Name: hyperpolarized 13 C metabolica spettroscopia di risonanza magnetica e Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Impara la spettroscopia di risonanza magnetica metabolica con carbonio-13 iperpolarizzato per studiare i processi metabolici in tempo reale nelle cellule tumorali prostatiche. Questo metodo avanzato consente di monitorare l'attività enzimatica della lattato deidrogenasi in vitro con elevata sensibilità.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.K. ringrazia il supporto della Graduate School of Bioengineering (GSB) presso la Technische Universität München. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) nell'ambito del Centro di ricerca collaborativa SFB 824, "Imaging per la selezione, il monitoraggio e l'individualizzazione delle terapie antitumorali".

1. Campione della soluzione Stock Preparazione <ol><li> Aggiungere gadoterate meglumina (GadM, 0,5 mol / L) per concentrato [1- 13 C] acido piruvico per dare una concentrazione finale di 1-mmol / L GadM. Aggiungere tritile tris radicale (8-carbossi-2,2,6,6-tetra (idrossietil) -benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-il) - sale di sodio metil (OX063) a questa miscela per ottenere una concentrazione finale di 15 mmol / L. Vortex fino a completa dissoluzione. NOTA: Questa preparazione magazzino soluzione è stata progettata per l'utilizzo con un 3.35-T preclinica DNP hyperpolarizer. Quando viene utilizzato un hyperpolarizer clinica 7-T, la meglumina gadoterate non è necessario perché, in un campo magnetico maggiore, i suoi vantaggi sono trascurabili. L'aggiunta di un agente di contrasto gadolinio a base aumenta la polarizzazione ottenibile allo stato solido e anche il tasso di polarizzazione. Tuttavia, allo stato liquido, l'agente di contrasto accorcia il tempo di rilassamento T 1. </li></ol> 2. Crescere la coltura cellulare <ol><li crescere le cellule pc3 in un pallone di coltura con zona>2 la crescita. Utilizzare mezzo F-12K contenente 10% di siero fetale bovino (FCS) e mantenere le cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2. Prima della fase di dissoluzione, rimuovere il mezzo dal pallone di coltura. NOTA: Ogni linea cellulare richiede un particolare protocollo di preparazione per la propagazione delle cellule. Consultare i requisiti con il provider di linea cellulare. </li></ol> 3. Preparazione delle Cellule per l'esperimento <ol><li> Rimuovere il medium delle cellule e lavare le cellule con ~ 10 mL di tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Aggiungere 5 ml di tripsina al pallone e restituire i palloni di coltura cellulare per l'incubatore per 3 a 5 minuti. </li><li> Aggiungere ~ 5 ml di mezzo F-12K per disattivare la tripsina. </li><li> Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatica. Mescolare 10 ml della soluzione di cellule con 10 ml di soluzione macchia. Mescolare bene con la pipetta e trasferire 10 ml della miscela in the camera di un "vetro contare". </li><li> Rimuovere e contare le cellule nel pallone (s). Trasferire i volumi appropriati contenenti il numero desiderato di cellule (ad esempio, 5 x 10 6 fino a 10 8) in fiale di plastica. </li><li> Centrifugare le cellule a 1200 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in medium F-12K contenente 10% FCS ad un volume totale di 800 microlitri e trasferirli in una tazza di reazione (2 mL). Posizionare la coppa di reazione in una fiala di plastica riempito con acqua calda. </li></ol> 4. Scioglimento Preparato NOTA: L'agente di dissoluzione è un liquido che viene utilizzato per sciogliere il campione iperpolarizzato. In applicazioni biologiche, dissoluzione viene solitamente eseguita con H 2 O o basato su ossido di deuterio (D 2 O) buffer basati, come PBS o tris (idrossimetil) amminometano (Tris), contenente acido etilendiamminotetraacetico 1 g / L (EDTA). <ol><li> preparazione di 20 mmol tampone / L PBS <ol><li> Per preparare 100 mL di agente di dissoluzione, sciogliere 36 mg di fosfato monosodico (NaH 2 PO 4), 247 mg di disodio fosfato (Na 2 HPO 4), e 10 mg di EDTA in una soluzione di idrossido / L di sodio 20 mmol ( NaOH) in D 2 O. Mix correttamente fino a completa dissoluzione. NOTA: EDTA (1 g / L) viene aggiunto al buffer per eliminare eventuali ioni ferromagnetici, che possono rovinare l'iperpolarizzazione. La NaOH è utilizzato per neutralizzare l'acido piruvico in un rapporto 1: 1 mol per raggiungere un pH di 7,4. </li></ol></li></ol> 5. Temperatura Inserisci variabile (VTI) Cooldown <ol><li> Nella finestra principale del programma polarizzatore DNP-NMR, clicca su "raffreddamento." NOTA: Questo accende la pompa del vuoto e evacua il VTI a circa 5,0 mbar. Successivamente, la valvola a spillo tra il VTI ed il serbatoio elio liquido si apre completamente, permettendo elio liquido di fluire nel VTI. La portata è regulated dalla valvola a spillo per mantenere la quantità ottimale di elio liquido nel VTI fino a raggiungere la temperatura di ebollizione dell'elio. Poi, il VTI viene evacuato quasi completa vuoto e la temperatura raggiunge circa 1,4 K. Il VTI è riempito con elio liquido fino al 65%. A questo punto, lo strumento è pronto per l'inserimento del campione. </li></ol> 6. Preparazione del campione e inserimento <ol><li> Usando una micropipetta, aggiungere ~ 8 ml di 13 C-marcato soluzione di esempio stock in un bicchiere di plastica. </li><li> Fissare il bicchiere di plastica per l'asta di inserimento e avviare il processo di inserimento del campione premendo il tasto "Inserisci campione" nella finestra principale del programma. Selezionare "campione normale" e cliccare su "Continua". NOTA: Durante questo processo, la valvola a spillo chiude prima di interrompere il flusso di elio liquido in VTI, e la pressione nel VTI quindi aumenta. Il titolare del campione all'interno del VTI è sollevata dal elio liquido, la valvola di aspirazionenella parte superiore della VTI apre, e un flusso di elio gassoso viene introdotto dalla valvola di aspirazione per evitare contaminazioni esterne dall'umidità dell'aria. </li><li> Quando richiesto, spingere l'asta di inserimento con il bicchiere di plastica attaccato giù nel VTI. Assicurarsi per raggiungere il supporto esempio nella parte inferiore della VTI. Altrimenti, l'elio gassoso può spingere il campione dalla VTI. </li><li> Staccare e rimuovere l'asta di inserimento. </li><li> Terminare la procedura facendo clic su "Avanti" nella finestra di dialogo. La procedura di inserimento del campione non dovrebbe richiedere più di 10 s. NOTA: la valvola di aspirazione si chiude poi, il flusso di elio gassoso viene interrotta, il titolare del campione con la coppa campione viene immerso in elio liquido, e si apre la valvola a spillo per consentire l'elio liquido di fluire nel VTI. Dopo 5 - 10 min, il VTI viene raffreddato al di sotto 1.4 K, consentendo tutte le elettroni liberi di essere polarizzata. </li><li> Verificare che il bicchiere di plastica con il campione è stato introdotto correttamente nella VTI controllando tcappello non è collegata alla barra inserimento o spinto fuori dal VTI gas elio. Quindi fare clic su "Fine". </li></ol> 7. Forno a microonde Sweep (opzionale) NOTA: Una spazzata microonde permette la determinazione della frequenza delle microonde ottimale per massimizzare il tasso iperpolarizzazione dei 13 C nuclei nel composto di destinazione. <ol><li> Per misurare lo sweep microonde, avviare il programma RINMR, digitare "HYPERSENSENMR," e fare clic su "Seleziona Config" e "Do Microsweep." </li><li> Per avviare il processo, selezionare la scheda "calibrare" sulla finestra principale del programma. </li><li> Istruzioni "Generate" e scegliere l'inizio e la frequenza finale (ad esempio, 94,100 GHz-94,200 GHz), il passo di frequenza (ad esempio, 20 MHz), la potenza (100 mW), e il tempo (60 s). Fai clic su "Continua", "Attiva" e "Start". NOTA: Con queste impostazioni, il hyperpolarizer prima polarizza il campioneper 60 s utilizzando una frequenza di microonde 94.100 GHz e una potenza di 100 mW. Poi, si applica un impulso a 90 ° radiofrequenza (RF) e acquisisce il segnale iperpolarizzato 13 C utilizzando lo spettrometro incorporato. Questi passaggi vengono ripetuti per ogni passo di frequenza specificata. Per la successiva iperpolarizzazione, scegliere la frequenza a microonde con l'ampiezza del segnale massima misurata. </li></ol> 8. Polarizzazione <ol><li> Per misurare la polarizzazione build-up, avviare il programma RINMR, digitare "HYPERSENSENMR," e fare clic su "Seleziona Config" e "Build-up solido." </li><li> Nella finestra principale del programma polarizzatore DNP-NMR, fai clic su "Polarizzazione" per avviare il processo di iperpolarizzazione. </li><li> Scegliere la frequenza ottimale forno a microonde (ottenuto durante lo sweep a microonde) e la potenza (ad esempio, 100 mW) per il campione e fare clic su "Avanti". </li><li> Attiva "Polarizzazione monitoraggio build-up" e fare clic su "Fine". </li><li> Polarizzare il campione&gt; 95% (~ 60 min [1- 13 C] piruvato). NOTA: Durante la polarizzazione, le microonde sono guidati nella VTI e al campione, causando il 13 C gira per allinearsi con gli spin di elettroni spaiati hyperpolarized. Per misurare l'accumulo iperpolarizzazione, impulsi RF con un flip angle (FA) del 5 ° vengono applicate periodicamente (ad esempio ogni 300 s), ed il segnale risultante viene tracciata come una curva accumulo polarizzazione. </li></ol> 9. Scioglimento <ol><li> Quando la polarizzazione raggiunge&gt; 95%, avviare il processo di dissoluzione facendo clic su "Dissolution" nella finestra principale del programma polarizzatore DNP-NMR. </li><li> Scegliere il processo di dissoluzione dal menu a tendina e cliccare su "Avanti". NOTA: Il polarizzatore consente di definire il processo di dissoluzione desiderato scegliendo la temporizzazione del gas caccia. </li><li> Carico ~ 5 mL dell'agente di dissoluzione attraverso la valvola superiore in una pozza riscaldata in tegli lo scioglimento parte del polarizzatore. Calcolare il volume esatto dell'agente di dissoluzione necessario utilizzare seguente equazione: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq1.jpg"> dove V è il volume DA desiderata di agente di dissoluzione, m PA, m OX063, e m Gad sono le masse del piruvato, OX063 e gadoterate meglumina, rispettivamente aggiunti alla soluzione di esempio stock. </li><li> Posizionare il bastone dissoluzione in posizione operativa sopra la valvola di aspirazione. NOTA: Questo consente allo strumento di collegare la sua strumentazione dissoluzione alla coppa campione nel VTI. </li><li> Fai clic su "Fine" per avviare il processo di dissoluzione. NOTA: L'agente di dissoluzione è pressurizzato a 3 bar gas elio e viene successivamente riscaldata fino a 200 ° C, provocando un aumento della pressione. Quando la pressione raggiunge 10 bar, la valvola a spillo chiude di interrompere il flusso di elio liquido nella VTI. Il titolare del campione alza la coppadal elio liquido. Il bastone di dissoluzione è abbassato nel VTI e collegato alla coppa campione. L'agente di dissoluzione condizionata è spinto dalla pressione, che risulta dal recipiente di riscaldamento contenente il tampone di dissoluzione ed elio, attraverso il bastone di dissoluzione alla tazza, provocando una rapida dissoluzione del campione. La soluzione poi esce nel pallone di raccolta tramite tubi di plastica. Il bastone di dissoluzione con la coppa in allegato viene poi portata dal VTI. </li><li> Portare lo stick di dissoluzione con la coppa attaccato alla posizione di "pulizia" e terminare il processo con "Fine". </li></ol> 10. Riconoscimento del 13 C iperpolarizzato segnale <ol><li> 13 C metabolica spettroscopia di risonanza magnetica in vitro <ol><li> Miscelare 200 ml di 20 mmol / L disciolto campione iperpolarizzato dal pallone di raccolta con 800 microlitri della soluzione di cellule. NOTA: La concentrazione finale risultantedi [1- 13 C] piruvato è 4 mmol / L. </li><li> Mescolare bene la sospensione con una micropipetta e trasferimento ~ 600 ml in un tubo NMR di 5 mm. </li><li> Inserire il tubo NMR 5 mm nello spettrometro NMR 1-T. Nella finestra principale del software, fare clic su "Esegui" per avviare la misurazione, l'applicazione di una serie di un centinaio di 10 ° impulsi RF ogni 3 s. NOTA: Misurare il tempo tra la miscelazione iniziale del campione iperpolarizzato con le cellule e l'inizio dell'acquisizione spettroscopica. Assicurarsi che la procedura di miscelazione non supera i 30 s per ridurre al minimo la perdita di polarizzazione. </li></ol></li><li> 13 C metabolica risonanza magnetica <ol><li> Per costruire un contenitore per gli esperimenti in vitro utilizzando lo spettrometro RMN, prendere una siringa da 5 ml e collegarlo a un catetere (d = 1,2 mm) che è abbastanza lungo da raggiungere da iso-centro di spettrometro per l'area accessibile del spettrometro. </li><li> Riempire il contenitore in vitro con °soluzione e cellule della concentrazione desiderata per l'esperimento (ad esempio, 10 8) o con una soluzione enzimatica. </li><li> Collocare un contenitore in vitro all'isocentro del magnete MRI. Posizionare una bobina ricevente radio frequenza 13 C-sintonizzato sul contenitore. Posizionare un concentrato 13 C-marcato corpo di calibrazione (ad esempio, 10-mol / L 13 C-urea) nelle vicinanze. </li><li> Inserire il "contenitore in vitro" nei pressi della iso-centro dello scanner NMR. </li><li> Eseguire 3 serie piano sequenza di localizzazione dello scanner e regolare la posizione del contenitore in vitro al iso-center, in base alle esigenze. </li><li> Eseguire un 1 H T2 ponderata sequenza "anatomica" che copre la vitro localizzazione contenitore. Utilizzare le seguenti impostazioni: spin echo 2D con orientamento assiale, tempo di ripetizione (TR) = 2.000 ms, tempo di eco (TE) = 20 ms, fetta di spessore = 1 mm, campo visivo che copre il contenitore in vitro, e16 echi per l'eccitazione. Assicurarsi che shimming campo viene fatta su protoni durante questa fase. </li><li> Nelle immagini anatomiche, seleziona 5 fette contigue centrate sulla regione di interesse. Prescrivere un 13 C acquisizione calibrazione spettroscopica che copre le fette anatomiche selezionati. Utilizzare le seguenti impostazioni: 2D Block-Siegert sequenza di taratura con orientamento assiale 12 x 12 centric codificato, TR = 1.000 ms, spessore dello strato = 5 mm, campo di vista corrispondenti immagini anatomiche, numero di scansioni (NS) = 64, la larghezza di banda = 5.000 Hz, e FA = 90 °. </li><li> Selezionare la sequenza di taratura spettroscopica 13 C (per ulteriori informazioni, vedere Schulte et al. 2011) 75 dalla libreria sequenza di impulsi. Scarica la sequenza di impulsi per lo scanner dal computer facendo clic su "Download". Clicca su "Spectra Prescan" per eseguire la scansione preliminare spettroscopica. Nella trama spettro grandezza, regolare il picco dal corpo di calibrazione 13 C al Center della frequenza scanner. Impostare i guadagni ricevitore al massimo. Fai clic su "Start" per eseguire la sequenza di calibrazione spettroscopica 13 C. Nota il guadagno di trasmissione e la frequenza riportata centric. </li><li> Impostare una acquisizione 13 C di imaging chemical shift (CSI) che coprono le fette anatomiche selezionati. Utilizzare le seguenti impostazioni: 2D di imaging eco-planare spettroscopica (EPSI) con orientamento assiale 12 x 12 centric codificato, TR = 400 ms, spessore dello strato = 5 mm, campo di vista corrispondenti immagini anatomiche, NS = 300, e la larghezza di banda = 5.000 Hz . NOTA: i campioni EPSI una singola linea in k-spazio più volte dopo che uno di eccitazione RF di acquisire sia informazioni spaziali e spettrali contemporaneamente. Per ulteriori informazioni sulle tecniche di acquisizione, vedere l'articolo di Durst et al. 2015 76. </li><li> Scarica la sequenza C CSI 13 ed eseguire il scansione preliminare spettroscopica. Regolare la frequenza di scansione e trasmettere il guadagno come specificato dalla sequenza di taraturaproduzione. </li><li> Dopo che la soluzione iperpolarizzato viene depositato nel pallone di raccolta, elaborare ~ 3 ml in una siringa e poi iniettare nel catetere collegato al contenitore in vitro. Avviare l'acquisizione. Dopo l'acquisizione è stata completata, salvare il file di dati grezzi per la successiva ricostruzione. </li></ol></li></ol> 11. Dati Ricostruzione <ol><li> Applicare uno dei due modelli cinetici descritti per analizzare i dati acquisiti. <ol><li> Nel primo metodo per descrivere la cinetica LDH, valore cinetica (k), confrontare la somma del segnale di lattato (M LAC) al segnale di tutte le molecole hyperpolarized (M x) 21,77. <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq2.jpg"></li><li> Nella altro metodo, misurare il lattato e piruvato segnali nel tempo e montare questi ad un modello di cinetica 17,25,71. Per risolvere il tasso di cambio metabolico, k PA → LAC, e l'effettivasegnale di velocità di decadimento del lattato, r LAC, utilizzare i seguenti equazioni differenziali lineari che utilizzano il modello di scambio differenziale di due siti, cedendo per lattato: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq3.jpg"></li></ol></li></ol> Nota: L'efficace segnale di lattato tasso di decadimento r LAC dipende dal tempo di rilassamento longitudinale lattato (T 1, LAC), il tasso di cambio metabolico opposta dal lattato a piruvato k LAC → PA, il applicata FA e TR, e l'intensità del segnale di piruvato (M PA) e lattato (M LAC), tenendo conto della riduzione del segnale irreversibile dopo ogni eccitazione successive: <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq4.jpg"> Pertanto, R LAC si traduce in un unico, inscindibile termine di decadimento del segnale. Poiché è possibile correggere per donnaha capovolgere angolazione e il tempo di ripetizione, e anche se vi è un flusso LAC → PA, si assume che il tasso di cambio da lattato a piruvato (k LAC → PA) non deve essere inclusa nel calcolo, in base ai risultati di Harrison et al. 2012 78. I loro risultati mostrano che la k LAC → PA non gioca un cruciale ruolo si potrebbe supporre. Questa modalità permette al T 1 tempo di rilassamento di lattato da quantificare. Questo modello è indipendente dell'amministrazione piruvato alla misura, che, nel caso di esperimenti in vitro, non è cruciale e può essere trascurato. Essa, tuttavia, svolgono un ruolo importante per le misurazioni in vivo in 79.

Rolf F. Schulte e Marion I. Menzel lavorano presso GE Global Research.

13 CMRSI con sonde hyperpolarized è un metodo promettente per monitorare in tempo reale il metabolismo in vitro e in vivo. Un aspetto molto importante quando si impiega questo processo sperimentale è la corretta normalizzazione, soprattutto per quanto riguarda gli esperimenti in vitro. Innanzitutto, la preparazione del campione deve essere fatto correttamente e costantemente per ottenere la stessa concentrazione di materiale iperpolarizzato in ogni esperimento. Ciò richiede...

Attualmente, il metodo clinico più utilizzato per la stadiazione del tumore, ristadiazione, monitoraggio risposta al trattamento, e la rilevazione ricorrenza di una vasta gamma di tumori è [18 F] -FDG PET. 1 Tuttavia, recentemente, diversi approcci nuovi e alternativi sono emersi. Uno di questi metodi è 13 CMRSI. Questa tecnica prevede l'introduzione del 13 C-molecola in un campione biologico, seguita da MRI minimamente invasiva per valutare il metabolismo in vitro o in vivo in tempo reale. Tuttavia, la sfida del 13 CMRSI, rispetto agli altri metodi come [18 F] -FDG PET o tomografia computerizzata, è il basso rapporto segnale-rumore. Il segnale NMR è direttamente proporzionale al livello di polarizzazione, un rapporto tra la differenza di popolazione di spin ½ nuclei in due stati di energia alla popolazione totale (Figura 1A). La polarizzazione è un prodotto di the rapporto giromagnetico (γ) dei nuclei e l'intensità del campo magnetico applicato sopra la temperatura. Una polarizzazione tipica di 1 H nuclei è dell'ordine di 0,001% a 0,005% a 3 T, che dà una relativamente scarsa rapporto segnale-rumore. Odierna state-of-the-art MRI è stato un metodo di imaging successo solo a causa della grande abbondanza di 1 H in campioni biologici e l'elevato rapporto giromagnetico di 1 H (γ 1H = 42,576 MHz / T). Tuttavia, osservando altri nuclei, come carbonio, è più esigente. L'unica stabile, isotopo di carbonio magneticamente attivi, 13 C, costituisce solo l'1,1% di tutti gli atomi di carbonio. Inoltre, il rapporto giromagnetico di 13 C (γ 13C = 10.705 MHz / T) è quattro volte inferiore a quella del 1 H, portando ad una efficienza di rivelazione inferiore. In sintesi, la scarsa abbondanza 13 C e bassa 13C γ causano misurazioni 13 C termici per raggiungere 0,0176% della sensibilità di un 1Misurazione H-NMR in vivo. Polarizzazione nucleare dinamica Un metodo per superare la relativamente scarsa sensibilità di 13 misurazioni C è DNP. E 'stato originariamente descritto per i metalli nel 1953 da Albert W. Overhauser. Nel suo articolo, afferma: "Si dimostra che se la risonanza di spin elettronico degli elettroni di conduzione è saturo, i nuclei vengono polarizzati nella stessa misura sarebbero se il loro rapporto giromagnetico fosse quello dello spin dell'elettrone." 2 tardi quell'anno, Carver e Slichter sperimentalmente confermato l'ipotesi di Overhauser 3. Nel 1958, Abragam e Proctor descritti questo effetto per gli elettroni nei liquidi e chiamarono "l'effetto solido." A temperature inferiori a 4 K, electron spin polarizzazione raggiunge quasi il 100% ed è più di tre ordini di grandezza superiore al nucleare polarizzazione di spin (Figura 1B) 4. Tla verifica perché il rapporto giromagnetico dell'elettrone (γ e = 28024,944 MHz / T) è di tre ordini di grandezza superiore al rapporto giromagnetico nucleari. Le interazioni deboli tra elettroni e nuclei, come l'effetto Overhauser, l'effetto solido, l'effetto trasversale, e l'effetto di miscelazione termica, consentono il trasferimento di polarizzazione da electron spin a spin nucleari mediante irradiazione a microonde con una frequenza prossima al corrispondente elettroni risonanza paramagnetica (EPR) 5,6 frequenza. teoria DNP è stato ulteriormente sviluppato per coinvolgere più elettroni e miscelazione termica. Tuttavia, ad oggi, non unificato descrizione quantitativa teorica di DNP è stato pubblicato 7,8. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg"> Figura 1: comprensione dinamica di polarizzazione nucleare e Iperpolarizzazione. A) Un confronto schematica della popolazione di spinnello stato di equilibrio di polarizzazione termico e lo stato iperpolarizzato. B) La polarizzazione dipende dalla temperatura. La polarizzazione di un elettrone (e -) raggiunge il 100% inferiore a 1,4 K. Il DNP permette il trasferimento della polarizzazione dalla e- ai 13 C nuclei, che aumenta la polarizzazione fino a 10 5 fold. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per introdurre DNP negli studi di sistemi biologici utilizzando 13 C NMR, successivo scioglimento rapido del campione doveva essere sviluppato. 50 anni dopo l'ipotesi di Overhauser, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. risolto il problema tecnicamente impegnativo di portare il campione congelato iperpolarizzato allo stato liquido con una perdita minima iperpolarizzazione 6. Scioglimento DNP ha aperto un nuovo campo di ricerca chiamato 13 CMRSIo, che fornisce un nuovo metodo per studiare e caratterizzare i vari stati di malattia 9,10. Come vettori stabili di un elettrone spaiato, un tritile tris radicale (8-carbossi-2,2,6,6-tetra (idrossietil) -benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-il) -metil sale di sodio (OX063) o oxyl (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il) (TEMPO) è di solito utilizzato. Questi sono mescolati con 13 molecola di C-marcato desiderata e esposti a irradiazione a microonde con una frequenza vicina alla frequenza corrispondente EPR. Usando questa tecnica, la polarizzazione di 13 C nuclei può essere aumentata fino al 37% 11. Ciò si traduce in un 10 5 fold miglioramento polarizzazione rispetto all'equilibrio termico di polarizzazione 11,12. Tuttavia, non appena l'irraggiamento a microonde è fermo e / o 13 C-molecola viene trasferito allo stato liquido, la polarizzazione decade con il tempo di rilassamento longitudinale (T 1) del nucleo 13 C che è stato polarizzato. Così, lainvenzione di tecniche di dissoluzione veloce o qualsiasi successiva tecnica accorciando il tempo prima misura sperimentale (ad esempio, l'iniezione) è di fondamentale importanza per le applicazioni biologiche 13. Ci sono tre requisiti principali che la molecola candidato deve soddisfare per successo 13 studi CMRSI. Innanzitutto, il nucleo 13 C di interesse deve avere un tempo sufficientemente lungo T 1 (&gt; 10 s). La scelta del 13 C-label è cruciale. Le migliori nuclei candidati sono atomi di carbonio con alcun contatto diretto con 1 H-nuclei tramite un legame. Inoltre deve essere rapidamente metabolizzato entro 2 - 3 T 1 volte, risultando in un prodotto metabolico a valle con una significativamente diverso chemical shift dalla sostanza originale. La miscela campione deve inoltre formare un vetro amorfo allo stato solido in modo che la distribuzione spaziale diminuisce la distanza tra l'elettrone e 13 C, permettendo transFer di polarizzazione. Se la molecola candidata non forma vetrosa amorfa naturalmente, deve essere altamente solubile in un agente glassing, come il glicerolo o dimetilsolfossido 14. Questi requisiti comportano un numero relativamente piccolo di molecole candidate. Tuttavia, anche dopo la scoperta di successo di una molecola adatta, sviluppando un protocollo di lavoro per iperpolarizzazione può essere tecnicamente impegnativo 9,14,15. Negli ultimi anni, diversi substrati sono stati correttamente polarizzata, ad esempio [1- 13 C] piruvato 12,16 - 36, [2- 13 C] piruvato 37, [1- 13 C] etil piruvato 38, [1- 13 C ] lattato 39, [1- 13 C] fumarato 40-43, 13 C-bicarbonato 36,44,45, [1- 13 C] acetato di sodio 43,46 - 49, 13 C-urea 6,36,50,51 , [5- 13 C] glutamine 15,52,53, [1- 13 C] glutammato 53,54, [1- 13 C] 2-oxoglutarato 55, [1- 13 C] alanina, e altri 14,56. Un substrato particolarmente interessante e comunemente usato per iperpolarizzazione è [1- 13 C] piruvato. E 'ampiamente utilizzato negli studi preclinici per indagare il cellulare energetico del metabolismo in varie malattie 14,17,22. [1- 13 C] piruvato soddisfa tutti i requisiti per iperpolarizzazione successo, compreso un relativamente lungo T 1 e rapido trasporto attraverso la membrana cellulare prima successivamente essere metabolizzata. Gli studi preclinici con [1- 13 C] piruvato vengono attualmente tradotte in clinica 57. Il metabolismo del piruvato E 'ben noto che vi è un legame diretto tra le mutazioni nel DNA e cambiamenti nelle loro vie metaboliche un cancro cellule. Già nel 1920, Otto Warburg scoEred che vi è un aumento del metabolismo del glucosio e la produzione di lattato in tumori rispetto al tessuto sano 58 - 60. Successivamente, varie alternanze di altre vie metaboliche, come la via dei pentoso-fosfati, il ciclo degli acidi tricarbossilici, fosforilazione ossidativa e la sintesi dei nucleotidi e lipidi, sono stati descritti. Il piruvato è il prodotto finale della glicolisi. Nel tumore, subisce glicolisi anaerobica catalizzata dalla LDH 61 e reagisce con la forma ridotta del coenzima nicotinamide adenina dinucleotide (NADH), con conseguente lattato e la forma ossidata del coenzima (NAD +). In alternativa, piruvato subisce una reazione di transaminazione con glutammato per formare alanina, catalizzata da alanina transaminasi (ALT). Entrambe le reazioni sono facilmente reversibili. Piruvato subisce decarbossilazione catalizzata dalla piruvato deidrogenasi (PDH) in anidride carbonica e acetil-CoA, representing una reazione irreversibile, in questa fase. Alternanze di queste velocità di reazione possono essere collegati al metabolismo tumorale 17,21,22,25,62. Le vie metaboliche sono riassunti nella figura 2. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg"> Figura 2: Schema del forte reazione metabolica del piruvato. Piruvato / conversione del lattato è catalizzata dalla LDH, e la conversione piruvato / alanina è catalizzata da ALT. Il piruvato è irreversibilmente convertito in acetil-CoA e CO 2 di PDH, e CO 2 è in un equilibrio pH-dipendente con bicarbonato 80. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Il rilevamento di iperpolarizzato [1- 13 C] piruvato e dei suoi metaboliti è stata precedentemente dimostrata nel ratto haArte 37,63 - 65, del fegato 66, muscoli, reni e 62,67. Uno studio ha dimostrato differenze significative nel rapporto lattato-to-alanina tra il normale e digiuno fegato di ratto 66 e dimostrato un [1- 13 C] livello lattato altamente elevato e iperpolarizzato nel cancro del fegato 68,69. Ci sono prove che il grado del tumore può essere identificato in un adenocarcinoma prostatico transgenico di mouse (TRAMP) utilizzando hyperpolarized [1- 13 C] piruvato 22, con i livelli di lattato hyperpolarized che mostrano una forte correlazione con il grado istologico dei tumori asportati. L'alanina catalizzata dalla piruvato dal ALT stato anche suggerito come marker utile nel ratto carcinoma epatocellulare 23. La misurazione del flusso metabolico piruvato-lattato è stato utilizzato per il monitoraggio di ischemia 63,65,70 e come risposta al trattamento con farmaci chemioterapia citotossica 17,40, mirati &lt;sup&gt; 24,25,41, 26 o radioterapia in modelli animali. E 'stato utilizzato anche per il rilevamento della fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) inibitore della risposta LY294002 nel glioblastoma e il cancro al seno modelli murini 25. I cambiamenti nel metabolismo del piruvato in tumori cerebrali 26 e il cancro alla prostata 24,71 sono stati osservati anche dopo il trattamento. Carcinoma della prostata Il carcinoma della prostata è il cancro predominante negli uomini anziani e il secondo tumore che porta legate alla morte negli uomini in tutto il mondo 72. Ad oggi, esistono metodi affidabili, non invasivi sono disponibili per una diagnosi precoce e caratterizzazione di cancro alla prostata 73,74, sottolineando la necessità urgente di nuove tecniche di imaging metabolico per consentire la rilevazione rigorosa e la stadiazione dei pazienti. Carcinoma della prostata è stato usato come modello per dimostrare le possibilità di dissoluzione DNP combinati con 13 CMRSI nel pazienteS 57. Questo lavoro è stato continuato in un primo studio clinico che impiegano [1- 13 C] piruvato e 13 CMRSI per l'imaging del cancro alla prostata, ed è proprio di recente è stato completato (NCT01229618). La motivazione di questo lavoro era di illustrare più in dettaglio e per un pubblico più vasto l'applicazione del metodo CMRSI 13 in un ambiente preclinico con le cellule. Misurare il metabolismo LDH-catalizzata di [1- 13 C] piruvato di [1- 13 C] lattato in vitro nella linea di cellule di carcinoma della prostata PC3, dimostriamo l'eventuale applicazione di scioglimento DNP negli studi in vitro e affrontare i punti cruciali e sfide durante gli esperimenti.

<table><tbody><tr><td>Polarizzatore HyperSense DNP</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>3.35 T iperpolarizzatore DNP preclinico</td></tr><tr><td>GE/Agilent MR901</td><td>GE Healthcare/Agilent Technologies</td><td></td><td>Scanner MRI preclinico 7 T, con foro piccolo progettato per esperimenti su roditore</td></tr><tr><td>Spinsolve Carbon</td><td>Magritek</td><td></td><td>1 T spettrometro NMR a magneti permanenti</td></tr><tr><td>Ossido di deuterio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monbasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Disodio edetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Acido piruvico - 13C1</td><td>Cambridge Isotopes Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Dotarem (0,5 mmol/L)</td><td>Guerbet</td><td></td><td>gadoterato meglumina&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>tris (8-carbossi-2,2,6,6-tetra-(idrossietil)-benzo-[1,2&ndash; Sale sodico di 4,5]-bis-(1,3)-ditiolo-4-il)-metile (OX063)</td><td>GE Healthcare</td><td></td> utilizzato <td>come fonte di elettroni liberi</td></tr><tr><td>Linea cellulare PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL1435</td><td></td></tr><tr><td>terreno F-12K</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-EDTA, 1x</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere di plastica per campioni</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013-MSDS</td><td></td></tr></tbody></table>

hyperpolarized 13 c metabolica spettroscopia di risonanza magnetica e imaging

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Negli ultimi decenni, nuovi metodi per la stadiazione del tumore, ristadiazione, monitoraggio risposta al trattamento, e la rilevazione ricorrenza di una varietà di tumori sono emersi in concomitanza con la tomografia state-of-the-art emissione di positroni con 18 F-fluorodeossiglucosio ([18 F ] -FDG PET). 13 C spettroscopia imaging a risonanza magnetica (13 CMRSI) è un metodo di imaging minimamente invasivo che permette il controllo del metabolismo in vivo ed in tempo reale. Come con qualsiasi altro metodo basato su 13 C risonanza magnetica nucleare (NMR), affronta la sfida di bassa polarizzazione termica e una successiva basso rapporto segnale-rumore dovuto alla relativamente basso rapporto giromagnetico di 13 C e la sua bassa abbondanza naturale in campioni biologici. Superando questi limiti, la polarizzazione nucleare dinamica (DNP), con conseguente scioglimento del campione ha recentemente permesso comunemente utilizzati sistemi di imaging a risonanza magnetica (MRI) NMR e misurare, Lo studio, e di immagine principali vie metaboliche nei vari sistemi biologici. Una molecola particolarmente interessante e promettente utilizzato in 13 CMRSI è [1- 13 C] piruvato, che, negli ultimi dieci anni, è stato ampiamente utilizzato in vitro, preclinici, e, più recentemente, studi clinici per indagare il metabolismo energetico cellulare nel cancro e altre malattie. In questo articolo, descriviamo la tecnica di scioglimento DNP utilizzando un 3.35 T preclinico hyperpolarizer DNP e dimostrare il suo utilizzo in studi in vitro. Un protocollo simile per iperpolarizzazione può essere applicato per la maggior parte in studi in vivo pure. Per farlo, abbiamo utilizzato lattato deidrogenasi (LDH) e catalizzato la reazione metabolica di [1- 13 C] piruvato in [1- 13 C] lattato in una linea di cellule di carcinoma della prostata, PC3, in vitro utilizzando 13 CMRSI.

I risultati del "microonde sweep" sono illustrati in Figura 3. Essa mostra che la frequenza delle microonde ottimale per [1- 13 C] campione piruvato è a 94,156 GHz per l'hyperpolarizer 3,35-T locale. Tutti seguente esperimento iperpolarizzazione (n = 14) sono state eseguite utilizzando questa frequenza a microonde con una potenza di 100 mW. L'irradiazione a microonde è stata applicata per 60 a 80 minuti, portando ad una iperpolarizzazione stato solido superiore al 90%. I risultati sono presen...

La polarizzazione nucleare dinamica con successiva dissoluzione del campione ha permesso studi in tempo reale del metabolismo nei sistemi biologici. Il [1-13C]piruvato iperpolarizzato è stato utilizzato per studiare l'attività della lattato deidrogenasi in una linea cellulare di carcinoma prostatico in vitro.

hyperpolarized 13 C metabolica spettroscopia di risonanza magnetica e Imaging

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di iperpolarizzare le molecole marcate con carbonio 13 utilizzando la polarizzazione nucleare dinamica e di misurare la loro conversione enizmatica utilizzando la risonanza magnetica al carbonio 13, imaging retroscopico, in vitro. Questo metodo aumenta il segnale di risonanza del carbonio da 10.000 a 100.000 volte, consentendo ai composti stratificati di essere distinti dai loro prodotti metabolici e di essere localizzati nel corpo mediante imaging. Il vantaggio principale di questo metodo, rispetto, ad esempio, alle tecniche VR, è che fornisce una visione del metabolismo delle sostanze presenti naturalmente negli organismi viventi in tempo reale.Anche questo metodo può fornire informazioni sul metabolismo del cancro e su come è in vitro. Può essere applicato anche a modelli animali e pazienti umani. L'applicazione di questa tecnica supera la localizzazione del tumore.Può essere utilizzato per trovare e distinguere i sottotipi di tumore metabolici e per monitorare il trattamento insieme a tecniche all'avanguardia. Per iniziare la procedura, preparare prima una soluzione millimolare di gadoterato meglumina e un concentrato di 13 piruvato a un carbonio. Aggiungere il radicale tritile OX063 alla miscela per ottenere una concentrazione finale di 15 millimolari e scioglierla completamente.Nel software DNP Polarizer, fare clic su Raffredda per diminuire la temperatura dell'inserto a temperatura variabile, o VTI, al di sotto di 1.4 kelvin. Una volta che il VTI si è raffreddato, mettere circa otto microlitri della soluzione campione marcata con carbonio 13 in un bicchiere di plastica. Fissare la tazza all'asta di inserimento del campione.Nel software, fare clic su Inserisci campione'Seleziona campione normale'e quindi su Avanti'Questo solleva il supporto del campione e apre le valvole di ingresso al VTI, consentendo l'inserimento del campione. Al prompt, utilizzare l'asta di inserimento per spingere la coppa del campione nel VTI. Staccare la coppa del campione ed estrarre con cautela l'asta di inserimento.Verificare che il campione sia stato staccato dall'asta e non sia stato spinto fuori dal VTI durante la procedura di chiusura. Fare clic su Avanti'per chiudere le valvole e abbassare la tazza del campione nell'elio liquido, quindi fare clic su Fine'Per trovare una frequenza di polarizzazione ottimale, avviare prima il software RIMR. Nella schermata di configurazione, fare clic su Seleziona campione' e Esegui micro spazzata'Crea il file in cui verranno archiviati i dati.Torna al software DNP Polarizer. Selezionare la scheda Calibra, impostare i parametri di scansione a microonde, quindi avviare il processo di scansione a microonde. Una volta terminato lo sweep a microonde, annotare la frequenza con un'ampiezza massima del segnale misurata.Torna al software RINMR e seleziona Accumulo solido'Quindi, nel software DNP Polarizer, fai clic su Polarizzazione'Immettere la frequenza e la potenza ottimali delle microonde. Fare clic su Avanti'Abilita monitoraggio dell'accumulo di polarizzazione'e fare clic su Fine'Polarizzare il campione per un periodo di tempo sufficiente per ottenere una polarizzazione superiore al 95%. Durante la polarizzazione, collegare un pallone di raccolta al tubo di scarico del campione iperpolarizzatore e posizionarlo vicino allo spettrometro.Configura uno spettrometro NMR di Tesla con la serie di 13 scansioni al carbonio di impulsi RF a 110 gradi a intervalli di tre secondi. Durante la polarizzazione del piruvato, iniziare la preparazione della coltura cellulare. Rimuovere il terreno cellulare dai matracci per colture cellulari.Lavare le cellule con circa 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Aggiungere cinque millilitri di tripsina al pallone di coltura. Incubare la coltura per tre-cinque minuti a 37 gradi Celsius, quindi disattivare la tripsina con circa cinque millilitri di terreno F12K contenente il 10% di siero fetale di vitello in volume.Quindi, trasferire il volume della sospensione cellulare contenente il numero desiderato di cellule in una provetta da centrifuga di plastica. Centrifugare il campione di cellule a 1200 G per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pallet in una quantità sufficiente di terreno F12K con il 10% di FCS per ottenere un volume finale di 800 microlitri.Trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e posizionare la provetta in un contenitore di plastica riempito con acqua tiepida. Per iniziare la raccolta dei dati tramite spettroscopia di risonanza magnetica al carbonio 13, una volta preparato il campione di cellule e la polarizzazione del piruvato è superiore al 95%, fare clic su Esegui dissoluzione' nel software DNP Polarizer. Caricare il volume dosato dell'agente di dissoluzione attraverso la valvola superiore della camera di dissoluzione.Spostare lo stick di dissoluzione in posizione attiva. Confermare facendo clic su Avanti'Una volta che il campione di cellula è pronto per l'esperimento, fare clic su Fine'nel software DNP Polarizer per inizializzare il processo di dissoluzione. Attendi fino al termine del processo di dissoluzione.Aggiungere 200 microlitri della soluzione di piruvato iperpolarizzato a 800 microlitri del campione cellulare. Mescolare bene con una pipetta, quindi mettere circa 600 microlitri di miscela in una provetta NMR da cinque millimetri. Caricare il tubo NMR nello spettrometro e fare clic su Esegui' per avviare la misurazione.Quindi, spostare lo stick di dissoluzione con la tazza del campione attaccata nella posizione di pulizia e fare clic su Fine'nel software DNP Polarizer. Per iniziare la risonanza magnetica al carbonio 13, dopo aver iniziato il processo di iperpolarizzazione, trasferire 800 microlitri di campione di cellule ri-sospeso con un numero di cellule di almeno 10 all'ottava in una siringa da tre millilitri. Collegare la siringa a un catetere lungo e posizionare la siringa su un lettino per la risonanza magnetica.Assicurarsi che il catetere sia sufficientemente lungo da raggiungere l'esterno dello scanner MRI. Posizionare un fantoccio di calibrazione, contenente dieci molari di carbonio 13 urea con il 10% di gadoterato meglumina accanto alla siringa. Posizionare una bobina del ricevitore RF in carbonio 13-tuned sulla siringa.Inserire il piano di scansione nello scanner in modo che l'oggetto di interesse si trovi nell'isocentro dello scanner MRI. Collegare il pallone di connessione al tubo di scarico del campione iperpolarizzatore e posizionarlo vicino all'estremità del catetere. Eseguire una sequenza di localizzazione standard su tre piani e, se necessario, regolare la posizione della siringa.Quindi, impostare ed eseguire una sequenza anatomica pesata in T2 di protoni che copre la localizzazione della siringa. Dalle immagini anatomiche risultanti, selezionare cinque fette continue della regione di interesse, incluso il fantoccio di carbonio-13. Impostare un'acquisizione di calibrazione spettroscopica al carbonio 13 e selezionare la sequenza di calibrazione di siegert a blocchi 2D dalla libreria di sequenze di impulsi.Scaricare la sequenza di impulsi sullo scanner ed eseguire una pre-scansione spettroscopica. Nel grafico della magnitudine dello spettro, impostare il picco fantasma di calibrazione del carbonio 13 al centro della frequenza dello scanner. Impostare i guadagni del ricevitore al massimo e fare clic su Scansione' per eseguire la sequenza di calibrazione.Registra il guadagno di trasmissione riportato e la frequenza centrica. Quindi, impostare un'acquisizione di imaging a spostamento chimico al carbonio 13 per le fette anatomiche scelte. Scegli la sequenza di imaging spettroscopico ecoplanare 2D e scarica la sequenza di impulsi sullo scanner.Eseguire la pre-scansione spettroscopica e regolare la frequenza centrica e il guadagno di trasmissione in base ai valori di calibrazione per completare l'impostazione dello spettrometro MRI. Una volta che il piruvato raggiunge il 95% di polarizzazione, fare clic su Esegui dissoluzione'nel software DNP Polarizer e caricare l'agente di dissoluzione. Spostare lo stick di dissoluzione in posizione attiva.Fare clic su Avanti'e poi su Fine'Quando il campione iperpolarizzato disciolto raggiunge il pallone di raccolta, aspirare circa 1 millilitro della soluzione iperpolarizzata in una siringa e iniettarla nel catetere in modo che 200 microlitri raggiungano il campione di cellule. Fare clic su Scansione' per avviare l'acquisizione dei dati sperimentali. Una volta terminata la raccolta dei dati, spostare lo stick di dissoluzione con la tazza del campione attaccata nella posizione di pulizia e fare clic su Fine'nel software DNP NMR.Il tasso di scambio metabolico del piruvato in lattato è stato studiato nelle cellule PC3 del carcinoma prostatico monitorando l'intensità del segnale della spettroscopia NMR al carbonio 13 del lattato iperpolarizzato e del piruvato rispetto alla frequenza e al tempo. I valori cinetici del lattato sono stati valutati mediante un modello a rapporto semplice e un modello differenziale di scambio a due siti, e normalizzati al numero di cellule. In entrambi i modelli, è stata osservata una tendenza alla diminuzione della produzione di lattato con un numero crescente di cellule.Ciò è attribuito a concentrazioni cellulari più elevate e a una maggiore viscosità del campione. I campioni con una conta cellulare inferiore a due volte dieci a sette mostrano un rapporto segnale/rumore del lattato molto piccolo e quindi valori di deviazione standard elevati, indicando che i campioni dovrebbero contenere almeno quel numero di cellule per ottenere dati informativi. La localizzazione spaziale è stata ottenuta con la risonanza magnetica con una buona risoluzione spettrale che consente di acquisire immagini al carbonio 13 per specifiche regioni di frequenza.La distribuzione spaziale è stata determinata dai dati grezzi. L'immagine del carbonio-13 potrebbe anche essere co-registrata con l'immagine del protone precedentemente acquisita. Una volta padroneggiato ed eseguito correttamente, questo esperimento può essere eseguito in meno di 60 minuti.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'iperpolarizzazione di una molecola desiderata utilizzando la tecnica di polarizzazione nucleare dinamica e come eseguire semplici esperimenti di spettroscopia NMR e imaging cellulare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante essere molto veloci. Dopo che il campione iperpolarizzato ha lasciato il polarizzatore, ricorda che perdi tutto il segnale NMR guadagnato in meno di due minuti.In conclusione, il DNP di dissoluzione può essere utilizzato per una varietà di applicazioni. Ciò include lo studio di malattie come il diabete o l'osservazione dei cambiamenti metabolici di vari tipi di cancro, ma anche la misurazione del pH dei tessuti.

hyperpolarized-13c-metabolic-magnetic-resonance-spectroscopy

Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

La produzione di xeno iperpolarizzato mediante scambio di spin ottica di pompaggio (SEOP) è descritto. Questo metodo produce un 10000-volte valorizzazione ~ della polarizzazione di spin nucleare di Xe-129 e ha applicazioni in spettroscopia di risonanza magnetica nucleare e di imaging. Esempi di fase gas ed esperimenti stato di soluzione sono dati.

Xenon iperpolarizzato per NMR e applicazioni MRI

Questo articolo mira a descrivere un protocollo di base per combinare la stimolazione transcranica a corrente continua (tDCS) con le misurazioni della spettroscopia di risonanza magnetica protonica (1H-MRS) per studiare gli effetti della stimolazione bilaterale sul metabolismo della corteccia motoria primaria.

L&#39;uso di Spettroscopia di Risonanza Magnetica come uno strumento per la misura della Bi-emisferici transcraniali elettrici effetti di stimolazione sul motore principale Cortex Metabolismo

Le malattie neuromuscolari spesso mostrano una temporalmente variabile, patologia spazialmente eterogeneo e multiforme. L'obiettivo di questo protocollo è quello di caratterizzare questa patologia utilizzando magnetici metodi di imaging di risonanza non invasive.

Quantitative Magnetic Resonance Imaging di malattia muscolare scheletrico

Il miglioramento della sensibilità fornito dalla polarizzazione nucleare dinamica di dissoluzione (DNP) consente di seguire i processi metabolici in tempo reale tramite NMR e MRI. Vengono discusse le caratteristiche e le prestazioni di una configurazione DNP a dissoluzione dedicata, progettata per lo studio delle reazioni enzimatiche.

Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare

Un fantoccio dinamico multi-compartimento viene utilizzato per simulare alcune biologie di interesse per studi metabolici utilizzando agenti di risonanza magnetica iperpolarizzata.

L&#39;uso di un multi-comparto dinamico singolo enzima Phantom per gli Studi di hyperpolarized Risonanza Magnetica Agents

Un metodo rapido di scansione EPR (RS-EPR) nuovo paramagnetica elettronica di risonanza (EPR), è dimostrata per l'imaging 2D spaziale spettrale che è superiore alla tecnica tradizionale onda continua (CW) e apre nuove sedi per l'imaging in vivo. I risultati sono dimostrati a 250 MHz, ma la tecnica è applicabile a qualsiasi frequenza.

Rapid Scan paramagnetica elettronica Risonanza apre nuove strade per l&#39;imaging Fisiologicamente parametri importanti<em&gt; In Vivo</em

Vi presentiamo un protocollo per misurare la dipendenza del campo magnetico del tempo di rilassamento spin-reticolo di 13composti arricchiti con C, iperpolarizzati per mezzo di polarizzazione nucleare dinamica, utilizzando una rilassantesi veloce ciclabile. In particolare, lo abbiamo dimostrato con [1-13C]pyruvate, ma il protocollo potrebbe essere esteso ad altri substrati iperpolarizzati.

Misurazione della dipendenza da campo magnetico di rilassamento Spin-Lattice di iperpolarizzato [1-13C]pyruvate

Descriviamo una configurazione sperimentale per la somministrazione di metaboliti iperpolarizzati marcati con 13C in modalità di perfusione continua a un cuore di topo perfuso isolato. Un approccio di acquisizione dedicato a 13C-NMR ha permesso la quantificazione dell'attività enzimatica metabolica in tempo reale e un'analisi multiparametrica 31P-NMR ha permesso la determinazione del contenuto di ATP tissutale e del pH.

Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 C] e spettroscopia NMR 13C / 31P

Il manoscritto presenta un protocollo dettagliato per l'utilizzo del recupero della saturazione dello spostamento chimico iperpolarizzato dello xenon-129 (CSSR) per tracciare lo scambio gassoso polmonare, valutare lo spessore apparente della parete del setto alveolare e misurare il rapporto superficie-volume. Il metodo ha il potenziale per diagnosticare e monitorare le malattie polmonari.

Misura quantitativa della struttura e della funzione polmonare ottenuta dalla spettroscopia allo xeno iperpolarizzata

Questo protocollo integra un sistema di bioreattore personalizzato con spettroscopia NMR iperpolarizzata ¹³C per misurare il metabolismo del piruvato in tempo reale nelle cellule vive, migliorando la riproducibilità e l'accuratezza cinetica per studi metabolici e applicazioni di screening farmacologico.

Rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante NMR iperpolarizzata a 13C

Impara la spettroscopia di risonanza magnetica metabolica con carbonio-13 iperpolarizzato per studiare i processi metabolici in tempo reale nelle cellule tumorali prostatiche. Questo metodo avanzato consente di monitorare l'attività enzimatica della lattato deidrogenasi in vitro con elevata sensibilità.

hyperpolarized¹³ C metabolica spettroscopia di risonanza magnetica e Imaging

Esplora altri video