Hybrid-Cut: Un metodo sezionamento migliorato per Recalcitrante tessuti vegetali Campioni

L'obiettivo generale del metodo di sezionamento dei tessuti a taglio ibrido è quello di migliorare l'integrità dei tessuti vegetali recalcitranti sezionati, quelli con fibre dure e cristalli di silice, per creare campioni di tessuto adatti per studi anatomici e biologici. Le piante che contengono un alto livello di cristalli e silice possono soffrire di gravi lacerazioni da paraffina e problemi durante il sezionamento. Questo metodo migliora significativamente l'integrità dei tessuti.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che il sezionamento a bassissima temperatura nel criostato indurisce il blocco di paraffina, riducendo significativamente il problema del taglio dei cristalli. L'applicazione di questa tecnica può estendersi, tra le altre, all'ibridazione in situ, alla FISH e alla valutazione interna. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi per garantire che il blocco di paraffina aderisca saldamente a una fase possono rivelarsi impegnativi.

Per iniziare, seleziona piante mature di orchidea phalaenopsis allo stadio di cinque foglie. Eliminate con cura le foglie strappandole lungo la nervatura centrale. Usando un bisturi affilato, rimuovere con cura le gemme ascellari dalla base della terza o quarta foglia del sistema monopodiale.

Posizionare immediatamente i campioni in una fiala di vetro a scintillazione contenente 15 millilitri di fissativo PFA ghiacciato. Applicare un vuoto ai campioni nel fissativo a quattro gradi Celsius per 15-20 minuti. Piccole bolle verranno rilasciate dai campioni.

Ripetere questo passaggio fino a quando la maggior parte dei campioni non affonda dopo il rilascio del vuoto. Infine, trattieni l'aspirapolvere per una notte e rilascialo lentamente il giorno successivo. Successivamente, immergere i campioni fissati in 15 millilitri di PBS e metterli in ghiaccio per 15 minuti.

Disidratare i campioni in 15 millilitri di etanolo in una serie di concentrazioni crescenti. 30%50%70%85%95%e infine 100%Infiltrate i campioni con 15 millilitri di una miscela di etanolo e sostituto dello xilene da volume a volume due a uno a temperatura ambiente. Continuare l'infiltrazione posizionando in sequenza i campioni in 15 millilitri di ciascuno dei seguenti.

Una miscela da volume a volume di etanolo e sostituto dello xilene da volume a volume uno-due, una miscela da volume a volume di etanolo e sostituto dello xilene e, infine, un sostituto dello xilene puro. Quindi incubare i tessuti in un forno a 60 gradi Celsius. Filtrare i campioni con 15 millilitri di sostituto dello xilene e miscela di paraffina a 60 gradi Celsius.

Infine, infiltrare la paraffina in 15 millimetri di paraffina pura due volte per 12 ore ciascuna a 60 gradi Celsius. Ripeti questo passaggio il giorno successivo. Per iniziare l'incorporazione, prima riscalda gli stampi di metallo a 62 gradi Celsius, quindi versa circa 13 millilitri di cera fusa nella base dello stampo.

Con una pinza riscaldata, trasferire un campione di tessuto nello stampo e orientarlo nella posizione desiderata. Spostare con cautela lo stampo sulla piastra di raffreddamento e lasciarlo riposare fino a quando la cera non si sarà solidificata. Quindi, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il blocco del campione di paraffina in una colonna di dimensioni adeguate con una superficie trapezoidale nella parte superiore.

Aggiungere 800 microlitri di composto ottico per la temperatura di taglio, o OCT, al centro della fase del criostato. Posizionare il blocco di paraffina sul tavolino e orientare rapidamente il blocco di tessuto nella posizione desiderata. Trasferire il blocco di paraffina e lo stadio in una camera di cristallostato.

Congelare rapidamente l'OCT a una temperatura negativa di 42 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, raffreddare l'adattatore del cristallo e la temperatura della camera rispettivamente a -20 gradi Celsius e -16 gradi Celsius. Collegare il blocco e il tavolino all'adattatore crystat.

Ora, sezionare i tessuti a 10 micrometri di spessore. Usando una pinza, raccogliere le sezioni di tessuto e posizionarle in modo che galleggino su 800 microlitri di acqua trattata con DEPC su un vetrino rivestito di poli-l-lisina. Trasferire i vetrini su una piastra riscaldante impostata a 42 gradi Celsius.

Lascia appiattire le sezioni e usa la carta da filtro per assorbire l'acqua dai bordi. Lasciare il campione sulla piastra calda a 42 gradi Celsius durante la notte per consentire al tessuto di essere montato sul vetrino. Per deparaffinare i campioni, posizionare prima i vetrini di tessuto montati in un rack di colorazione.

Aggiungere 150 millilitri di xilene in un barattolo colorante e immergere il rack di vetrini per cinque minuti. Successivamente, reidratare i campioni mettendoli in concentrazioni decrescenti di etanolo, 150 millilitri ciascuno per tre minuti alla volta a temperatura ambiente. Infine, immergere i campioni in acqua distillata doppia per tre minuti.

Colorare i campioni ponendo i vetrini in 150 millilitri di soluzione di ematossilina per 1,5 minuti. Sciacquare per alcuni secondi in 150 millilitri di acqua bidistillata contenente una o due gocce di acido cloridrico N, quindi lavare brevemente i vetrini con acqua bidistillata. Disidratare nuovamente i campioni utilizzando una serie di 150 millilitri di concentrazioni crescenti di etanolo per tre minuti a temperatura ambiente.

Immergere i campioni in 150 millilitri di xilene per cinque minuti. Infine, montare i campioni aggiungendo delicatamente 600 microlitri di terreno di montaggio a base di xilene su ciascun vetrino, quindi posizionando un vetrino coprioggetto sul campione. Utilizzando questo metodo, sono state generate sezioni di tessuto di orchidee phalaenopsis, tra cui la gemma ascellare, tipicamente difficile da sezionare, che contiene alti livelli di cristalli.

Le strutture dettagliate sono state preservate, consentendo la visualizzazione dei corpi proteici. Il taglio ibrido ha anche prodotto un sezionamento chiaro per la visualizzazione del meristema apicale del germoglio del seme germinato. Queste immagini mostrano la preparazione di sezioni trasversali di foglie di piante di riso e grano utilizzando le tradizionali tecniche di sezionamento a paraffina rispetto a quelle ibride.

Queste colture contengono in genere alti livelli di silice, il che le rende difficili da sezionare. L'integrità del tessuto nelle sezioni del taglio ibrido è stata significativamente migliorata e le strutture chiave, spesso distorte o difficili da trovare nei campioni di paraffina, sono state conservate nella loro interezza nel tessuto del taglio ibrido. Inoltre, la lacrimazione è stata osservata solo nei campioni sezionati con paraffina.

Inoltre, la forte ritenzione dell'anatomia rende i tessuti tagliati ibridi utili per lo studio dei modelli di espressione genica spaziale. Qui, l'ibridazione in situ con Actina e Ciclina B1:1 è stata effettuata su sezioni tagliate ibride della seconda e terza gemma ascellare delle orchidee phalaenopsis. La migliore conservazione anatomica ha permesso di rilevare livelli di espressione più elevati dei geni bersaglio nelle cellule meristematiche in via di sviluppo delle terze gemme ascellari.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere una temperatura a meno 16 gradi centigradi per indurire il blocco di paraffina. Ciò dovrebbe portare a una sezione di tessuto di buona qualità. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta dopo aver fallito molte volte nell'eseguire con successo il sezionamento nell'orchidea utilizzando il tradizionale metodo di paraffina o criosezione.

Seguendo questa procedura, tutti gli esperimenti come l'ibridazione in situ e la FISH possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, tra cui lo studio della localizzazione spaziale e della funzione dei geni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il sezionamento di tessuti di alta qualità in campioni di piante recalcitranti.