Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

L'obiettivo generale di questo metodo è quantificare l'espressione della superficie cellulare delle proteine di membrana utilizzando un saggio spaziato fluorescente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i saggi di citometria a flusso forniscono endpoint quantificabili su grandi volumi di cellule vive in un singolo esperimento. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una diagnosi e una terapia delle aritmie ventricolari cardiache perché queste patologie sono spesso associate a mutazioni genetiche che causano difetti nel traffico dei canali ionici cardiaci.

Generalmente gli individui nuovi a questo metodo faticano a identificare un sito di inserzione estrarale adatto per l'epitopo che non danneggi la loro funzione proteica e generi un forte segnale fluorescente in presenza dell'anticorpo coniugato. A dimostrare questa procedura sarà Benoite Bourdin, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Per iniziare, il DNA doubley tag costrut con mCherry al C-terminale intracellulare.

Inoltre, esprimere un epitopo di emomagglutinina extra cellulare, che può essere misurato utilizzando un anticorpo a fluorescenza per stimare l'espressione della superficie cellulare delle proteine di membrana. Successivamente, coltivare una piastra di cellule TSA201 utilizzando tecniche standard fino a raggiungere il 90% di confluenza. Per ogni campione preparare i reagenti di trasfezione in due provette.

Preparare una provetta da 1,5 millilitri con quattro microgrammi di DNA e 250 microlitri di terreno sierico ridotto e una seconda provetta con 10 microlitri di reagente di trasfezione mediata da liposomi e 250 microlitri di terreno di coltura sierologico ridotto. Mescolare delicatamente le due provette e incubarle per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, unire delicatamente il contenuto della provetta uno e della provetta due e incubare i complessi di DNA liposomico per 20 minuti a temperatura ambiente.

Aggiungere i complessi alle cellule coltivate e far oscillare delicatamente il piatto di coltura. Riposizionare il piatto a 37 gradi Celsius e sotto un'atmosfera di anidride carbonica al 5% per 24 ore. 24 ore dopo l'aggiunta del reagente di trasfezione, rimuovere il terreno dalla piastra di coltura e lavare accuratamente le cellule con 400 microlitri di tripsina-EDTA preriscaldata.

Quindi, aggiungere 400 microlitri di tripsina-EDTA e incubare la capsula per cinque minuti per consentire alle cellule di staccarsi dalla capsula. Una volta staccato, fermare la digestione enzimatica aggiungendo alle cellule un millilitro di terreno di coltura freddo senza penicillina o streptomicina. Pipettare delicatamente il terreno sulla piastra quattro o cinque volte per lavare tutte le cellule dalla superficie.

Quindi, raccogliere le cellule in provette sterili da 1,5 millilitri e posizionarle immediatamente sul ghiaccio. Per i passaggi successivi, utilizzare una soluzione ghiacciata e mantenere le celle a quattro gradi per evitare l'internalizzazione dell'epitopo superficiale. Inoltre, diminuire l'esposizione delle cellule alla luce per limitare il fotosbiancamento del segnale fluorescente.

Quindi, centrifugare le provette per pellettare le cellule. Quindi, aspirare con cura e scartare il surnatante risultante. Risospendere il pellet per preparare una sospensione a cella singola utilizzando un millilitro di PBS.

Quindi, centrifugare brevemente le provette. Pellettare e risospendere nuovamente le cellule per rimuovere completamente il terreno di coltura. Quindi, risospendere il pellet della cella in 600 microlitri di PBS.

Misurare la concentrazione delle celle e regolarla ad almeno tre milioni di cellule per millilitro. Quindi, dividere le cellule in nuove provette da 1,5 millilitri. Assicurarsi di includere i controlli appropriati per discriminare la colorazione specifica da quella non specifica e per la colorazione extra cellulare e anche per la colorazione intracellulare.

L'anticorpo di controllo isotopico aiuterà a valutare il livello di colorazione di fondo e dovrebbe corrispondere all'anticorpo primario, all'isotopo di buon auspicio e al fluoroforo. È importante utilizzare l'anticorpo isotopico di controllo e l'anticorpo fluorescente alla stessa concentrazione. Per stimare l'espressione della superficie cellulare delle proteine di membrana, etichettare prima solo l'epitopo HA rivolto verso le cellule utilizzando un anticorpo coniugato alla luce fluorescente.

Quindi, aggiungere alla provetta un anticorpo monoclonale anti-HA coniugato con FITC a cinque microgrammi per millilitro. Agitare brevemente le cellule e poi incubarle su una piattaforma a dondolo al buio. Togliete le cellule dal buio e aggiungete 900 microlitri di PBS.

Quindi centrifugare la provetta per pellettare le cellule e aspirare il surnatante. Successivamente, lavare le celle risospendendo il pellet in un millilitro di PBS e facendo vorticare brevemente le cellule. Quindi, ripetere il passaggio della centrifuga per pellettare nuovamente le cellule.

Ripetere questa fase di lavaggio per un totale di tre volte per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS e trasferire la sospensione di una singola cellula in una provetta per citometria a flusso da cinque millilitri. Tenere le celle al buio a quattro gradi Celsius fino all'analisi del campione.

Per stimare l'espressione intracellulare della proteina totale, etichettare le cellule permeabilizzate. Ciò si ottiene utilizzando un protocollo simile alla marcatura extracellulare, ma con l'aggiunta di un tampone di permeabilizzazione cellulare a base di saponine. Pellettare le cellule, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di soluzione di permeabilizzazione di fissazione direttamente dal grezzo preparato.

Incubare le cellule al buio a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio per permeabilizzazione appena preparato e agitare brevemente le cellule. Quindi, pellettare le celle e lavarle altre due volte utilizzando il tampone di lavaggio per permeabilizzazione.

Quindi, aggiungere l'anticorpo monoclonale anti HA coniugato con FITC a 5 microgrammi per millilitro e 100 microlitri del tampone di lavaggio per permeabilizzazione. Brevemente il vortice delle cellule e incubare le cellule al buio a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio per permeabilizzazione.

Pellettare le celle e lavarle tre volte in 100 microlitri dello stesso tampone come mostrato in precedenza. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS e trasferire la sospensione di singole cellule in una provetta per citometria a flusso da cinque millilitri. Far passare le cellule non permeabilizzate e permeabilizzate attraverso il citometro a flusso lo stesso giorno.

Per iniziare, avviare il software di analisi della citometria a flusso e importare i file fcs creati durante la citometria a flusso. Fare clic sul primo campione e avviare il processo di gating nel grafico della dispersione laterale rispetto alla dispersione diretta. Quindi, disegna il cancello P1 usando l'icona dell'ellisse attorno alle celle vive per eliminare eventuali detriti, celle morte o aggregati.

Quindi, disegna il grafico del contorno dei parametri del tubo dell'intensità di fluorescenza mCherry rispetto a FITC. Impostare il gate P2 attorno alle cellule positive FITC e mCherry e il gate P3 attorno alla popolazione di cellule negative alla fluorescenza. Quindi, seleziona i gate P2 e P3 e fai clic sull'icona Aggiungi statistiche nella finestra dell'area di lavoro originale.

Fare clic su conteggio e quindi fare clic su media. Infine, applicare i parametri e le statistiche di gates a tutti i campioni sondati dal citometro. Questo protocollo è stato utilizzato per caratterizzare il ruolo della N-glicosilazione sull'espressione totale e sulla superficie cellulare di CaV Alpha 2 Delta 1 nelle cellule TSA201.

Per accedere alla superficie cellulare, l'espressione proteica dell'HA è stata misurata su cellule non permeabilizzate che avevano siti di N-glicosilazione interrotti in quattro siti, 16 siti o nessun sito. I livelli di FITC erano forti nel tipo selvatico e le cellule con cellule di N-glicosilazione sono state interrotte in quattro posizioni, ma solo i livelli di fondo sono stati trovati nelle cellule con 16 posizioni interrotte. Per le cellule permeabilizzate, la fluorescenza FITC è aumentata per tutte le condizioni, indicando che tutte le proteine CaV Alpha 2 Delta 1 trasfettate, marcate con HA, sono state colorate e rilevate dall'anticorpo anti HA FITC.

Inoltre, i livelli di fluorescenza di mCherry erano simili per le cellule permeabilizzate e non permeabilizzate, il che significa che la permeabilizzazione non altera il segnale relativo di mCherry. I saggi condotti dopo la permeabilizzazione cellulare hanno mostrato che anche l'espressione proteica totale per le cellule con 16 posizioni interrotte era significativamente diminuita, sia che fosse dedotta dalla fluorescenza FITC nelle cellule permeabilizzate o dalla fluorescenza mCherry costitutiva misurata nelle cellule non permeabilizzate e nelle cellule permeabilizzate. Oltre a questa procedura, è possibile eseguire registrazioni fisiologiche extra per correlare l'espressione e la funzione dei canali ionici.

Questa tecnica apre anche la strada ai ricercatori in campo medico per studiare l'impatto delle mutazioni genetiche, le modificazioni post-traduzionali, i microRNA, le piccole GTPasi e il ruolo degli chaperoni nel traffico di proteine di membrana espresse in cellule ricombinanti o native. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione su come eseguire la trasfezione del DNA nelle cellule ricombinanti, per colorare NTAC e cellule permeabilizzate, nonché per eseguire l'analisi dei dati sui campioni. Non dimenticare che lavorare con cellule vive richiede precauzioni come lavorare nel liquido elaminare per la trasfissione e indossare guanti quando si maneggiano sostanze chimiche.