Diffusione molecolare nel plasma membrane dei linfociti primari misurati da Fluorescence Correlation Spectroscopy

L'obiettivo generale di questo protocollo è misurare la velocità di diffusione di una proteina marcata nelle membrane delle cellule immunitarie primarie utilizzando la spettroscopia di correlazione della fluorescenza. Questo metodo può aiutare a identificare questioni chiave nei campi dell'immunologia e della biologia cellulare, come l'identificazione delle cellule natural killer con una dinamica del recettore di membrana più attiva. Il vantaggio principale di questa tecnica è che viene utilizzata con cellule vive, quindi riflette accuratamente lo stato naturale su come si muovono le molecole.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'immunoterapia del cancro se diversi tratti delle cellule natural killer, come la diffusione molecolare, sono legati alla loro funzione che può prevedere meglio l'efficienza. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul movimento molecolare nelle cellule immunitarie, può essere applicato anche ad altre cellule primarie e linee cellulari in qualsiasi disciplina. Aprire il software in modalità esperto, con l'opzione Scansiona nuove immagini selezionata.

Selezionare l'obiettivo dell'acqua 40X sul microscopio a scansione laser confocale. Nella scheda Acquisisci, premere i pulsanti Config e Scan per aprire il controllo di configurazione e il controllo di scansione. Nella scheda ConfoCor, premere Misura per aprire la finestra Misurazione.

Quindi, creare una cartella per salvare le misurazioni FCS. Avviare un nuovo database di immagini facendo clic su Nuovo nella scheda File. Accendere la lampada alogena.

Utilizzando il pulsante Laser, accendere i relativi laser per eccitare i fluorofori. Specificare quindi le impostazioni per l'acquisizione delle immagini nella finestra Controllo configurazione. Ciò include il laser di eccitazione, i filtri di eccitazione ed emissione, il percorso della luce e i rivelatori in uso.

Allo stesso modo, andare alla finestra Misurazione e regolare le impostazioni FCS nella scheda Configurazione del sistema. Attivare i canali di rilevamento per le registrazioni FCS alternando Ch 1 per il canale verde e Ch 2 per il canale rosso. Mentre il laser si stabilizza, operazione che può richiedere fino a 30 minuti, regolare il foro stenopeico.

Per prima cosa, posizionare una goccia da 50 microlitri di colorante centralmente in un pozzetto di un vetrino di copertura a otto pozzetti rivestito di poli-L-lisina. I pozzetti adiacenti vengono utilizzati per effettuare misurazioni delle celle, poiché la calibrazione dipende dal vetrino. Mettere una goccia di acqua distillata sulla lente dell'obiettivo dell'acqua 40X e posizionare il vetrino.

Quindi premere Vis per selezionare la sorgente di luce visibile e concentrarsi sulla posizione centrale della gocciolina di fluoroforo. Nella finestra Misurazione del software, selezionare la scheda Acquisizione e in Posizioni, alternare la posizione corrente. Quindi torna alla scheda Configurazione del sistema nella stessa finestra e imposta una potenza alta o di saturazione per il laser verde.

Per testare la stabilità del segnale, premere Start per aprire una nuova finestra che mostra la traccia temporale e la curva di correlazione automatica. Verificare che il segnale fluorescente sia alto, stabile e che l'asse y mostri fluttuazioni nell'intervallo dei kilohertz. Valori più bassi potrebbero essere dovuti a una messa a fuoco imprecisa o alla degradazione del colorante.

Successivamente, nella finestra Misurazione, selezionare il pulsante O Regola. Quindi selezionare il canale di rilevamento corretto e premere Auto Adjust X.Se il limite superiore della curva risultante è mancante o non centrato, selezionare l'opzione Coarse e premere nuovamente Auto Adjust X. Dopo aver regolato la direzione X, fare lo stesso per la direzione Y premendo su Regolazione automatica Y.Deselezionare Grossolano e alternare tra la regolazione X e Y premendo Regolazione automatica fino a quando entrambi non hanno valori massimi chiari e stabili.

Se le cellule sono marcate con due fluorofori diversi, aggiungere una goccia di soluzione di fluoroforo rosso in una camera adiacente. Quindi calibrare il secondo canale. Impostare il laser rosso su una potenza elevata e ripetere la procedura di calibrazione della stabilità.

Successivamente, misuriamo il tempo di transito dei fluorofori che si diffondono liberamente attraverso il fuoco. E poi usiamo il tavolino per calcolare l'area della membrana cellulare che si trova all'interno del fuoco. Per iniziare, concentrarsi su una goccia di soluzione eseguendo attentamente la procedura di regolazione.

Quindi vai alla scheda Acquisizione nella finestra Misurazione e imposta il tempo di acquisizione su 30 secondi con tre ripetizioni. Impostare la potenza del laser quasi a saturazione e premere Avvia per eseguire una misurazione. Registra i conteggi per molecola o CPM al termine della misurazione.

Quindi eseguire nuove misurazioni riducendo iterativamente la potenza del laser. All'interno di questo intervallo di potenza, includere la potenza prevista delle prossime misurazioni della cella. Successivamente, verificare che i valori CPM vengano scalati linearmente con la potenza del laser.

A condizione che il resto della scala sia lineare, la saturazione alla massima potenza è accettabile. La prima volta che viene utilizzato un anticorpo fluorescente appena coniugato, eseguire una misurazione FCS degli anticorpi a diffusione libera per quantificare il CPM atteso. Ed è importante utilizzare pozzetti rivestiti con PEG Poli-L-Lisina per gli anticorpi liberi.

Per questa procedura, rivestire un vetrino a camera con 200 microlitri di poli-L-lisina innestata su polietilenglicole. Lasciare agire la soluzione per un'ora a temperatura ambiente. La soluzione madre può essere refrigerata per un massimo di due settimane.

E il brodo di polvere deve essere conservato nel congelatore. Successivamente, rimuovere il liquido e lasciare asciugare la camera all'aria. Al microscopio, diluire l'anticorpo in PBS a una dose compresa tra uno e 10 microgrammi per millilitro.

Procedere alla misurazione del tempo di transito degli anticorpi liberi come descritto nella sezione precedente per i fluorofori liberi. Per effettuare la misurazione in una cellula, aggiungere 125 microlitri di cellule in PBS più l'1% di FCS dalla sospensione cellulare marcata con anticorpi. E 150 microlitri di Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 trasparente in un pozzetto vuoto nel vetrino rivestito di PLL.

Lasciare incubare le cellule al buio alla temperatura di misurazione per almeno 20 minuti prima di procedere, in modo che le cellule possano attaccarsi ed equilibrarsi. Avvia l'imaging con scansioni XY veloci per trovare la potenza laser più bassa possibile necessaria per visualizzare le cellule. Quindi centrare l'immagine su una cella rotonda di luminosità media dove la membrana è chiaramente definita.

È fondamentale che non vi sia alcun segnale fluorescente nel citoplasma. Ingrandisci fino a quando la cella non copre la maggior parte dell'immagine. Quindi concentrati sulla parte superiore della membrana cellulare.

Inizia dal centro della cella e spostati verso l'alto fino a quando il centro dell'immagine mostra una piccola area rotonda con fluorescenza uniforme. Un posizionamento accurato della messa a fuoco è fondamentale. Se il fuoco non è nella membrana, la fluorescenza rilevata non proverrà dai recettori di membrana marcati in fluorescenza.

E quindi i risultati non rifletteranno il loro comportamento. Ora, nella scheda Acquisizione della finestra Misurazione, selezionare una posizione per la misurazione FCS attivando il mirino. Quindi imposta il numero di ripetizioni tra sei e 10 e imposta il tempo di misurazione su 10 secondi per ripetizione.

Ora torna alla scheda Configurazione del sistema della finestra Misurazione e riduci la potenza del laser per le misurazioni FCS tra uno e 10 microwatt. Quindi premere Start. Se la traccia di intensità scende di oltre il 30% durante i primi 10 secondi, la cella è stata sbiancata troppo e un'altra cella deve essere misurata a una potenza inferiore.

Se il segnale viene perso, regolare la messa a fuoco in direzione Z e riavviare la misurazione. Al termine della misurazione, guardare nella finestra Controllo scansione per verificare che la cellula sia ancora centrata per essere sicuri che la sua membrana sia stata misurata. Se la cella è stata spostata, eliminare i dati.

Ora vai alla finestra Correlazione automatica ed elimina manualmente le singole ripetizioni che contengono manovre di zoom, sbiancamento, grandi ammassi o altri artefatti. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Elimina per rimuovere gli artefatti. La selezione degli artefatti effettivi richiede pratica.

La rimozione delle ripetizioni è un processo semplice, ma le ripetizioni devono essere valutate correttamente per sapere cosa deve essere rimosso e cosa no. Quindi salva il file finale in formato FCS. Conservare solo le celle che hanno almeno quattro ripetizioni rimaste dopo la rimozione degli artefatti per ulteriori analisi.

Una tipica curva di autocorrelazione del recettore di membrana è liscia e ha un tempo di transito compreso tra 10 e 400 millisecondi. Impostare i domini di adattamento in modo che siano rappresentati sia l'inizio che la fine della parte inclinata più ripida, che rappresenta la diffusione. Utilizzando un modello di diffusione libera in due dimensioni per adattare i dati, prestare attenzione alla parte più profondamente inclinata della curva.

Piccole fluttuazioni pari o intorno a un secondo alla scala tau, osservate nel residuo, sono accettabili. Se la curva si adatta male, ma la cella non presenta problemi apparenti, come spostamenti, sbiancamento o cluster, è probabile che sia necessario modificare i valori iniziali o i limiti superiore e inferiore del modello. Una volta che il modello si adatta bene alla curva di correlazione automatica, estrarre i valori dei parametri variabili.

Il numero di molecole può variare da 0,5 a circa 200 per micron quadrato per le proteine espresse endogenamente. Verificare che il valore CPM della misurazione cellulare sia almeno il 33% di quello registrato da anticorpi a diffusione libera. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la velocità di diffusione delle proteine utilizzando la spettroscopia di correlazione fluorescente.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque o sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere le cellule in ghiaccio fino a circa 20 minuti prima dell'inizio della misurazione. Non misurare i campioni per più di due ore.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio il modo in cui la velocità di diffusione è correlata al livello di espressione di una determinata proteina. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia molecolare e dell'immunologia per esplorare le dinamiche delle proteine nelle cellule vive.