L'utilizzo di una cartuccia filtrante per filtrazione di acqua campioni ed estrazione di DNA ambientale

L'obiettivo generale di questo protocollo è filtrare i campioni d'acqua con una cartuccia filtrante ed estrarre il DNA ambientale senza dover aprire l'alloggiamento per rimuovere il filtro dal metabarcoding dell'eDNA di vari organismi acquatici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo ecologico, come il monitoraggio della biodiversità e l'ecologia di comunità. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cartucce filtranti possono ospitare volumi d'acqua maggiori e la filtrazione e l'estrazione del DNA possono essere eseguite in modo sterile.

Per iniziare questa procedura, collegare il tubo per alto vuoto al connettore di ingresso di una pompa aspiratore. Collegare l'altra estremità del tubo a un collettore. Assicurarsi che le tre valvole a T rosse sul collettore siano in posizione off.

Quindi, indossa un paio di guanti puliti. Inserire un raccordo luer femmina all'estremità superiore del tubo di gomma del vuoto. Quindi, inserire un connettore per il vuoto all'estremità inferiore.

Fissare con cautela il raccordo luer femmina a una porta di uscita della cartuccia del filtro. Quindi, collegare il connettore del vuoto a un tappo in silicone. Versare un litro di acqua campionata nel sacchetto di plastica preparato.

Racchiudere il tappo a vite con il connettore luer-lock maschio. Quindi, collegare con cautela una porta di ingresso della cartuccia filtrante assemblata con il connettore luer-lock maschio. Assicurarsi che tutte le connessioni siano sicure.

Quindi, appendi il sacchetto di plastica a due rebbi sul pannello in rete. Inserire un tappo in silicone nella porta di ingresso del collettore. Quindi, accendi l'aspiratore.

Aprire le valvole a T rosse per la filtrazione. Far funzionare il collettore fino a quando la cartuccia del filtro non è asciutta. Quindi, chiudere le valvole a T rosse.

Ripetere l'intero processo per filtrare la quantità d'acqua desiderata. Una volta filtrata tutta l'acqua campionata, rimuovere con cautela la cartuccia del filtro dal sacchetto di plastica e dal contenitore sottovuoto. Coprire entrambe le estremità della cartuccia con gli appositi tappi luer.

Quindi, utilizzando una penna a prova di solvente, etichettare la cartuccia e il tappo luer di ingresso. Conservare a 20 gradi Celsius fino al momento di eseguire l'estrazione del DNA. Per campioni più grandi di quattro litri, preparare una bottiglia da dieci litri come descritto nel protocollo di testo.

Aggiungere il campione d'acqua da filtrare. Quindi, inserire saldamente un puntale per pipetta da dieci millilitri nella valvola del flacone del libro. Inserire saldamente la porta di ingresso della cartuccia del filtro nel puntale della pipetta.

Quindi, inserire un tappo in silicone nella porta di ingresso del collettore. Accendi l'aspiratore. Quindi, aprire le valvole a T rosse per la filtrazione.

Far funzionare il collettore fino a quando la cartuccia del filtro non è asciutta. Al termine della filtrazione, chiudere le valvole a T rosse. Rimuovere con cautela la cartuccia dal sacchetto di plastica e dal connettore del vuoto.

Quindi tappare entrambe le estremità della cartuccia con gli appositi cappucci luer. Utilizzare una penna a prova di solvente per etichettare la cartuccia e il tappo luer di ingresso. Conservare a 20 gradi Celsius fino al momento di eseguire l'estrazione del DNA.

Preriscalda un'incubatrice a 56 gradi Celsius. Quindi, tagliare il tappo incernierato da un tubo da 2,0 millilitri e gettare il tappo. Rimuovere il tappo luer di ingresso dalla cartuccia del filtro.

Quindi, inserire la porta di ingresso nel tubo da 2,0 millilitri. Utilizzando una pellicola autosigillante, sigillare ermeticamente il collegamento tra la cartuccia e il tubo di raccolta. Quindi, inserire l'unità combinata in un adattatore da centrifuga per una provetta conica da 15 millilitri.

Centrifugare la cartuccia per un minuto a 5000 volte g per rimuovere il liquido rimasto nel filtro. Una volta completata la centrifugazione, rimuovere la provetta di raccolta dalla cartuccia filtrante e gettare la provetta. Quindi, richiudere la porta di ingresso.

Successivamente, mescolare 20 microlitri di soluzione di proteina A-Case, 220 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato e 200 microlitri di tampone AL. Rimuovere il tappo di ingresso e aggiungere la miscela nella cartuccia utilizzando una pipetta, inserendo completamente la pipetta nella porta di ingresso. Ricapitolare la porta di ingresso. Quindi, posizionare la cartuccia del filtro su uno shaker rotante.

Posizionare l'agitatore rotante nell'incubatrice preriscaldata e impostare l'agitatore a 20 giri/min per 20 minuti. Durante l'incubazione, etichettare una nuova provetta da 2,0 millilitri con una penna resistente ai solventi. Quindi, mettilo in un tubo conico da 50 millilitri.

Al termine dell'incubazione, rimuovere il tappo di ingresso. Quindi, inserire la porta di ingresso nel nuovo tubo da 2,0 millilitri. Tappare il tubo conico con un tappo a vite.

Centrifugare per un minuto a 5000 volte g per raccogliere il DNA estratto. Quindi, rimuovere la cartuccia nel tubo da 2,0 millilitri utilizzando una pinza sterilizzata. Tappare la provetta e purificare il DNA estratto come indicato nel protocollo di testo.

In questa procedura, quattro diversi volumi di acqua di mare vengono filtrati sullo stesso collettore utilizzando due filtri unici e l'eDNA viene successivamente estratto. La cartuccia filtrante ha rilevato, in media, il 50% in più di specie rispetto ai filtri in fibra di vetro. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come filtrare i campioni d'acqua con una cartuccia filtrante e come estrarre l'eDNA senza dover aprire l'alloggiamento per rimuovere il filtro dal metabarcoding dell'eDNA di vari organismi acquatici.