Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

L'obiettivo generale di questo metodo è quantificare l'espressione sulla superficie cellulare delle proteine di membrana utilizzando un saggio fluorescente con spaziatura. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i saggi di citometria a flusso forniscono risultati quantificabili su grandi volumi di cellule vive in un singolo esperimento. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi e la terapia delle aritmie ventricolari cardiache, poiché queste patologie sono spesso associate a mutazioni genetiche che causano difetti nel traffico dei canali ionici cardiaci.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo hanno difficoltà a identificare un sito di inserzione extrorsale adatto per l'epitopo che non comprometta la funzione della proteina e generi un segnale fluorescente intenso in presenza dell'anticorpo coniugato. A dimostrare questa procedura sarà Benoite Bourdin, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Per iniziare, marcare in modo doppio i costrutti di DNA con mCherry al termine C intracellulare.

Inoltre, esprimere un epitopo emmagglutinina rivolto verso l'esterno della cellula, che può essere misurato mediante un anticorpo fluorescente per stimare l'espressione sulla superficie cellulare delle proteine di membrana. Successivamente, coltivare una piastra di cellule TSA201 utilizzando tecniche standard fino al raggiungimento di una confluenza del 90%. Per ogni campione, preparare i reagenti per la trasfezione in due provette.

Preparare un tubo da 1,5 millilitro contenente quattro microgrammi di DNA e 250 microlitri di mezzo con siero ridotto, e un secondo tubo contenente 10 microlitri del reagente per trasfezione mediata da liposomi e 250 microlitri di mezzo di coltura con siero ridotto. Mescolare delicatamente i due tubi e incubarli per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, unire delicatamente il contenuto del primo e del secondo tubo e incubare i complessi di DNA con liposomi per 20 minuti a temperatura ambiente.

Aggiungere i complessi alle cellule in coltura e agitare delicatamente la piastra. Rimettere la piastra a 37 gradi Celsius e in un'atmosfera al 5% di anidride carbonica per 24 ore. A 24 ore dall'aggiunta del reagente di trasfezione, rimuovere il mezzo dalla piastra e lavare attentamente le cellule con 400 microlitri di tripsina-EDTA preriscaldata.

Quindi, aggiungere 400 microlitri di tripsina-EDTA e incubare la piastra per cinque minuti per consentire alle cellule di staccarsi dalla piastra. Una volta staccate, arrestare la digestione enzimatica aggiungendo un millilitro di mezzo di coltura freddo privo di penicillina o streptomicina alle cellule. Pipettare delicatamente il mezzo sulla piastra da quattro a cinque volte per rimuovere tutte le cellule dalla superficie.

Quindi, raccogliere le cellule in provette sterili da 1,5 millilitro e posizionarle immediatamente sul ghiaccio. Per i passaggi successivi, utilizzare soluzioni fredde di ghiaccio e mantenere le cellule a quattro gradi per prevenire l'internalizzazione dell'epitopo di superficie. Inoltre, ridurre l'esposizione delle cellule alla luce al fine di limitare la fotodegradazione del segnale fluorescente.

Successivamente, centrifugare i tubi per formare il pellet cellulare. Quindi, aspirare con attenzione e scartare il soprannatante ottenuto. Ri-sospendere il pellet per preparare una sospensione di cellule singole utilizzando un millilitro di PBS.

Quindi, centrifugare brevemente i tubi. Raccogliere e risospendere nuovamente il pellet cellulare per rimuovere completamente il mezzo di coltura. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in 600 microlitri di PBS.

Misurare la concentrazione cellulare e regolarla a almeno tre milioni di cellule per millilitro. Successivamente, dividere le cellule in nuove provette da 1,5 millilitro. Assicurarsi di includere i controlli appropriati per discriminare la colorazione specifica da quella non specifica, nonché per la colorazione extracellulare e anche per quella intracellulare.

L'anticorpo di controllo isotopico aiuterà a valutare il livello di colorazione di fondo e deve corrispondere all'anticorpo primario, all'isotopo appropriato e al fluorocromo. È importante utilizzare l'anticorpo di controllo isotopico e l'anticorpo fluorescente alla stessa concentrazione. Per stimare l'espressione sulla superficie cellulare delle proteine di membrana, etichettare innanzitutto l'epitopo HA esposto all'esterno cellulare utilizzando un anticorpo coniugato a un fluorocromo.

Quindi, aggiungere un anticorpo monoclonale anti-HA coniugato con FITC a cinque microgrammi per millilitro nel tubo. Vortexare brevemente le cellule e quindi incubarle su una piattaforma oscillante al buio. Rimuovere le cellule dal buio e aggiungere 900 microlitri di PBS.

Quindi centrifugare il tubo per formare il pellet cellulare ed aspirare il sopranatante. Successivamente, lavare le cellule risospendendo il pellet in un millilitro di PBS e vortexando brevemente le cellule. Quindi, ripetere il passaggio di centrifugazione per ottenere nuovamente il pellet cellulare.

Ripetere questo passaggio di lavaggio per un totale di tre volte per rimuovere qualsiasi anticorpo non legato. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS e trasferire la sospensione monocellulare in un tubo da citometria a flusso da cinque millilitri. Mantenere le cellule al buio a quattro gradi Celsius fino all'analisi del campione.

Per stimare l'espressione intracellulare della proteina totale, etichettare successivamente le cellule permeabilizzate. Questo viene effettuato utilizzando un protocollo simile a quello per l'etichettatura extracellulare, ma con l'aggiunta di un buffer di permeabilizzazione cellulare a base di saponina. Centrifugare le cellule, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di soluzione di fissazione e permeabilizzazione direttamente dallo stock preparato.

Incubare le cellule al buio a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio per permeabilizzazione appena preparato e vortexare brevemente le cellule. Poi, centrifugare le cellule e lavarle altre due volte utilizzando il tampone di lavaggio per permeabilizzazione.

Quindi, aggiungere l'anticorpo monoclonale anti HA coniugato con FITC a 5 microgrammi per millilitro e 100 microlitri del buffer di lavaggio per permeabilizzazione. Vortexare brevemente le cellule e incubarle al buio a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri del buffer di lavaggio per permeabilizzazione.

Centrifugare le cellule e lavarle tre volte in 100 microlitri dello stesso tampone precedentemente indicato. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS e trasferire la sospensione di singole cellule in un tubo da citometria a flusso da cinque millilitri. Analizzare le cellule non permeabilizzate e quelle permeabilizzate mediante citometria a flusso nello stesso giorno.

Per iniziare, avviare il software di analisi della citometria a flusso e importare i file fcs creati durante la citometria a flusso. Fare clic sul primo campione e iniziare il processo di gating nel grafico della diffusione laterale rispetto alla diffusione anterograda. Successivamente, disegnare la finestra P1 utilizzando l'icona ellisse attorno alle cellule vitali per eliminare eventuali detriti, cellule morte o aggregati.

Quindi, tracciare il grafico a contorno del parametro del tubo di mCherry rispetto all'intensità di fluorescenza di FITC. Impostare la finestra P2 attorno alle cellule positive per FITC e mCherry e la finestra P3 attorno alla popolazione cellulare negativa per la fluorescenza. Successivamente, selezionare le finestre P2 e P3 e fare clic sull'icona per aggiungere le statistiche nella finestra originale dell'area di lavoro.

Fare clic su "count" e quindi su "mean". Infine, applicare i parametri delle porte e le statistiche a tutti i campioni analizzati dal citometro. Questo protocollo è stato utilizzato per caratterizzare il ruolo della N-glicosilazione sull'espressione totale e sulla superficie cellulare di CaV Alpha 2 Delta 1 in cellule TSA201.

Per accedere all'espressione delle proteine della superficie cellulare, l'HA è stato misurato su cellule non permeabilizzate che presentavano siti di N-glicosilazione interrotti in quattro punti, in sedici punti o in nessun punto. I livelli di FITC erano elevati nel tipo selvatico e nelle cellule con N-glicosilazione interrotta in quattro posizioni, ma sono stati rilevati solo livelli di fondo nelle cellule con sedici posizioni interrotte. Per le cellule permeabilizzate, la fluorescenza di FITC è aumentata in tutte le condizioni, indicando che tutte le proteine trasfettate, marcate con HA, CaV Alpha 2 Delta 1, sono state colorate e rilevate dall'anticorpo anti-HA coniugato a FITC.

Inoltre, i livelli di fluorescenza di mCherry erano simili tra cellule permeabilizzate e non permeabilizzate, indicando che la permeabilizzazione non altera il segnale relativo di mCherry. I saggi condotti dopo la permeabilizzazione cellulare hanno mostrato che anche l'espressione proteica totale nelle cellule con 16 posizioni interrotte era significativamente ridotta, sia che fosse dedotta dalla fluorescenza FITC in cellule permeabilizzate, sia dalla fluorescenza costitutiva di mCherry misurata in cellule non permeabilizzate e permeabilizzate. Oltre a questa procedura, possono essere effettuate ulteriori registrazioni fisiologiche al fine di correlare espressione e funzione dei canali ionici.

Questa tecnica apre inoltre la strada ai ricercatori del settore medico per studiare l'impatto delle mutazioni genetiche, delle modifiche post-traduzionali, dei microRNA, delle piccole GTPasi e del ruolo delle chaperone nel traffico delle proteine di membrana espresse in cellule ricombinanti o native. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe acquisire una buona comprensione su come eseguire la trasfezione del DNA in cellule ricombinanti, su come colorare le cellule NTAC e permeabilizzate, nonché su come effettuare l'analisi dei dati sui campioni. Non dimenticare che lavorare con cellule vive richiede precauzioni, come operare nel flusso laminare per la trasfezione e indossare guanti durante la manipolazione di sostanze chimiche.