hyperpolarized ¹³ C metabolica spettroscopia di risonanza magnetica e Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di iperpolarizzare le molecole marcate con carbonio 13 utilizzando la polarizzazione nucleare dinamica e di misurare la loro conversione enizmatica utilizzando la risonanza magnetica al carbonio 13, imaging retroscopico, in vitro. Questo metodo aumenta il segnale di risonanza del carbonio da 10.000 a 100.000 volte, consentendo ai composti stratificati di essere distinti dai loro prodotti metabolici e di essere localizzati nel corpo mediante imaging. Il vantaggio principale di questo metodo, rispetto, ad esempio, alle tecniche VR, è che fornisce una visione del metabolismo delle sostanze presenti naturalmente negli organismi viventi in tempo reale.

Anche questo metodo può fornire informazioni sul metabolismo del cancro e su come è in vitro. Può essere applicato anche a modelli animali e pazienti umani. L'applicazione di questa tecnica supera la localizzazione del tumore.

Può essere utilizzato per trovare e distinguere i sottotipi di tumore metabolici e per monitorare il trattamento insieme a tecniche all'avanguardia. Per iniziare la procedura, preparare prima una soluzione millimolare di gadoterato meglumina e un concentrato di 13 piruvato a un carbonio. Aggiungere il radicale tritile OX063 alla miscela per ottenere una concentrazione finale di 15 millimolari e scioglierla completamente.

Nel software DNP Polarizer, fare clic su Raffredda per diminuire la temperatura dell'inserto a temperatura variabile, o VTI, al di sotto di 1.4 kelvin. Una volta che il VTI si è raffreddato, mettere circa otto microlitri della soluzione campione marcata con carbonio 13 in un bicchiere di plastica. Fissare la tazza all'asta di inserimento del campione.

Nel software, fare clic su Inserisci campione'Seleziona campione normale'e quindi su Avanti'Questo solleva il supporto del campione e apre le valvole di ingresso al VTI, consentendo l'inserimento del campione. Al prompt, utilizzare l'asta di inserimento per spingere la coppa del campione nel VTI. Staccare la coppa del campione ed estrarre con cautela l'asta di inserimento.

Verificare che il campione sia stato staccato dall'asta e non sia stato spinto fuori dal VTI durante la procedura di chiusura. Fare clic su Avanti'per chiudere le valvole e abbassare la tazza del campione nell'elio liquido, quindi fare clic su Fine'Per trovare una frequenza di polarizzazione ottimale, avviare prima il software RIMR. Nella schermata di configurazione, fare clic su Seleziona campione' e Esegui micro spazzata'Crea il file in cui verranno archiviati i dati.

Torna al software DNP Polarizer. Selezionare la scheda Calibra, impostare i parametri di scansione a microonde, quindi avviare il processo di scansione a microonde. Una volta terminato lo sweep a microonde, annotare la frequenza con un'ampiezza massima del segnale misurata.

Torna al software RINMR e seleziona Accumulo solido'Quindi, nel software DNP Polarizer, fai clic su Polarizzazione'Immettere la frequenza e la potenza ottimali delle microonde. Fare clic su Avanti'Abilita monitoraggio dell'accumulo di polarizzazione'e fare clic su Fine'Polarizzare il campione per un periodo di tempo sufficiente per ottenere una polarizzazione superiore al 95%. Durante la polarizzazione, collegare un pallone di raccolta al tubo di scarico del campione iperpolarizzatore e posizionarlo vicino allo spettrometro.

Configura uno spettrometro NMR di Tesla con la serie di 13 scansioni al carbonio di impulsi RF a 110 gradi a intervalli di tre secondi. Durante la polarizzazione del piruvato, iniziare la preparazione della coltura cellulare. Rimuovere il terreno cellulare dai matracci per colture cellulari.

Lavare le cellule con circa 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Aggiungere cinque millilitri di tripsina al pallone di coltura. Incubare la coltura per tre-cinque minuti a 37 gradi Celsius, quindi disattivare la tripsina con circa cinque millilitri di terreno F12K contenente il 10% di siero fetale di vitello in volume.

Quindi, trasferire il volume della sospensione cellulare contenente il numero desiderato di cellule in una provetta da centrifuga di plastica. Centrifugare il campione di cellule a 1200 G per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pallet in una quantità sufficiente di terreno F12K con il 10% di FCS per ottenere un volume finale di 800 microlitri.

Trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e posizionare la provetta in un contenitore di plastica riempito con acqua tiepida. Per iniziare la raccolta dei dati tramite spettroscopia di risonanza magnetica al carbonio 13, una volta preparato il campione di cellule e la polarizzazione del piruvato è superiore al 95%, fare clic su Esegui dissoluzione' nel software DNP Polarizer. Caricare il volume dosato dell'agente di dissoluzione attraverso la valvola superiore della camera di dissoluzione.

Spostare lo stick di dissoluzione in posizione attiva. Confermare facendo clic su Avanti'Una volta che il campione di cellula è pronto per l'esperimento, fare clic su Fine'nel software DNP Polarizer per inizializzare il processo di dissoluzione. Attendi fino al termine del processo di dissoluzione.

Aggiungere 200 microlitri della soluzione di piruvato iperpolarizzato a 800 microlitri del campione cellulare. Mescolare bene con una pipetta, quindi mettere circa 600 microlitri di miscela in una provetta NMR da cinque millimetri. Caricare il tubo NMR nello spettrometro e fare clic su Esegui' per avviare la misurazione.

Quindi, spostare lo stick di dissoluzione con la tazza del campione attaccata nella posizione di pulizia e fare clic su Fine'nel software DNP Polarizer. Per iniziare la risonanza magnetica al carbonio 13, dopo aver iniziato il processo di iperpolarizzazione, trasferire 800 microlitri di campione di cellule ri-sospeso con un numero di cellule di almeno 10 all'ottava in una siringa da tre millilitri. Collegare la siringa a un catetere lungo e posizionare la siringa su un lettino per la risonanza magnetica.

Assicurarsi che il catetere sia sufficientemente lungo da raggiungere l'esterno dello scanner MRI. Posizionare un fantoccio di calibrazione, contenente dieci molari di carbonio 13 urea con il 10% di gadoterato meglumina accanto alla siringa. Posizionare una bobina del ricevitore RF in carbonio 13-tuned sulla siringa.

Inserire il piano di scansione nello scanner in modo che l'oggetto di interesse si trovi nell'isocentro dello scanner MRI. Collegare il pallone di connessione al tubo di scarico del campione iperpolarizzatore e posizionarlo vicino all'estremità del catetere. Eseguire una sequenza di localizzazione standard su tre piani e, se necessario, regolare la posizione della siringa.

Quindi, impostare ed eseguire una sequenza anatomica pesata in T2 di protoni che copre la localizzazione della siringa. Dalle immagini anatomiche risultanti, selezionare cinque fette continue della regione di interesse, incluso il fantoccio di carbonio-13. Impostare un'acquisizione di calibrazione spettroscopica al carbonio 13 e selezionare la sequenza di calibrazione di siegert a blocchi 2D dalla libreria di sequenze di impulsi.

Scaricare la sequenza di impulsi sullo scanner ed eseguire una pre-scansione spettroscopica. Nel grafico della magnitudine dello spettro, impostare il picco fantasma di calibrazione del carbonio 13 al centro della frequenza dello scanner. Impostare i guadagni del ricevitore al massimo e fare clic su Scansione' per eseguire la sequenza di calibrazione.

Registra il guadagno di trasmissione riportato e la frequenza centrica. Quindi, impostare un'acquisizione di imaging a spostamento chimico al carbonio 13 per le fette anatomiche scelte. Scegli la sequenza di imaging spettroscopico ecoplanare 2D e scarica la sequenza di impulsi sullo scanner.

Eseguire la pre-scansione spettroscopica e regolare la frequenza centrica e il guadagno di trasmissione in base ai valori di calibrazione per completare l'impostazione dello spettrometro MRI. Una volta che il piruvato raggiunge il 95% di polarizzazione, fare clic su Esegui dissoluzione'nel software DNP Polarizer e caricare l'agente di dissoluzione. Spostare lo stick di dissoluzione in posizione attiva.

Fare clic su Avanti'e poi su Fine'Quando il campione iperpolarizzato disciolto raggiunge il pallone di raccolta, aspirare circa 1 millilitro della soluzione iperpolarizzata in una siringa e iniettarla nel catetere in modo che 200 microlitri raggiungano il campione di cellule. Fare clic su Scansione' per avviare l'acquisizione dei dati sperimentali. Una volta terminata la raccolta dei dati, spostare lo stick di dissoluzione con la tazza del campione attaccata nella posizione di pulizia e fare clic su Fine'nel software DNP NMR.

Il tasso di scambio metabolico del piruvato in lattato è stato studiato nelle cellule PC3 del carcinoma prostatico monitorando l'intensità del segnale della spettroscopia NMR al carbonio 13 del lattato iperpolarizzato e del piruvato rispetto alla frequenza e al tempo. I valori cinetici del lattato sono stati valutati mediante un modello a rapporto semplice e un modello differenziale di scambio a due siti, e normalizzati al numero di cellule. In entrambi i modelli, è stata osservata una tendenza alla diminuzione della produzione di lattato con un numero crescente di cellule.

Ciò è attribuito a concentrazioni cellulari più elevate e a una maggiore viscosità del campione. I campioni con una conta cellulare inferiore a due volte dieci a sette mostrano un rapporto segnale/rumore del lattato molto piccolo e quindi valori di deviazione standard elevati, indicando che i campioni dovrebbero contenere almeno quel numero di cellule per ottenere dati informativi. La localizzazione spaziale è stata ottenuta con la risonanza magnetica con una buona risoluzione spettrale che consente di acquisire immagini al carbonio 13 per specifiche regioni di frequenza.

La distribuzione spaziale è stata determinata dai dati grezzi. L'immagine del carbonio-13 potrebbe anche essere co-registrata con l'immagine del protone precedentemente acquisita. Una volta padroneggiato ed eseguito correttamente, questo esperimento può essere eseguito in meno di 60 minuti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'iperpolarizzazione di una molecola desiderata utilizzando la tecnica di polarizzazione nucleare dinamica e come eseguire semplici esperimenti di spettroscopia NMR e imaging cellulare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante essere molto veloci. Dopo che il campione iperpolarizzato ha lasciato il polarizzatore, ricorda che perdi tutto il segnale NMR guadagnato in meno di due minuti.

In conclusione, il DNP di dissoluzione può essere utilizzato per una varietà di applicazioni. Ciò include lo studio di malattie come il diabete o l'osservazione dei cambiamenti metabolici di vari tipi di cancro, ma anche la misurazione del pH dei tessuti.