La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An In Vitro Set-up per l'indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

L'obiettivo generale di questo saggio di cocoltura indiretta è quello di studiare l'impatto degli astrociti sullo sviluppo dei neuroni. Il nostro laboratorio è interessato al ruolo delle interazioni neurone-glia. Si ritiene che gli astrociti contribuiscano alla formazione delle sinapsi, le strutture di collegamento del sistema nervoso centrale.

Per studiare il loro ruolo, abbiamo progettato un modello in vitro in cui possiamo combinare astrociti primari e neuroni embrionali primari, in compartimenti separati. I compartimenti sono collegati da una membrana permeabile, che consente l'analisi degli scambi tra i due tipi di cellule. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di monitorare la formazione delle sinapsi per periodi fino a quattro settimane.

Inoltre, è possibile studiare i ruoli individuali degli astrociti da un lato e dei neuroni dall'altro, utilizzando questo test. E infine, possiamo anche studiare più in dettaglio il secretoma dei nostri compartimenti cellulari che contiene molecole che mediano l'influenza reciproca di entrambi i compartimenti cellulari in quel sistema. Questo metodo può fornire informazioni sulle interazioni tra neuroni e astrociti.

Inoltre, può essere applicato ad altri organismi modello, come le cellule di ratto. Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avrebbero difficoltà perché è necessaria esperienza per ottenere l'operazione di maturazione ottimale del tessuto ippocampale dopo la dissezione. Per sezionare le cortecce rimuovere la pelle dal cranio lungo la linea mediana partendo dal collo fino al livello degli occhi.

Quindi, tieni la testa per l'estremità rostrale con un paio di pinze e fai un'incisione lungo la linea mediana del cranio. Quindi, taglia le metà sinistra e destra del cranio per esporre il cervello. Dopodiché, solleva il cervello dal cranio e trasferiscilo in una capsula di Petri di 10 cm riempita con HBSS.

Procedere allo stesso modo con gli esemplari rimanenti fino a quando tutti i cervelli sono raccolti nel piatto. Per separare le cortecce, pizzicare la cotenna posteriore usando un paio di pinze. Praticare un'incisione sulla linea mediana tra i due emisferi.

Fissare con cura il cervello e tagliare il mesencefalo e il bulbo olfattivo usando un secondo paio di pinze, che si traduce in due metà corticali. Successivamente, fissare una metà corticale con un paio di pinze e staccare le meningi staccandola dal bordo laterale. E successivamente estraendolo dalla superficie corticale usando un secondo paio di pinze.

Orientare la metà corticale con la superficie rivolta verso il basso. Sezionare con cura e rimuovere l'ippocampo a forma di mezzaluna. Quindi trasferire le cortecce in un tubo conico da 15 ml.

Aggiungere un ml di denem e lo 0,1% di papaina wv in una provetta di reazione da 2 ml. Incubare la sospensione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius fino a quando la soluzione non è limpida. Aggiungere la L-cisteina e la DNAsi alla miscela e agitare delicatamente.

Successivamente filtrare la miscela per ottenere un ml di soluzione sterile, quindi aggiungerla al tessuto corticale e incubare per 30 minuti a un'ora a 37 gradi Celsius. Per terminare la reazione di digestione, aggiungere un ml di terreno per astrociti e titolare accuratamente il tessuto digerito. Successivamente, aggiungere cinque ml di terreno per astrociti alla sospensione cellulare.

Una volta che il tessuto è stato dissociato in una sospensione di una singola cellula, centrifugarlo per cinque minuti. Successivamente, aspirare con cura il surnatante dal pellet risultante e risospendere le cellule in un ml di terreno per astrociti. Aggiungere la sospensione cellulare ai flaconi T75 reintegrati con nove ml di terreno per astrociti.

Dopo sette giorni di coltura, controllare se le cellule hanno formato un monostrato confluente. Assicurarsi che la temperatura sia regolata a 37 gradi Celsius e che il filtro del pallone sia sigillato con pellicola di laboratorio per evitare l'evaporazione dell'anidride carbonica. Per sbarazzarsi delle cellule progenitrici e ottenere una coltura di astrociti pura, posizionare le fiasche T75 su un agitatore orbitale e agitare le colture per una notte a 250 rotazioni al minuto.

Il giorno successivo aspirare il terreno e aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco reintegrato con 20 micromolari di RSE per eliminare le cellule in divisione residue. In questa procedura, posizionare tutti gli inserti necessari nella piastra a 24 pozzetti. Rivestire ogni inserto con 10 microgrammi per ml di polilisina e incubare per un'ora.

Dopo un'ora lavare gli inserti due volte con PBS. Nel frattempo, aspirare il terreno degli astrociti e lavare la coltura una volta con 10 ml di PBS per assicurarsi che il siero residuo venga rimosso. Successivamente, aggiungere tre ml di tripsina edta allo 0,05% nei flaconi e incubare le cellule per la tripsinizzazione per circa 10 minuti.

Successivamente, risospendere delicatamente le cellule in sette ml di terreno astrocitario. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare per cinque minuti a 216 x g. Quindi aspirare con cura il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un ml di terreno per astrociti.

Contare le celle utilizzando una camera di conteggio. Successivamente, riempire la piastra a 24 pozzetti con 500 microlitri di terreno per astrociti per pozzetto. Aspirare il PBS e trasferire 25.000 cellule e 500 microlitri di terreno astrocitario in ogni singolo inserto e incubare la coltura a 37 gradi Celsius.

Per sezionare l'ippocampo, preparare tre piatti da 10 cm riempiti con terreno di preparazione e un tubo da 2 ml con un ml di terreno di preparazione. Sezionare gli ippocampi dai noyadees della corteccia e raccoglierli in un tubo da due ml riempito con terreno di preparazione. È fondamentale che l'ippocampo sia isolato senza un tessuto adiacente proveniente da altre regioni del SNC.

Pertanto, dopo aver rimosso l'ippocampo, i tessuti contaminanti estranei devono essere ulteriormente rimossi. Dopo la dissezione, trasferire la provetta su un banco sterile a flusso laminare. Rimuovere con cura il terreno di preparazione e digerire il tessuto ippocampale di un ml di soluzione digestiva contenente papaina.

Dopo 15 minuti di digestione, prelevare con cautela la soluzione digestiva aspirando delicatamente con la pipetta. A causa dell'elevata sensibilità del neurone, è fondamentale titolare attentamente l'ippocampo per evitare bolle e ottenere l'intensità di titolazione ottimale. Lavare l'ippocampo tre volte con terreno neuronale aggiungendo e aspirando con cura un ml di terreno di coltura fresco per ciclo di lavaggio.

Dopo l'ultima fase di lavaggio, titolare accuratamente il tessuto in un ml di terreno neuronale. Quindi contare le cellule utilizzando una camera di conteggio. Piastra 35.000 cellule in 500 microlitri di terreno neuronale per pozzetto della piastra a 24 pozzetti e incuba i neuroni a 37 gradi Celsius per un'ora.

Ora togliete dall'incubatrice gli inserti preparati, che sono stati seminati con monostrati di astrociti confluenti. Sostituire il terreno aspirando il terreno degli astrociti e sostituendolo con 500 microlitri di terreno neuronale fresco. Quindi posizionare con cura gli inserti con gli astrociti nei pozzetti che contengono le colture di neuroni utilizzando una pinza sterile.

Successivamente, riposizionare la cocoltura di astrociti con neuroni indiretti risultante nell'incubatrice fino al completamento degli esperimenti. Questa immagine mostra i monostrati formati dagli astrociti sulla membrana dell'inserto della coltura cellulare. Gli astrociti sono immunocolorati per GFAP e MMP2.

Lo schema qui illustrato illustra l'impostazione della cocultura indiretta. Sebbene due culture siano fisicamente separate, condividono lo stesso mezzo. Due mediatori molecolari secreti delle interazioni neuronali della glia sono stati rivelati nel terreno di coltura utilizzando il western blot con più isoforme di TNC, un vero e proprio regolatore della crescita e MMP2, un modificatore extra cellulare della matrice.

Questa immagine mostra che i neuroni primari sviluppano reti altamente interconnesse entro il quattordicesimo giorno di coltivazione. La colocalizzazione del fagotto marcatore presinaptico con l'impalcatura postsinaptica PSD95 documenta la formazione sinaptica strutturalmente completata. In conclusione, utilizzando il nostro sistema di analisi abbiamo dimostrato che è possibile combinare astrociti primari e neuroni primari nel modello di cocoltura.

Entrambi i sovratipi sono separati ma condividono lo stesso mezzo. Quindi, possiamo anche studiare il secretoma di entrambi i sovratipi nel nostro modello. In questo modello le sinapsi si sviluppano e maturano.

Inoltre, possiamo anche mostrare l'emergere di ulteriori strutture specifiche come le reti perineuronali. Pertanto, il nostro sistema modello è adatto per studiare l'influenza degli astrociti sulla formazione, la plasticità e la funzione delle sinapsi.