Name: La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An In Vitro Set-up per lindagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Scopri il saggio di co-coltura indiretta neuroni-astrociti per studiare le interazioni neuroni-glia in vitro. Questo metodo consente di analizzare la formazione delle sinapsi e lo sviluppo neuronale in un sistema compartimentalizzato.

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Il presente lavoro è stato sostenuto dalla fondazione di ricerca tedesca (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; dalla scuola di ricerca dell'Università della Ruhr di Bochum (GSC98/1) e dal programma prioritario SSP 1172 "Glia e sinapsi", Fa 159/11-1,2,3).

Gli esperimenti con i topi erano in conformità con la legge tedesca e la Società tedesca per le linee guida Neuroscience di allevamento. La cura degli animali e di utilizzo comitati del Università della Ruhr a Bochum hanno concesso i permessi appropriati. 1. Preparazione e coltivazione di corticale astrociti Nota: Completate queste fasi del protocollo almeno 7 d prima di procedere alle fasi successive, come le colture di astrociti dovrebbero svilupparsi in monostrati confluenti prima che i neuroni sono preparati. astrociti primari sono derivati ​​da colture gliali miste ottenute da cuccioli di topo intorno al giorno postnatale (P) 0-3. Tre cervelli (6 cortecce) per beuta T75 devono essere utilizzati. <ol><li> Preparare il mezzo astrociti completandolo Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero v / v cavallo e 0,1% v / v gentamicina in condizioni sterili. Conservare il mezzo a 4 ° C per 2 settimane. </li><li> Cappotto 3x T75 Boccette with 10 ug / mL Poly-D-lisina (PDL; in acqua coltura cellulare-grade) per almeno 1 ora a 37 ° C in presenza di 6% v / v CO 2. Dopo il rivestimento, lavare i flaconi due volte con tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere i cationi non legati, e aggiungere 9 ml di media astrociti. </li><li> Per la preparazione dei cervelli, aggiungere soluzione salina bilanciata di Hank 10 mL (HBSS) a 1x 10 centimetri Petri e 1 mL HBSS a 1x 15 mL tubo (indipendentemente dal numero di cervelli che verrà utilizzato). Tenere un paio di forbici chirurgiche, 2 pinza sottile e un binocolo a portata di mano per la procedura. </li><li> Decapitare 3 cuccioli rapidamente con le forbici chirurgiche e raccogliere le teste in un vuoto 10 centimetri piatto. <ol><li> Eseguire la preparazione delle cortecce sotto il binocolo. Utilizzando due pinza sottile, rimuovere la pelle dorsale dal cranio alla linea mediana, partendo dal collo verso il livello degli occhi. Successivamente, il cervello con i suoi vasi sanguigni è visibile sotto il cranio. </li><li>Fissare la testa alla fine rostrale con un paio di pinze e incidere la linea mediana del cranio, a partire dalla fine posteriore. Successivamente, la clip fuori le metà sinistra del cranio a destra e per esporre il cervello. </li><li> Chiudere la punta della pinza e posizionarlo sul ventre sotto il cervello. Sollevare il cervello fuori dal cranio e trasferirlo in HBSS pieno di 10 centimetri Petri. Procedere allo stesso modo con gli altri campioni fino a quando tutti i cervelli sono raccolti nel piatto. </li></ol></li><li> Dopo aver raccolto il cervello, inizia con la separazione delle cortecce pizzicando fuori romboencefalo usando un paio di pinze, come un paio di forbici. Eseguire un&#39;incisione mediana tra i due emisferi, con un paio di pinze. fissare con cura il cervello con una pinza e tagliare il mesencefalo e bulbi olfattivi utilizzando un secondo pinza per finire con le due metà corticali. </li><li> Fissare la metà corticale con un paio di pinze e sbucciare le meningi dalle emisferi da loro distacco FROM il bordo laterale e successivamente tirando dalla superficie corticale utilizzando un secondo pinza. </li><li> Capovolgere la parte corticale con la sua superficie orientata verso il piatto; attenzione sezionare e rimuovere l&#39;ippocampo a forma di mezzaluna con un paio di pinze. Trasferire i singoli cortecce nel conico tubo da 15 ml utilizzando una pinza chiusi per portare un individuo corteccia. </li><li> Dopo aver raccolto tutte le cortecce, transito verso la cappa a flusso laminare sterile e iniziare con i preparativi per la dissociazione del tessuto corticale. </li><li> Aggiungere 1 ml DMEM in una provetta 2 mL di reazione e aggiungere 0,1% w / v papaina (30 unità). Incubare la sospensione in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C fino a quando una soluzione chiarificata sviluppa (circa 3 min). Aggiungere 0,24 mg / ml di L-cisteina e 20 mg / ml DNAsi e agitare delicatamente. NOTA: Per la digestione, è necessario circa 1 mL di soluzione enzimatica. </li><li> Filtro (0,22 micron dimensione dei pori) per ottenere 1 ml di soluzione sterile prima di aggiungereal tessuto corticale. Incubare le provette per 30 min - 1 ora a 37 ° C (cioè, in un bagno d&#39;acqua). NOTA: i passaggi 1,11-1,14 sono critici e dovrebbe essere completato entro 15 minuti. </li><li> Per terminare la reazione di digestione, aggiungere 1 ml di media astrociti e triturare con cura il tessuto digerito con una pipetta 1 ml. Per triturazione, spostare delicatamente lo stantuffo della pipetta, aspirando così e estrusione la sospensione tessuto corticale. </li><li> Una volta che il tessuto è stato dissociato in una cella singola sospensione, aggiungere 5 ml di media astrociti e centrifugare per 5 min a 216 x g. </li><li> Aspirare il surnatante con cura dal pellet risultante e sospendere nuovamente le cellule in 1 media astrociti ml. </li><li> Aggiungere le sospensioni cellulari per fiaschi T75 rifornito con 9 medio astrociti mL (vedi 1.2). </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in incubatore in presenza di 6% v / v CO 2. Dopo 4 d, eseguire il primo cambio terreno completo (10 mL). Successivamente, modificare il terreno di coltura ogni 2 - 3 d. </li><li> Dopo 7 d, verificare se le cellule hanno formato un monostrato confluente. In caso contrario, attendere per altri 2 - 3 giorni fino è raggiunto completa confluenza della cultura. NOTA: Gli astrociti visualizzare grandi corpi cellulari appiattite, localizzare sul fondo del pallone e non sviluppano processi cellulari notevoli. Essi differiscono dalle piccole cellule progenitrici luminose a contrasto di fase e microglia risiedono in cima al monostrato 17. </li><li> Al fine di eliminare le cellule progenitrici e di ottenere una coltura pura astrociti, posizionare i contenitori T75 su un agitatore orbitale e scuotere le culture O / N a 250 rpm. Assicurarsi che la temperatura viene regolata a 37 ° C e che il filtro del pallone viene sigillato con una pellicola di laboratorio per evitare l&#39;evaporazione del CO 2. </li><li> Il giorno successivo, aspirare il terreno e aggiungere terreno di coltura di 10 ml di fresca rifornito con 20 mM citosina-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) a eliminacellule che si dividono residue te. NOTA: incubazione con AraC per 2 - 3 d in incubatore a 37 ° C, il 6% di CO 2 si tradurrà in una coltura pura astrociti. </li><li> Monitorare la purezza delle colture di astrociti mediante ispezione visiva sotto il microscopio ottico. Se le cellule progenitrici luminoso residuo a contrasto di fase e microglia risiedono ancora in cima alla monostrato astrociti 17 (vedi punto 1.16), ripetere i punti 1.18 e 1.19. NOTA: Il confluenti e monostrati astrociti puri possono essere mantenuti fino a 14 d in incubatrice (37 ° C, il 6% v / v di CO 2) prima di procedere alla fase successiva. Cambiare la metà del mezzo ogni 3 d. Non raccogliere, congelare e scongelare i astrociti, come queste cellule perdono le loro proprietà di supporto neuronali attraverso la procedura di memorizzazione. </li></ol> 2. Gli astrociti preparando per il co-coltura indiretta Nota: 48 - 72 ore prima di preparare i neuroni, astrociti trasferimento al celInserti l-cultura. Generalmente, una singola beuta T75 fornisce un numero sufficiente di cellule per sostenere le colture neuronali ottenuti con una preparazione. <ol><li> Posto come molti inserti come necessario in 24-pozzetti-. Coat ciascun inserto con 10 ug / mL PDL (disciolto in acqua coltura cellulare-grade) per circa 1 ora a 37 ° C, 6% v / v CO 2. Dopo l&#39;incubazione, lavare gli inserti due volte con PBS. Nel frattempo, procede all&#39;elaborazione di astrociti. NOTA: Gli inserti riempiti con PBS possono essere mantenuti fino alla sospensione cellulare astrociti è pronto all&#39;uso. </li><li> Aspirare il mezzo di astrociti (con AraC) e lavare la cultura una volta con 10 ml di PBS per garantire qualsiasi siero residuo viene rimosso. </li><li> Aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) ai flaconi e incubare le cellule per tripsinizzazione a 37 ° C, 6% v / v CO 2 per circa 10 min. </li><li> Controllare il distacco delle cellule mediante ispezione visiva utilizzando un microscopio e facilitaTE il distacco delle cellule toccando il lato dei flaconi contro desktop. NOTA: i passaggi 2,5-2,8 sono critici e dovrebbe essere completato entro 15 - 20 min. </li><li> Dopo la tripsinizzazione, delicatamente risospendere le cellule in 7 mL medio astrociti e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. Centrifugare per 5 min a 216 x g. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 media astrociti ml. </li><li> Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio. </li><li> Riempire il fondo dei pozzetti della 24-ben piatto con 500 microlitri di media astrociti e trasferire 25.000 cellule in 500 microlitri di media astrociti in ogni singolo inserimento. Incubare la coltura a 37 ° C, 6% v / v CO 2. NOTA: dopo 42 - 72 ore, le culture raggiungerà circa il 100% di confluenza. In questa fase la purezza della coltura può essere verificata mediante immunocitochimica 11. Le colture confluenti possono essere mantenute per un massimo di 7 d fino procedere allaprossimo passo. Cambiare la metà del mezzo ogni 3 d. </li></ol> 3. Preparazione di primaria neuroni dell&#39;ippocampo Nota: neuroni dell&#39;ippocampo di topo primaria dovrebbero essere derivati ​​da E15.5 - E16 embrioni di topi in gravidanza cronometrati. <ol><li> Preparare mezzo neurone (MEM con 10 mM piruvato di sodio, 0,1% w / v ovalbumina, 2% v / v B27 mezzo integratore, e 0,1% v / v gentamicina (sterile filtrato)), e media di preparazione (HBSS con 0,6% w / v glucosio e 10 mM HEPES (4- (2-idrossietil) acido etansolfonico -1-piperazina)). Pre-calda e pre-equilibrare il mezzo neurone in beute per filtrazione a 37 ° C, 6% v / v CO 2. </li><li> Posizionare il vetro-coprioggetti (diametro 12 mm) nei pozzetti di 24 pozzetti piastre (utilizzare i coprioggetti speciali, che sono dentata per l&#39;utilizzo con inserti colture cellulari). <ol><li> Coat per almeno 1 h con 15 ug / mL Poly-DL-ornitina in acqua (coltura cellulare-grade) a 37 ° C. Utilizzare almeno 500 microlitri per pozzetto per garantire chei coprioggetti sono completamente coperti. Lavare i pozzetti due volte con PBS. Lasciare il PBS nei pozzetti fino placcatura le cellule. Assicurarsi che i pozzi non si asciugano. </li></ol></li><li> Per sezionare i ippocampi, preparare 3x 10 cm piatti pieni di media preparazione e 1x tubo di 2 ml con 1 mezzo di preparazione ml. Preparare forbici e 2 pinza sottile. </li><li> Sacrificare il mouse incinta di dislocazione cervicale, sterilizzare l&#39;addome mediante lavaggio con il 70% v / v di etanolo, e aprire l&#39;addome con le forbici affilate. Asportare l&#39;utero di perline accuratamente con le forbici e trasferire l&#39;organo in 1x 10 centimetri piatto pieno di media preparazione. </li><li> Quindi, rimuovere gli embrioni dall&#39;utero. incidere con cura l&#39;utero e rimuovere la membrana amniotica senza danneggiare gli embrioni utilizzando 2 pinze. Successivamente, decapitate ogni embrione con un paio di forbici e trasferire le teste in un secondo piatto 10 centimetri fornito con media preparazione. </li><li> Procede all&#39;elaborazione delle teste (simile al preparzione descritto nella 1,4-1,7). <ol><li> Immobilizzare la testa con un paio di pinze e incidere il cranio e pelle nella regione del collo vicino al hindbrain, perpendicolare al nevrasse. Utilizzare un secondo paio di pinze per sollevare sia cranio e pelle che ricopre, e piegare la calotta morbida verso la fine rostrale della testa, esponendo così il cervello. </li><li> Con l&#39;aiuto di 2 pinze, staccare il cervello dalla cavità cranica. Per fare questo, chiudi 1 paio di pinze e separare il cervello dal cranio a partire da bulbi olfattivi e lo spostamento verso il rombencefalo. Raccogliere il cervello in un altro 10 centimetri piatto pieno di media preparazione. </li></ol></li><li> Sezionare ippocampi dalle porzioni corteccia come descritto sopra per la preparazione astrociti (passo 1.6). Rimuovere il ippocampi da ciascun emisfero e raccoglierli nel tubo 2 ml riempita con il mezzo di preparazione. </li><li> Dopo aver completato la dissezione, trasferire il tubo al banco flusso laminare sterile e Digest il tessuto dell&#39;ippocampo con 1 soluzione di digestione mL contenente papaina. Preparare la soluzione di digestione come descritto nella fase 1,9-1,10, ma utilizzare MEM invece DMEM. NOTA: i passaggi 3,9-3,12 sono critici e dovrebbe essere completato entro 10 - 15 minuti. </li><li> Dopo il completamento della digestione, prelevare con attenzione la soluzione digestione delicata aspirazione con una pipetta. </li><li> Lavare il ippocampi 3 volte con mezzo neurone dalla sequenza aggiungendo e, successivamente, con attenzione aspirare 1 ml di coltura fresco di media per ogni ciclo di lavaggio. Non centrifugare la sospensione cellulare. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, triturare accuratamente il tessuto 1 medium neurone mL. </li><li> Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio e piastra 35.000 cellule in 500 microlitri di media neurone per un singolo pozzo di un 24-ben piastra (il piatto di cui al 3.2). NOTA: Facoltativamente, un&#39;aliquota cella può essere contrastate con trypan blu per valutare la vitalità della preparazione cellulare. Controllare la densità di placcatura da Visual ispezionareionico usando il microscopio (tipicamente 90 - 110 cellule per campo visivo di un obiettivo standard di 10X). </li><li> Inserire neuroni nel incubatore a 37 ° C, 6% v / v CO 2 per 1 h. </li><li> Invia le incubazione, prendere gli inserti preparati (seminato con monostrati confluenti astrociti) fuori dell&#39;incubatore (vedi punto 2.8). Sostituire il supporto aspirando medio astrociti e la sua sostituzione con 500 microlitri di media neurone fresco. NOTA: Gli inserti deve ospitare monostrati astrociti confluenti dopo 2 - 3 DIV (giorni in vitro). </li><li> Posizionare gli inserti con astrociti attenzione nei pozzetti che contengono le culture neuronali (punto 3.13) con pinza sterile. </li><li> Posizionare la risultante indiretta co-coltura di neuroni-astrociti di nuovo nel incubatore a 37 ° C, il 6% v / v di CO 2. NOTA: In queste condizioni, i neuroni possono essere coltivate per 4 settimane mezzo completamente definito. Nessun cambiamento mezzo è necessaria. Per le colture da lungo tempo, si consiglia di riempire epozzi mpty con acqua sterile per ridurre l&#39;evaporazione dal 24 a micropiastre. </li><li> Eseguire in vitro delle cellule analisi dopo periodi di coltura desiderata (ad esempio, per immunocitochimica, PCR, Western Blot, registrazioni elettrofisiologiche (patch clamp o matrice multielettrodico)) 7,15,18. NOTA: Il sistema di coltura è adatto anche per il trattamento farmacologico acuta e cronica delle culture 11. </li></ol>

<ol><li>Volterra, A., Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%2C+from+brain+glue+to+communication+elements%3A+the+revolution+continues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).</li>
<li>Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic-neuronal+crosstalk%3A+implications+for+neuroprotection+from+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury.</a> Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).</li>
<li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signaling+between+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic signaling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li>
<li>Dityatev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+formation+and+functions+of+chondroitin+sulfate-rich+extracellular+matrix+of+perineuronal+nets%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets.</a> Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).</li>
<li>Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+developmental+neurotoxicity%3A+use+of+microelectrode+arrays+to+measure+functional+changes+in+neuronal+network+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroeng%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny.</a> Front Neuroeng. 4, 1(2011).</li>
<li>Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+Oscillatory+Activity+in+Immature+Cortical+Network+Is+Driven+by+GABAergic+Preplate+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons.</a> J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).</li>
<li>Geissler, M., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+indirect+co-culture+set+up+of+mouse+hippocampal+neurons+and+cortical+astrocytes+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays.</a> J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).</li>
<li>Yu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+astroglial+TGFbeta-Smad3+signaling+pathways+differentially+regulate+dendrite+growth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Med%22%5BJournal%5D)">Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis.</a> Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).</li>
<li>Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+reactive+astrogliosis+and+its+effect+on+neuronal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth.</a> Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).</li>
<li>Kucukdereli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+excitatory+CNS+synaptogenesis+by+astrocyte-secreted+proteins+Hevin+and+SPARC%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC.</a> PNAS. 108, E440-E449 (2011).</li>
<li>Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+crucial+for+survival+and+maturation+of+embryonic+hippocampal+neurons+in+a+neuron-glia+cell-insert+coculture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay.</a> Synapse. 65, 41-53 (2011).</li>
<li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+synaptic+transmission%3A+astrocytes+rule%21%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basal synaptic transmission: astrocytes rule!</a> Cell. 146, 675-677 (2011).</li>
<li>Christopherson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+hippocampal+neurons%2C+which+lack+four+crucial+extracellular+matrix+molecules%2C+display+abnormalities+of+synaptic+structure+and+function+and+severe+deficits+in+perineuronal+net+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation.</a> J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).</li>
<li>Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-Glia+Interactions+in+Neural+Plasticity%3A+Contributions+of+Neural+Extracellular+Matrix+and+Perineuronal+Nets%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets.</a> Neural Plast. 2016, 5214961(2016).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Pyka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+astrocyte-dependent+synaptogenesis+and+modulate+synaptic+activity+in+primary+embryonic+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+astrocyte-secreted+matricellular+proteins+in+central+nervous+system+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function.</a> J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).</li>
<li>Ethell, I. M., Ethell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+in+brain+development+and+remodeling%3A+synaptic+functions+and+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets.</a> J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).</li>
<li>Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheocharidis%2C+U+%22Prog+Brain+Res%22">Prog Brain Res</a>. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).</li>
<li>Dityatev, A., Rusakov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signals+of+plasticity+at+the+tetrapartite+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse.</a> Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).</li>
<li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+synapses%3A+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22JoVe%22%5BJournal%5D)">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse.</a> JoVe. , (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;obiettivo principale del protocollo attuale è quello di colture neuronali e astrociti completamente separati, mentre li mantenendo in mezzo condiviso. Per questo motivo, la purezza delle colture ottenute vanno verificate all&#39;inizio del procedimento. Si consiglia l&#39;uso di tubulina specifica dei neuroni, neurofilamenti o proteine ​​NeuN come marcatori neuronali, GFAP come marcatore astrociti, O4 antigene come marcatore degli oligodendrociti precursore e proteine ​​Iba1 per identificare microglia. <p clas...

Nel corso degli ultimi decenni, l&#39;interpretazione generale della funzione nevroglia si è evoluta da l&#39;attribuzione di un solo supporto verso un ruolo regolatore attivo per quanto riguarda la funzione neuronale 1. A causa del loro impatto di rilievo sulla omeostasi del cervello in salute e malattia 2, astrociti sono di particolare interesse per la comunità scientifica. Negli ultimi anni, una diversità di studi si sono concentrati sulle interazioni neuroni-glia in vivo e in vitro 3. Tuttavia, la maggior parte dei sistemi di coltura non consentono per l&#39;analisi separata delle due tipi cellulari e dei rispettivi secretomes. Diversi approcci sfruttano la co-coltivazione diretta dei neuroni e glia per raggiungere la sopravvivenza di lunga durata e fisiologicamente rilevanti di sviluppo della rete neuronale 4-6. Il presente protocollo raggiunge gli stessi obiettivi, mantenendo entrambi i tipi di cellule separate fisicamente 7. Rispetto al conditioned media si avvicina a 8,9, il nostro sistema permette di studiare la comunicazione bidirezionale tra neuroni e astrociti. L&#39;espressione di molecole di segnalazione secrete può essere monitorato mentre le cellule maturare nel mezzo condiviso. Questa opportunità è particolarmente rilevante, come astrociti rilasciano fattori solubili, come le citochine, fattori di crescita e molecole della matrice extracellulare 10,11, regolando così la crescita neuronale e funzionano 7,12. Pertanto, è stato dimostrato che l&#39;aggiunta di trombospondina alle cellule gangliari retiniche in vitro induce la formazione di sinapsi 13. Tuttavia, sono necessari per rendere sinapsi funzionali 13 altri fattori ancora sconosciuti. Inoltre, molecole rilasciate dagli astrociti devono essere identificati al fine di comprendere la base delle interazioni neuroni-glia. La coltivazione di neuroni primari e astrociti di topo e ratto è stato descritto in precedenza 14-16. Qui noipresentare uno strumento elegante e versatile per combinare entrambi i tipi cellulari in un approccio co-coltura indiretta. Poiché le due culture sono fisicamente separati ancora condividere lo stesso mezzo, l&#39;impatto di neuroni, astrociti e molecole solubili, possono essere analizzate separatamente, creando così un potente strumento per studi di interazione neuroni-glia.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Acqua per colture cellulari</td><td>MilliQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytosine-&#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>ATTENZIONE: H317, H361</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)&nbsp;</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>ATTENZIONE: H317-334</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Serva</td><td>22700</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Biochrom AG</td><td>S9135</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2529</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Ovoalbumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7641</td><td>ATTENZIONE: H334</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>autoprodotto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well-plates</td><td>Thermoscientific/Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti (per la co-coltura indiretta)</td><td>BD Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Binocolo</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Heraeus</td><td>Multifuge 3S-R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Marienfeld</td><td>650010</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>FST Dumont</td> <td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprivetri (12&nbsp; mm)</td><td>Carl Roth (Menzel- Gl&auml; ser)</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 240i</td><td></td></tr><tr><td>Micro-provetta (2 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>Millex Unità filtrante a siringa</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri (10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>833.902</td><td></td></tr><tr><td>pipetta (1 mL)</td><td>Gilson</td><td>Pipetman 1000</td><td></td></tr><tr><td>Banco da lavoro sterile</td><td>The Baker Company</td><td>Flusso laminare SterilGARD III</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>FST Dumont</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Henry Schein</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Pallone T75</td><td>Sarstedt</td><td>833.911.002</td><td></td></tr><tr><td>provetta (15 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>64.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>GFL</td><td>Bagnomaria tipo 1004</td><td></td></tr></tbody></table>

la indiretto neuron-astrociti co-coltura saggio: an<em&gt; in vitro</em&gt; set-up per l&#39;indagine dettagliata delle interazioni neuroni-glia

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Corretto sviluppo e la funzione neuronale è il presupposto di sviluppo e il cervello adulto. Tuttavia, i meccanismi alla base della formazione altamente controllato e manutenzione di reti neuronali complesse sono state comprese finora. Le questioni aperte in materia di neuroni nella salute e nella malattia sono diversi e si estende da comprendere lo sviluppo di base per indagare le patologie legate umani, per esempio, il morbo di Alzheimer e la schizofrenia. L&#39;analisi più dettagliata dei neuroni può essere eseguita in vitro. Tuttavia, i neuroni sono esigenti cellule e hanno bisogno del sostegno supplementare degli astrociti per la loro sopravvivenza a lungo termine. Questa eterogeneità cellulare è in conflitto con l&#39;obiettivo di analizzare l&#39;analisi di neuroni e astrociti. Presentiamo qui un test di coltura cellulare che consente la co-coltivazione a lungo termine di neuroni primari puri e astrociti, che condividono lo stesso mezzo chimicamente definito, pur essendo fisicamenteseparato. In questa configurazione, le culture sopravvivono per un massimo di quattro settimane e il test è adatto per una varietà di indagini riguardanti l&#39;interazione neuroni-glia.

L&#39;analisi delle colture neuronali tramite il sistema di co-coltura indiretta è multiforme e può essere eseguita in diverse fasi della cultura stagionatura. A causa del fatto che le cellule possono essere mantenute fino a 4 settimane, indagini a lungo termine delle culture sono possibili. Lo schema del pannello centrale sinistro della figura 1 mostra la configurazione co-coltivazione. Con l&#39;uso di quest...

Questo protocollo descrive l&#39;indiretta co-coltura di neuroni-astrociti per l&#39;analisi compartimenti stagni delle interazioni neuroni-glia.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

L'obiettivo generale di questo saggio di cocoltura indiretta è studiare l'impatto degli astrociti sullo sviluppo dei neuroni. Il nostro laboratorio è interessato al ruolo delle interazioni neurone-glia. Si ritiene che gli astrociti contribuiscano alla formazione delle sinapsi, le strutture di collegamento del sistema nervoso centrale.Per studiare il loro ruolo, abbiamo progettato un modello in vitro in cui possiamo combinare astrociti primari e neuroni embrionali primari in compartimenti separati. I compartimenti sono collegati da una membrana permeabile, che consente l'analisi degli scambi tra i due tipi cellulari. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di monitorare la formazione delle sinapsi per periodi fino a quattro settimane.Inoltre, è possibile esaminare i ruoli individuali degli astrociti, da un lato, e dei neuroni, dall'altro, utilizzando questo saggio. E infine, possiamo anche analizzare in modo più dettagliato il secretoma dei nostri compartimenti cellulari, che contiene molecole responsabili dell'influenza reciproca tra i due compartimenti cellulari in quel sistema. Questo metodo può fornire informazioni sulle interazioni tra neuroni e astrociti.Inoltre, pu

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Questo articolo descrive un nuovo protocollo e reagenti impostare progettato per la misura sensibile degli effetti neurotossici di composti e trattamenti sulla co-culture di neuroni e astrociti utilizzando l'analisi ad alto contenuto. Risultati dimostrano che l'analisi ad alto contenuto rappresenta una tecnologia entusiasmante romanzo per la valutazione neurotossicità.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

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Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura

Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Questo video illustra un metodo per stabilire una co-coltura indiretta neurone-astrocita utilizzando un approccio compartimentato. In questa configurazione, i neuroni e gli astrociti sono spazialmente separati ma condividono un mezzo condizionato. I fattori neurotrofici rilasciati dagli astrociti promuovono la differenziazione dei neuroni e la formazione di connessioni sinaptiche, suggerendo interazioni neurone-glia.

Una tecnica di co-coltura indiretta neurone-astrocita per lo studio delle interazioni neurone-glia

Questo video dimostra la creazione di una co-coltura di neuroni indotti umani (iNs) e cellule precursori di oligodendrociti indotti (iOPC). Gli iN vengono mescolati con iOPC in una co-coltura e poi incubati per supportare la maturazione di entrambi gli iN in neuroni e degli iOPC in oligodendrociti. I neuroni formano connessioni sinaptiche con altri neuroni e oligodendrociti, mentre gli oligodendrociti sviluppano guaine mieliniche attorno agli assoni dei neuroni.

Un metodo di co-coltura per modellare le interazioni neurone-oligodendrocita

Questo video dimostra la creazione di una co-coltura neurone-astrocita per la registrazione dell'attività della rete neuronale. Dopo aver stabilito la co-coltura di motoneuroni e astrociti su una piastra multi-electrode array (MEA), l'attività elettrica ritmica sincrona della rete neuronale è stata registrata extracellulare utilizzando il MEA.

Registrazione dell'attività elettrofisiologica della rete neuronale in una co-coltura neurone-astrocitaria

Questo video dimostra la valutazione dell'attività elettrica neuronale in una co-coltura di neuroni glutammatergici corticali derivati da hiPSC e cellule di glioma utilizzando un dispositivo microfluidico con array multielettrodi.

Valutazione delle interazioni tra neuroni glutammatergici e cellule di glioma in una co-coltura

Comprendere il comportamento maligno del cancro richiede la creazione di modelli accurati di come le cellule tumorali interagiscono con i componenti del microambiente tumorale, come i macrofagi. Qui descriviamo due metodi per studiare l'interazione delle cellule di glioblastoma con i macrofagi e le microglia associati al tumore, dove viene valutato l'effetto sull'invasione del glioblastoma.

Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

In questo protocollo, ci proponiamo di descrivere un metodo riproducibile per combinare dissociato pluripotenti umane su cellule staminali neuroni e astrociti insieme in 3D sfera cocultures, mantenendo queste sfere in condizioni galleggiante libera e successivamente misurazione dell'attività sinaptica circuito delle sfere con immunoanalysis e registrazioni di matrice multielettrodo.

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, presentiamo un approccio semplice utilizzando specifici mezzi di coltura che permettono la creazione di colture arricchite di neuroni e astrociti, o colture neurone-glia dalla corteccia embrionale, con alto rendimento e riproducibilità.

Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

Questo protocollo descrive una co-coltura microglia-neuronale stabilita da cellule neuronali primarie isolate da embrioni di topo ai giorni embrionali 15-16 e microglia primaria generata dal cervello di topi neonatali nei giorni post-natali 1-2.

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Scopri il saggio di co-coltura indiretta neuroni-astrociti per studiare le interazioni neuroni-glia in vitro. Questo metodo consente di analizzare la formazione delle sinapsi e lo sviluppo neuronale in un sistema compartimentalizzato.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An

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