Name: Diffusione molecolare nel plasma membrane dei linfociti primari misurati da Fluorescence Correlation Spectroscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Impara a misurare la diffusione molecolare nelle membrane dei linfociti primari utilizzando la spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS). Questa tecnica consente di studiare la dinamica dei recettori in cellule vive.

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Ringraziamo il Dr. Vladana Vukojević, Centro di Medicina Molecolare, Karolinska Institutet per la manutenzione dello strumento Zeiss ConfoCor 3 e per suggerimenti utili per quanto riguarda le misure di cella. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dal Vetenskapsrådet (concessione numero 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse, e da Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo per FCS può essere utilizzato per la valutazione delle dinamiche molecolari di molecole di superficie su tutti i tipi di cellule immunitarie (murina, umana, o altre specie). Misure FCS spazio-temporali dinamica molecolare fino a risoluzione di una singola molecola in cellule vive. La densità molecolare, nonché le dinamiche dei tassi di diffusione e di clustering delle proteine ​​di interesse, possono essere estratte dalle curve di autocorrelazione. L&#39;etichettatura fluor...

Molte funzioni cellule immunitarie si affidano a diffusione molecolare e interazioni all&#39;interno delle membrane. Membrane biologiche sono complesse, e molti fattori che possono essere importanti per la funzione delle cellule immunitarie possono influenzare la velocità di diffusione traslazionale delle proteine all&#39;interno delle membrane cellulari 1. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule natural killer (NK), i linfociti appartenenti al sistema immunitario innato, mostrano la diffusione differenziale delle due proteine studiate a livello della membrana cellulare a seconda dello stato di attivazione delle cellule NK 2. correlazione spettroscopia di fluorescenza (FCS) è una tecnica che è in grado di quantificare le velocità di diffusione molecolare all&#39;interno delle membrane biologiche. Riporta la velocità di diffusione media di fluorescente molecole in un volume fisso, in genere al centro di un microscopio confocale. Si basa sulla misura delle fluttuazioni della fluorescenza che si verificano al movimento molecolareun sistema in stato stazionario. FCS è stato ampiamente utilizzato per studiare la diffusione di coloranti fluorescenti e proteine, sia in soluzione che all&#39;interno delle membrane lipidiche. Altri parametri di output che influenzano la velocità di diffusione può anche essere studiati indirettamente in questo modo (ad esempio, i cambiamenti conformazionali di proteine o interazioni delle molecole sulle membrane delle cellule) 3, 4. FCS distingue rispetto ad altre tecniche grazie alla sua elevata sensibilità, consentendo la possibilità per il rilevamento singola molecola. Funziona bene per concentrazioni molecolari nel nanomolari alla gamma millimolare, che è tipico per livelli di espressione endogeni di maggior parte delle proteine 5. Inoltre, FCS può dare un&#39;approssimazione del numero assoluto delle proteine ​​all&#39;interno del volume studiati, mentre la maggior parte altre tecniche solo dare informazione relativa livelli di espressione della proteina. Altri metodi per misurare i tassi di diffusione molecolare all&#39;interno delle membrane includono fluorecupero rescence dopo photobleaching (FRAP), singola particella di monitoraggio (SPT), multipla pinhole FCS, e di correlazione immagine metodi. FRAP e correlazione immagine metodi sono tecniche di ensemble, che in genere non danno informazioni sul numero assoluto di molecole 10. Rispetto al SPT, il throughput di FCS è maggiore per quanto riguarda caratterizzare la media della popolazione. L&#39;analisi è anche meno impegnativa in quanto il tasso medio di diffusione delle molecole presenti nel fuoco del laser viene misurata, piuttosto che il tasso di singole molecole. Inoltre, a meno microscopi specializzati sono disponibili 11, SPT non può fornire alcuna informazione circa concentrazioni, poiché etichettatura serie SPT deve essere molto bassa per consentire l&#39;identificazione di molecole singole. D&#39;altra parte, FCS richiede le molecole sotto studio per essere mobili. E &#39;semplicemente non rilevare eventuali frazioni immobile putativi o molecole si muovono molto lentamente. La velocità di diffusione delle molecole cherisiede nel fuoco più di circa un decimo del tempo di acquisizione non verrà rappresentata correttamente misurazioni FCS 3, 12. Pertanto, coefficienti di diffusione registrati da FCS tendono ad essere più veloce di velocità di diffusione riportati da tecniche come FRAP e SPT, dove le frazioni close-to-immobile e molto lenti sono presi in considerazione pure. SPT darà anche una descrizione più dettagliata della variabilità dei tassi di diffusione nella popolazione molecolare di FCS sarà. FCS quantifica la fluttuazione di intensità di fluorescenza nel tempo all&#39;interno del volume eccitato. Nel caso di misure di membrana, questo si traduce in zona illuminata della membrana. In questo lavoro, utilizziamo il fatto che tali fluttuazioni sono indotti da molecole espongono diffusione browniano e si muovono quindi in e fuori del volume di eccitazione. Ci sono anche diverse altre possibili fonti per il fluctuazioni nel segnale di fluorescenza, come lampeggiante o la presenza di uno stato di tripletto nei fluorofori, effetti ambientali, vincolante unbinding del ligando, o movimento di tutta la membrana cellulare. Queste fonti di errore putativi devono essere presi in considerazione quando si progetta un esperimento FCS al fine di interpretare con precisione i risultati di 12, 13. In genere, i tassi di diffusione laterale nelle membrane biologiche sono bassi a causa di affollamento e le interazioni, sia tra proteine ​​di membrana e tra le proteine ​​e il citoscheletro. Storicamente, l&#39;uso di FCS in membrane è pertanto stata ostacolata dalla mancanza di fluorofori fotostabili, che sono necessari per evitare sbiancamento durante i tempi di transito estesi attraverso la messa a fuoco di eccitazione 14. Tuttavia, oggi, ci sono molte opzioni per adatti coloranti foto-stabile. Miglioramenti significativi nella rilevatori e altro hardware consentono anche l&#39;individuazione di prote fluorescenteins e coloranti di luminosità inferiore. Qui, un protocollo di base per l&#39;applicazione di FCS utilizzando linfociti primari murini, dove la proteina di interesse è etichettato con una fluorescente contrassegnati anticorpi, è descritto. Un approccio per adattarsi alle curve di autocorrelazione per estrarre il coefficiente di diffusione e la densità molecolare è anche mostrato. Il protocollo si propone di essere facilmente seguita da immunologi con nessuna esperienza precedente di tecniche per studiare la diffusione delle molecole. Tuttavia, si prevede una conoscenza di base di microscopia confocale (per ottenere questa conoscenza di base, vedi riferimento 15). Questo protocollo può abbastanza facilmente essere adattato ad altre cellule in sospensione, entrambe le linee cellulari e cellule primarie. Per gli utenti più esperti FCS, esistono più raffinati metodi di analisi, alcuni dei quali sono descritti nella discussione.

<table><tbody><tr><td>Kit di isolamento cellulare MACS NK mouse II</td><td>Miltenyi Biotec NordenAB</td><td>130-096-892</td><td>Selezione negativa di cellule NK</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td> Soluzione salina tamponata con fosfato <td>inattivato a caldo</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>Prodotto in casa&nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medio 1640</td><td>PAA La società di colture cellulari&nbsp;</td><td>E15-848</td><td>Clone di</td></tr><tr><td>anticorpo medio trasparente 2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>Per il blocco dei recettori Fc.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Ly49A&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Anticorpo monoclonale prodotto in casa e coniugato in casa ad Alexa fluor 647</td></tr><tr><td>Clone JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H-2Dd.</td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>coniugato internamente al clone MFP488</td></tr><tr><td>34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>Colorante fluorescente per la coniugazione di anticorpi.</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Diluita in acqua distillata (1,10)</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina (20 kDa) innestata con polietilenglicole (2 kDa)</td><td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3,5]-PEG(2)Diluita</td> <td>in PBS (pH 7,4) a 0,5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Cloruro di rodamina 110</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>432202</td><td>Coefficiente di diffusione noto: 3,3 &volte; 10&minus; 10 m2/sec 19</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A20006</td><td>Coefficiente di diffusione noto: 4,4 &volte; 10&minus; 10 m2/sec 20</td></tr><tr><td>Microscopio confocale&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Software: Confocor 3</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software: Matlab con toolbox per il montaggio a curva</td><td>Matlab</td><td>Versione R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Coverglass a camera</td><td>Termo-scientifico&nbsp;</td><td>155411</td><td>8 pozzetti, fondo in borosilicato 1.0</td></tr></tbody></table>

diffusione molecolare nel plasma membrane dei linfociti primari misurati da fluorescence correlation spectroscopy

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

correlazione spettroscopia di fluorescenza (FCS) è una tecnica potente per studiare la diffusione delle molecole all&#39;interno delle membrane biologiche con elevata risoluzione spaziale e temporale. FCS può quantificare la concentrazione e diffusione molecolare coefficiente di molecole marcate fluorescenza nella membrana cellulare. Questa tecnica ha la capacità di esplorare le caratteristiche di diffusione molecolare delle molecole nella membrana plasmatica di cellule immunitarie in stato stazionario (cioè, senza processi che influenzano il risultato durante il tempo di misurazione effettiva). FCS è adatto per studiare la diffusione di proteine ​​che vengono espresse a livelli tipici per proteine ​​più endogene. Qui, un metodo semplice e robusto per determinare la velocità di diffusione delle proteine ​​di membrana cellulare sui linfociti primari è dimostrata. Un modo efficace per eseguire misure su cellule vive colorate con anticorpo e osservazioni comuni che si verificano dopo l&#39;acquisizione sono descritti. I progressi recentinello sviluppo di coloranti fluorescenti fotostabili può essere utilizzato coniugando anticorpi di interesse appropriarsi coloranti che non candeggiare ampiamente durante le misurazioni. Inoltre, questo permette la rilevazione di entità diffondenti lentamente, che è una caratteristica comune di proteine ​​espresse nelle membrane cellulari. La procedura di analisi per estrarre i parametri di concentrazione e di diffusione molecolare dalle curve di autocorrelazione generate viene evidenziato. In sintesi, viene fornito un protocollo di base per misurazioni FCS; può essere seguito da immunologi con una comprensione della microscopia confocale ma nessun&#39;altra esperienza precedente di tecniche per la misurazione di parametri dinamici, come i tassi di diffusione molecolare.

Un tipico risultato genera una curva di autocorrelazione con un tempo di transito nella gamma da 10 msec a 400 msec per le proteine ​​di membrana. Il numero di molecole può variare tra 0,5 e circa 200 per micron 2 per proteine endogenamente espressi. Controllare attentamente che il CPM non è inferiore al previsto. Questo può significare che vi è una influenza del segnale di fondo. Come regola generale, il segnale CPM sulle cellule che viene accettato per analisi non deve esser...

Viene descritto un metodo per misurare la diffusione delle proteine nelle membrane delle cellule immunitarie primarie utilizzando la spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS). In questo articolo viene illustrato l'uso di anticorpi per la marcatura fluorescente.

Diffusione molecolare nel plasma membrane dei linfociti primari misurati da Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è misurare la velocità di diffusione di una proteina marcata nelle membrane delle cellule immunitarie primarie utilizzando la spettroscopia di correlazione della fluorescenza. Questo metodo può aiutare a identificare questioni chiave nei campi dell'immunologia e della biologia cellulare, come l'identificazione delle cellule natural killer con una dinamica del recettore di membrana più attiva. Il vantaggio principale di questa tecnica è che viene utilizzata con cellule vive, quindi riflette accuratamente lo stato naturale su come si muovono le molecole.Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'immunoterapia del cancro se diversi tratti delle cellule natural killer, come la diffusione molecolare, sono legati alla loro funzione che può prevedere meglio l'efficienza. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul movimento molecolare nelle cellule immunitarie, può essere applicato anche ad altre cellule primarie e linee cellulari in qualsiasi disciplina. Aprire il software in modalità esperto, con l'opzione Scansiona nuove immagini selezionata.Selezionare l'obiettivo dell'acqua 40X sul microscopio a scansione laser confocale. Nella scheda Acquisisci, premere i pulsanti Config e Scan per aprire il controllo di configurazione e il controllo di scansione. Nella scheda ConfoCor, premere Misura per aprire la finestra Misurazione.Quindi, creare una cartella per salvare le misurazioni FCS. Avviare un nuovo database di immagini facendo clic su Nuovo nella scheda File. Accendere la lampada alogena.Utilizzando il pulsante Laser, accendere i relativi laser per eccitare i fluorofori. Specificare quindi le impostazioni per l'acquisizione delle immagini nella finestra Controllo configurazione. Ciò include il laser di eccitazione, i filtri di eccitazione ed emissione, il percorso della luce e i rivelatori in uso.Allo stesso modo, andare alla finestra Misurazione e regolare le impostazioni FCS nella scheda Configurazione del sistema. Attivare i canali di rilevamento per le registrazioni FCS alternando Ch 1 per il canale verde e Ch 2 per il canale rosso. Mentre il laser si stabilizza, operazione che può richiedere fino a 30 minuti, regolare il foro stenopeico.Per prima cosa, posizionare una goccia da 50 microlitri di colorante centralmente in un pozzetto di un vetrino di copertura a otto pozzetti rivestito di poli-L-lisina. I pozzetti adiacenti vengono utilizzati per effettuare misurazioni delle celle, poiché la calibrazione dipende dal vetrino. Mettere una goccia di acqua distillata sulla lente dell'obiettivo dell'acqua 40X e posizionare il vetrino.Quindi premere Vis per selezionare la sorgente di luce visibile e concentrarsi sulla posizione centrale della gocciolina di fluoroforo. Nella finestra Misurazione del software, selezionare la scheda Acquisizione e in Posizioni, alternare la posizione corrente. Quindi torna alla scheda Configurazione del sistema nella stessa finestra e imposta una potenza alta o di saturazione per il laser verde.Per testare la stabilità del segnale, premere Start per aprire una nuova finestra che mostra la traccia temporale e la curva di correlazione automatica. Verificare che il segnale fluorescente sia alto, stabile e che l'asse y mostri fluttuazioni nell'intervallo dei kilohertz. Valori più bassi potrebbero essere dovuti a una messa a fuoco imprecisa o alla degradazione del colorante.Successivamente, nella finestra Misurazione, selezionare il pulsante O Regola. Quindi selezionare il canale di rilevamento corretto e premere Auto Adjust X.Se il limite superiore della curva risultante è mancante o non centrato, selezionare l'opzione Coarse e premere nuovamente Auto Adjust X. Dopo aver regolato la direzione X, fare lo stesso per la direzione Y premendo su Regolazione automatica Y.Deselezionare Grossolano e alternare tra la regolazione X e Y premendo Regolazione automatica fino a quando entrambi non hanno valori massimi chiari e stabili.Se le cellule sono marcate con due fluorofori diversi, aggiungere una goccia di soluzione di fluoroforo rosso in una camera adiacente. Quindi calibrare il secondo canale. Impostare il laser rosso su una potenza elevata e ripetere la procedura di calibrazione della stabilità.Successivamente, misuriamo il tempo di transito dei fluorofori che si diffondono liberamente attraverso il fuoco. E poi usiamo il tavolino per calcolare l'area della membrana cellulare che si trova all'interno del fuoco. Per iniziare, concentrarsi su una goccia di soluzione eseguendo attentamente la procedura di regolazione.Quindi vai alla scheda Acquisizione nella finestra Misurazione e imposta il tempo di acquisizione su 30 secondi con tre ripetizioni. Impostare la potenza del laser quasi a saturazione e premere Avvia per eseguire una misurazione. Registra i conteggi per molecola o CPM al termine della misurazione.Quindi eseguire nuove misurazioni riducendo iterativamente la potenza del laser. All'interno di questo intervallo di potenza, includere la potenza prevista delle prossime misurazioni della cella. Successivamente, verificare che i valori CPM vengano scalati linearmente con la potenza del laser.A condizione che il resto della scala sia lineare, la saturazione alla massima potenza è accettabile. La prima volta che viene utilizzato un anticorpo fluorescente appena coniugato, eseguire una misurazione FCS degli anticorpi a diffusione libera per quantificare il CPM atteso. Ed è importante utilizzare pozzetti rivestiti con PEG Poli-L-Lisina per gli anticorpi liberi.Per questa procedura, rivestire un vetrino a camera con 200 microlitri di poli-L-lisina innestata su polietilenglicole. Lasciare agire la soluzione per un'ora a temperatura ambiente. La soluzione madre può essere refrigerata per un massimo di due settimane.E il brodo di polvere deve essere conservato nel congelatore. Successivamente, rimuovere il liquido e lasciare asciugare la camera all'aria. Al microscopio, diluire l'anticorpo in PBS a una dose compresa tra uno e 10 microgrammi per millilitro.Procedere alla misurazione del tempo di transito degli anticorpi liberi come descritto nella sezione precedente per i fluorofori liberi. Per effettuare la misurazione in una cellula, aggiungere 125 microlitri di cellule in PBS più l'1% di FCS dalla sospensione cellulare marcata con anticorpi. E 150 microlitri di Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 trasparente in un pozzetto vuoto nel vetrino rivestito di PLL.Lasciare incubare le cellule al buio alla temperatura di misurazione per almeno 20 minuti prima di procedere, in modo che le cellule possano attaccarsi ed equilibrarsi. Avvia l'imaging con scansioni XY veloci per trovare la potenza laser più bassa possibile necessaria per visualizzare le cellule. Quindi centrare l'immagine su una cella rotonda di luminosità media dove la membrana è chiaramente definita.È fondamentale che non vi sia alcun segnale fluorescente nel citoplasma. Ingrandisci fino a quando la cella non copre la maggior parte dell'immagine. Quindi concentrati sulla parte superiore della membrana cellulare.Inizia dal centro della cella e spostati verso l'alto fino a quando il centro dell'immagine mostra una piccola area rotonda con fluorescenza uniforme. Un posizionamento accurato della messa a fuoco è fondamentale. Se il fuoco non è nella membrana, la fluorescenza rilevata non proverrà dai recettori di membrana marcati in fluorescenza.E quindi i risultati non rifletteranno il loro comportamento. Ora, nella scheda Acquisizione della finestra Misurazione, selezionare una posizione per la misurazione FCS attivando il mirino. Quindi imposta il numero di ripetizioni tra sei e 10 e imposta il tempo di misurazione su 10 secondi per ripetizione.Ora torna alla scheda Configurazione del sistema della finestra Misurazione e riduci la potenza del laser per le misurazioni FCS tra uno e 10 microwatt. Quindi premere Start. Se la traccia di intensità scende di oltre il 30% durante i primi 10 secondi, la cella è stata sbiancata troppo e un'altra cella deve essere misurata a una potenza inferiore.Se il segnale viene perso, regolare la messa a fuoco in direzione Z e riavviare la misurazione. Al termine della misurazione, guardare nella finestra Controllo scansione per verificare che la cellula sia ancora centrata per essere sicuri che la sua membrana sia stata misurata. Se la cella è stata spostata, eliminare i dati.Ora vai alla finestra Correlazione automatica ed elimina manualmente le singole ripetizioni che contengono manovre di zoom, sbiancamento, grandi ammassi o altri artefatti. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Elimina per rimuovere gli artefatti. La selezione degli artefatti effettivi richiede pratica.La rimozione delle ripetizioni è un processo semplice, ma le ripetizioni devono essere valutate correttamente per sapere cosa deve essere rimosso e cosa no. Quindi salva il file finale in formato FCS. Conservare solo le celle che hanno almeno quattro ripetizioni rimaste dopo la rimozione degli artefatti per ulteriori analisi.Una tipica curva di autocorrelazione del recettore di membrana è liscia e ha un tempo di transito compreso tra 10 e 400 millisecondi. Impostare i domini di adattamento in modo che siano rappresentati sia l'inizio che la fine della parte inclinata più ripida, che rappresenta la diffusione. Utilizzando un modello di diffusione libera in due dimensioni per adattare i dati, prestare attenzione alla parte più profondamente inclinata della curva.Piccole fluttuazioni pari o intorno a un secondo alla scala tau, osservate nel residuo, sono accettabili. Se la curva si adatta male, ma la cella non presenta problemi apparenti, come spostamenti, sbiancamento o cluster, è probabile che sia necessario modificare i valori iniziali o i limiti superiore e inferiore del modello. Una volta che il modello si adatta bene alla curva di correlazione automatica, estrarre i valori dei parametri variabili.Il numero di molecole può variare da 0,5 a circa 200 per micron quadrato per le proteine espresse endogenamente. Verificare che il valore CPM della misurazione cellulare sia almeno il 33% di quello registrato da anticorpi a diffusione libera. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la velocità di diffusione delle proteine utilizzando la spettroscopia di correlazione fluorescente.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque o sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere le cellule in ghiaccio fino a circa 20 minuti prima dell'inizio della misurazione. Non misurare i campioni per più di due ore.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio il modo in cui la velocità di diffusione è correlata al livello di espressione di una determinata proteina. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia molecolare e dell'immunologia per esplorare le dinamiche delle proteine nelle cellule vive.

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