere visti qui. Il numero di cellule con focolai citosolici di Q103-GFP aumenta di numero con il persistere dello stress da calore. Durante lo stress da caldo, il sistema di controllo della qualità delle proteine è sopraffatto, quindi le proteine inclini all'aggregazione non possono essere mantenute in uno stato solubile.
Dopo lo stress termico, il numero di cellule con focolai citosolici diminuisce, suggerendo che le proteine aggregate si dissolvono. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare le perturbazioni indotte dallo stress termico nell'ameba Dictyostelium discoideum. Durante l'imaging, è importante ricordare di assicurarsi che la messa a fuoco sia regolata correttamente, se il microscopio non possiede un autofocus hardware.
Il controllo della temperatura mostrato in questo protocollo può essere utilizzato oltre il campo della risposta allo stress termico. L'imaging in condizioni di crescita normali utilizzando il controllo della temperatura può ridurre notevolmente gli effetti fototossici.
Panoramica
Questo studio presenta una nuova metodologia di imaging per indagare l'aggregazione delle proteine indotta dalla temperatura e le risposte allo stress cellulare nell'ameba sociale Dictyostelium discoideum. La tecnica permette un controllo preciso della temperatura, consentendo ai ricercatori di osservare gli effetti dello stress termico sul controllo della qualità delle proteine.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- Aggregazione delle proteine
Sfondo
- Dictyostelium discoideum serve come organismo modello per studiare le risposte cellulari allo stress.
- Comprendere il dispiegamento errato delle proteine è cruciale per ottenere informazioni su varie malattie.
- Lo stress termico può portare all'aggregazione delle proteine, influenzando la funzione cellulare.
- Le tecniche di imaging sono essenziali per l'osservazione in tempo reale dei processi cellulari.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per osservare le perturbazioni cellulari indotte dallo stress termico.
- Chiarire i meccanismi di risposta allo stress termico in D. discoideum.
- Valutare l'efficacia del controllo della qualità delle proteine in condizioni di stress.
Metodi utilizzati
- Preparazione delle cellule Dictyostelium in mezzo a bassa fluorescenza.
- Imaging a temperature controllate (23°C e 30°C).
- Imaging time-lapse per monitorare le risposte cellulari nel corso di diverse ore.
- Analisi delle immagini per quantificare l'aggregazione e il recupero delle proteine.
Risultati principali
- La proteina Q103-GFP ha mostrato una distribuzione diffusa in condizioni normali.
- Durante lo stress termico, Q103-GFP ha formato strutture puntiformi indicanti aggregazione.
- Dopo lo stress, il numero di cellule con aggregazioni è diminuito, suggerendo un recupero.
- Il metodo ha dimostrato con successo le dinamiche di aggregazione e dissoluzione delle proteine.
Conclusioni
- La tecnica di imaging fornisce informazioni sulle risposte allo stress cellulare.
- Il controllo della temperatura è critico per l'osservazione accurata delle dinamiche delle proteine.
- Questa metodologia può essere applicata ad altre aree di ricerca sullo stress cellulare.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Temperature-controlled live cell imaging in Dictyostelium discoideum enables precise interrogation of protein quality control mechanisms under stress, supporting early-stage target validation for protein aggregation pathways. This approach enhances predictive confidence in mechanistic studies relevant to neurodegeneration and proteostasis. The method's ability to reduce phototoxicity and quantify dynamic protein aggregation provides actionable insights for portfolio triage in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein aggregation dynamics in a live, stress-responsive model.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cellular responses to heat-induced proteotoxic stress.
- Facilitates functional validation of protein quality control targets relevant to aggregation disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a validated imaging protocol for quantifying protein aggregation and dissolution events.
- Reduces phototoxicity, allowing higher imaging intensities for low-expression proteins.
- Supports reproducible, quantitative readouts suitable for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms of protein misfolding and aggregation.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for aggregation-targeted therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation of protein aggregation targets.
- Discovery Biology: Quantifies heat stress-induced protein aggregation, clarifying proteostasis pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation metrics for assay development.
- Analytics: Provides cell-level counts of aggregation events and recovery dynamics.
- Translational Research: Models disease-relevant stress responses for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse protein quality control studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation for protein aggregation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, mechanistic data on proteostasis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of aggregation-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging and quantitative image analysis.
- Demands temperature-controlled microscopy and compatible analytical software.
- Necessitates cross-team standardization for imaging parameters and data interpretation.
- Adaptable to other aggregation-prone protein models with protocol optimization.
- High cell motility and phototoxicity sensitivity require careful experimental design.
